Bước đầu nghiên cứu xử lý đột biến thực nghiệm trên cây cẩm chướng bằng tia gamma

Bé Gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi --------------- š & › -------------- NguyÔn M¹nh hïng B­íc ®Çu nghiªn cøu xö lý ®ét biÕn thùc nghiÖm trªn c©y cÈm ch­íng b»ng tia gamma LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh: Trång trät M· sè: 60.62.01 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS. NguyÔn ThÞ Lý Anh Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước đây. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này ! Tác giả Nguyễn Mạnh Hùng LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ về mọi mặt của các thầy cô giáo, các tập thể và các cá nhân. Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Công nghệ sinh học, Viện Sinh học nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về mọi mặt trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Cao đẳng Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để thực hiện đề tài. Cũng qua đây cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới các tập thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tác giả Nguyễn Mạnh Hùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT: Công thức ĐC: Đối chứng FAO: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc IAEA: Cơ quan Năng lượng nguyên tử quốc tế K: Krad MS: Môi trường Murashige and Skoog NXB: Nhà xuất bản Số 4: Giống cẩm chướng trắng Số 6: Giống Cẩm chướng đỏ α NAA: α- Napthaleneaxetic axid DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1a. Ảnh hưởng của tia gamma đến sinh trưởng, phát triển chồi cẩm chướng in vitro giống đỏ (sau xử lý 4 tuần) 29 4.1b. Ảnh hưởng của tia gamma đến sinh trưởng, phát triển chồi cẩm chướng in vitro giống trắng (sau xử lý 4 tuần) 30 4.2a. Đặc điểm các dạng chồi giống Đỏ thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) 35 4.2b. Đặc điểm các dạng chồi giống Trắng thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) 37 4.3a. Sự sinh trưởng, phát triển của chồi giống đỏ sau xử lý ở lần cấy chuyển 2 (sau 4 tuần) 39 4.3b. Tỷ lệ các dạng chồi biến dị của giống đỏ sau lần cấy chuyển 2 40 4a. Sự sinh trưởng, phát triển của chồi giống Trắng sau xử lý ở lần cấy chuyển 2 (sau 4 tuần) 40 4b. Tỷ lệ các dạng chồi biến dị của giống đỏ sau lần cấy chuyển 2 41 4.5. Khả năng ra rễ của chồi cẩm chướng giống Đỏ (sau 3 tuần) 42 4.6. Khả năng ra rễ của chồi cẩm chướng giống Trắng (sau 3 tuần) 43 4.7. Khả năng thích ứng của các cây in vitro sau xử lý chiếu xạ ở vườn ươm giống cây cẩm chướng Đỏ (sau 3 tuần theo dõi). 44 4.8. Khả năng thích ứng của các cây in vitro sau xử lý chiếu xạ ở vườn ươm giống cây cẩm chướng Trắng (sau 3 tuần theo dõi). 45 4.9. Tỷ lệ sống và các giai đoạn sinh trưởng, phát triển 46 4.10. Động thái tăng trưởng chiều cao của các cây sau xử lý 48 4.11. Động thái ra lá của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma 50 4.12. Động thái ra nụ của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia Gamma 53 4.13. Động thái nở hoa của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma 54 4.14. Một số dạng biến dị ngoài đồng ruộng 56 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1. Chồi cẩm chướng Đỏ sau xử lý chiếu xạ tia gamma (sau 4 tuần nuôi cấy) 28 4.2. Ảnh hưởng của tia gamma đến chồi cẩm chướng in vi tro giống Đỏ 29 4.3. Chồi cẩm chướng Trắng sau xử lý chiếu xạ tia gamma (sau 4 tuần nuôi cấy) 30 4.4. Ảnh hưởng của tia gamma đến chồi cẩm chướng in vi tro giống trắng 31 4.5. Các dạng chồi thu được sau xử lý chiếu xạ 34 4.6. Tỷ lệ về các dạng chồi ở các liều xử lý của giống cẩm chướng Đỏ 36 4.7. Tỷ lệ về các dạng chồi ở các liều xử lý của giống cẩm chướng Trắng 38 4.8. Tỷ lệ chồi biến dị của giống cẩm chướng Đỏ 39 4.9. Tỷ lệ chồi biến dị của giống cẩm chướng Trắng 41 4.10. Động thái tăng trưởng chiều cao cây sau xử lý 49 4.11. Động thái ra lá của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma 50 4.12. Lá hình ống 51 4.13. Lá hình thoi 51 4.14. Động thái ra nụ của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma 53 4.15. Động thái nở hoa của các dòng cẩm chướng sau xử lý tia gamma 55 4.16. Ảnh hoa một số dạng đột biến thu được 57 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) là một trong các loại hoa cắt cành phổ biến cho năng suất và giá trị kinh tế cao. Hoa cẩm chướng ngày càng được nhiều người biết đến bởi sự đa dạng về màu sắc, là loại hoa bền, giữ được lâu, thuận lợi cho bảo quản và vận chuyển đi xa. Các giống cẩm chướng ở nước ta hiện nay chủ yếu là giống nhập từ Hà Lan hay Trung Quốc. Điều này gây khó khăn trong sự chủ động nguồn giống, chi phí lớn cho việc nhập khẩu dẫn tới giá thành hoa cắt cao. Mặt khác, để thích nghi với điều kiện Việt Nam, các giống nhập nội này yêu cầu quy trình trồng và chăm sóc nghiêm ngặt. Vì vậy một đòi hỏi thực tế là việc tạo ra những giống hoa cẩm chướng mới và cải tạo các giống đã nhập nội, đáp ứng nhu cầu thị trường, góp phần khẳng định thương hiệu hoa Việt Nam. Trong lĩnh vực chọn tạo giống, gây đột biến in vitro là một phương pháp có tính ứng dụng cao, trong đó chiếu xạ gây đột biến sinh học là kỹ thuật đã và đang mang lại những kết quả lạc quan trong thực tế sản xuất. Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ những năm 1960 và ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng cây trồng. Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy phương pháp này làm rút ngắn thời gian chọn tạo giống, có thể tạo ra những tính trạng quý chưa có ở giống gốc. Ở nước ta kỹ thuật chiếu xạ cũng đã sớm được ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. Theo báo cáo của Hội nghị thường niên Hiệp hội chọn giống Châu Á thì hiện nay nước ta có hơn 1 triệu ha giống cây trồng tạo ra nhờ kỹ thuật chiếu xạ, trong đó có 25 giống lúa, 2 giống ngô và nhiều loại cây trồng khác: đậu tương, lạc, táo, hoa, nấm, cây cảnh…Những giống cây này phần lớn đều có phẩm chất tốt như năng suất cao, khả năng chịu hạn, úng, chịu mặn tốt.[19] Theo xu hướng đó, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống hoa chiếu xạ là hướng đi có triển vọng. Trên đối tượng cây hoa cẩm chướng đã có nhiều công bố trên thế giới (Butiati, 1985; A.C.Cassells,1993;...), trong nước có tác giả Nguyễn Văn Vinh nghiên cứu sử dụng tia gamma gây đột biến kết hợp nhân giống in vitro, tuy nhiên vẫn chưa đi đến kết quả cuối cùng là tạo được giống hoa mới. Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xử lý đột biến thực nghiệm trên cây cẩm chướng bằng tia gamma” góp phần làm cơ sở cho chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới bằng xử lý đột biến phóng xạ. 1.2.Mục đích và yêu cầu của đề tài: 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý tia gamma in vitro đến sinh trưởng, phát triển của cây cẩm chướng thông qua đó xác định được khả năng tạo đột biến thực nghiệm bằng xử lý tia gamma cho cây cẩm chướng. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của các liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy. - Đánh giá được sinh trưởng và nhân nhanh của các chồi sau chiếu xạ qua các lần cấy chuyển khác nhau. - Đánh giá được khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau chiếu xạ. - Phân loại được các dạng biến dị trong điều kiện in vitro và điều kiện tự nhiên. 1.3. Giới hạn của đề tài - Nghiên cứu xử lý chiếu xạ tia gamma ở các mức sau 1Krad, 2Krad, 3Krad, 4Krad và 5Krad trong thời gian 1 giờ. - Các thí nghiệm ngoài vườn ươm được tiến hành trong điều kiện khí hậu vùng Đồng bằng sông Hồng. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của các liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro và đánh giá được sinh trưởng và nhân nhanh của các chồi sau chiếu xạ qua các lần cấy chuyển khác nhau. Từ đó xác định được liều lượng chiếu xạ gamma thích hợp để xử lý đột biến tạo tiền đề cho công tác chọn tạo giống cây cẩm chướng bằng phương pháp xử lý đột biến phóng xạ. - Các kết quả nghiên cứu của đề tài chính là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu tạo dòng đột biến, nguồn nguyên liệu cho việc chọn tạo giống cẩm chướng mới. Đồng thời các kết quả cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. 1. Giới thiệu chung về hoa cẩm chướng 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây cẩm chướng có nguồn gốc ở Địa Trung Hải, được bắt đầu nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ 16. Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Đến 1846, họ đã nuôi trồng được rất nhiều giống cẩm chưóng hoang dại và điều khiển chúng ra hoa quanh năm. Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu được nhập vào nước Mỹ. Tại đây rất nhiều công ty đã tạo ra hàng trăm giống cẩm chướng với các hình dạng và màu sắc khác nhau, trong đó các giống North, Maine và Wiliam Sim trở thành những giống hàng đầu. Từ các giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau, có hoa màu trắng, màu hồng, màu da cam, đốm màu,…Trong đó, các giống thuộc dòng Sim nổi tiếng nhất và được trồng khắp nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ 19, chủ yếu ở những nơi có khí hậu mát mẻ như SaPa, Đà Lạt. Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước [2]. 2.1.2. Vị trí phân loại Cây cẩm chướng, hay còn gọi là hoa Phăng, có tên khoa học là Dianthus caryophyllus L., thuộc lớp hai lá mầm (Dicotylendonea), bộ phôi cong (Sentrospemea), họ Cẩm chướng (Cariophyllaceae) [5]. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Rễ Cẩm chướng có bộ rễ chùm, có rất nhiều nhánh phát triển mạnh để hút nước, dinh dưỡng. Chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm. Ở trạng thái bình thường rễ và tán cây theo tỷ lệ tương đương. Nếu đất quá nhiều phân, nhiều nước rễ sẽ sinh trưởng không tốt. Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của rễ. Thân Thân thảo, nhỏ, mảnh mai. Thân rất dễ gãy ở đốt. Các đốt cẩm chướng thường gãy khúc. Cẩm chướng thường có thân màu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh. Phấn có tác dụng quan trọng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi bị sâu bệnh hại. Ở Việt Nam hiện trồng hai loại cẩm chướng: các giống cẩm chướng thấp cây (30 - 50 cm) và các giống cẩm chướng cao cây (50 - 80 cm). Giống cẩm chướng thấp cây thường mọc thành bụi, các đốt thân dài 2 - 4 cm. Loại cẩm chướng cao cây đốt dài 4 - 8 cm. Mỗi đốt có một mắt. Trên mắt mang lá và mầm nách. Lá Lá kép mọc từ các đốt thân, lá mọc đối. Phiến lá dày hình lưỡi mác, mép lá trơn. Mặt lá nhẵn không có độ bóng. Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn có tác dụng làm giảm sự thoát hơi nước. Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4 - 5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7 - 10 ngày ra một đôi lá. Hoa Có 2 dạng: hoa chùm và hoa đơn. Hoa đơn mọc đơn từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cành. Hoa nằm ở đầu cành, hoa có nhiều màu sắc. Hoa cẩm chướng đẹp tự nhiên, hoa có mùi thơm thoang thoảng. Nụ hoa có đường kính khoảng 2 - 2,5cm. Hoa khi nở hoàn toàn có đường kính khoảng 6 - 8cm, chiều cao bông hoa 4 - 7,5cm (từ đốt trên cùng của cành đến đỉnh bông). Hạt Hạt nhỏ, nằm trong quả. Mỗi quả thường có từ 300 - 600 hạt. 2.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ưa khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 200C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng hoa tương đối tốt. Nếu vượt quá 300C thì cây sinh trưởng kém, thân lá nhỏ, hoa nhỏ, sản lượng và chất lượng hoa giảm, tuổi thọ hoa ngắn; dưới 100C cây sinh trưởng yếu, sản lượng giảm rõ rệt. Chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa. Nhìn chung chênh lệch nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, mức chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm quá cao hoặc quá thấp sẽ làm chất lượng hoa kém, số hoa mù cao. Ánh sáng: Cẩm chướng là loại cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hoá hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt. Ánh sáng thích hợp từ 1500 - 3000 Lux. Ánh sáng tối thích 2000 - 2500 Lux. Trong quá trình phát triển, nếu cường độ ánh sáng cao (> 3000 lux) cây sẽ ra hoa sớm, nếu cường độ ánh sáng thấp (< 1000 lux) quá trình ra hoa sẽ muộn. Ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ ánh sáng mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạt mầu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Ẩm độ: Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm khoảng 70 - 80%, trong cành 68 - 70%, trong rễ 80%. Nước có vai trò vô cùng quan trọng đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng. Ẩm độ thích hợp 60 - 70%, ẩm độ tối thích 70%. Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút chất dinh dưỡng và muối khoáng một cách thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao Đất: Khoảng 70% số rễ của cẩm chướng tập trung ở tầng đất mặt (0 - 20 cm), yêu cầu đất có kết cấu tơi xốp. Độ pH thích hợp với cây cẩm chướng là từ 6,0 - 6,5. Đối với đất liên tục trồng cẩm chướng thì phải khử trùng, tiêu độc hoặc luân canh vì đất có nhiều vi sinh vật gây bệnh. Độ pH: Cẩm chướng thích hợp với độ chua đất từ 5,5 - 6,5. Chất dinh dưỡng: Mức độ dinh dưỡng lý tưởng nhất trong lá cẩm chướng là: Đạm 3 - 3,5%; Lân 0,2 - 0,3%; Kali 3 - 4%; Canxi 1 - 2%; Magie 0,2 - 0,5%. Để đạt được năng suất hoa cao, chất lượng tốt, cần phải đảm bảo thành phần và hàm lượng dinh dưỡng trong đất ở mức độ thích hợp nhất. Điều kiện trồng trọt khác nhau thì hiệu suất hấp thu dinh dưỡng của cẩm chướng cũng khác nhau. Thông thường 1m2 đất trồng trong một năm cây cẩm chướng sẽ hấp thu một lượng đạm 3 - 5g, lân 2 - 3g, kali 7 - 12g. Khi tính toán lượng phân bón, nếu sử dụng phân hữu cơ là chính thì lượng phân đạm bón gấp 4 - 6 lần, lượng kali gấp 1,5 lần [3]. 2.1.5. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất hoa cẩm chướng 2.1.5.1. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới. Với những ưu điểm: sản lượng cao, đẹp mắt, dễ vận chuyển, dễ bảo quả…, nên cẩm chướng đã trở thành một loại hoa cắt cành được trồng trên thế giới, chiếm khoảng 17% tổng sản lượng hoa cắt.[9] Hoa cẩm chướng với những ưu điểm : màu sắc đa dạng, hương thơm thoang thoảng, hấp dẫn, dễ vận chuyển, bảo quản… đã trở thành một trong các loại hoa cắt cành chủ yếu trên thế giới. Cánh hoa có những đặc trưng riêng như đầu cánh dạng răng cưa, cánh hoa có nhiều nếp gấp. Hoa có thể có một màu hoặc nhiều màu. Hoa có thể trồng chậu làm hoa cảnh hoặc làm hoa cắt tuỳ theo yêu cầu của người sử dụng. Cẩm chướng là loại hoa chủ lực phối hợp với hoa lay ơn, hoa baby làm thành lẵng hoa, bó hoa, vòng hoa, hoa cài, các tác phẩm nghệ thuật trong các ngày lễ, ngày tết, sinh nhật… Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ. Các nước trồng nhiều hoa đều trồng hoa cẩm chướng. Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng nhiều nhất, năm 1995 sản lượng hoa cắt nước này đạt 2.500 triệu cành. Ở Hà Lan, tuy diện tích trồng hoa cẩm chướng không bằng diện tích trồng hoa Tuylip nhưng sản lượng cũng đạt trên 1.800 cành/năm, đứng thứ 2 trên thế giới và có xuất khẩu sang Châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản. Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm nước này sản xuất được khoảng 400 triệu cành, đứng thứ 3 trên thế giới. Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất trên thế giới và được coi là thiên đường của hoa cẩm chướng. Cẩm chướng chiếm 40% tổng lượng hoa xuất khẩu của nước này. Với điều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây cẩm chướng đã phát triển trên 25 năm, năm 1986 đã có diện tích gần 1000 ha cẩm chướng được trồng trong nhà che plastic [27]. Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya. Diện tích trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở Ritf Valley. Cây cẩm chướng cảnh được trồng ngoài đồng không bảo vệ ở độ cao khoảng 1800m và cẩm chướng thường được trồng trong nhà plastic ở độ cao 2700m so với mực nước biển [19]. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi từ năm 1925, hiện nay diện tích hoa cẩm chướng chiếm tỷ lệ 21%, đứng thứ 2 sau hoa hồng (24%) [16]. Ở châu Á, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, Srilanka,… Ở Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ biến nhất. Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh. Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn Minh và Thượng Hải .Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao, thống kê tháng 11 năm 2006 đạt 10.4 triệu USD với sản lượng 4.3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong 3 loại hoa xuất khẩu chủ lực. Tại Malaysia, sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ 3 sau cây hoa hồng và hoa cúc, chiếm 9,02% tổng sản lượng hoa. Ở đây, hoa cẩm chướng được trồng bao gồm cả loại hoa chùm và hoa đơn. Ngược lại, ở Philippin, cây cẩm chướng trồng được rất ít và phải nhập khẩu từ các nước khác. Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng đứng thứ hai trong tổng giá trị nhập khẩu hoa với 22,05% chỉ đứng sau hoa cúc (36,98%). Năm 1996, lượng hoa cẩm chướng nhập khẩu của Philippin từ Hà Lan 7691 kg (khoảng 620000 cành), từ Malaysia 5097kg (khoảng 260000 cành), từ Australia 638 kg (khoảng 32000 cành) và New Zealand 80 kg (khoảng 4000 cành) [29]. Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn đới quan trọng nhất. Hoa cẩm chướng được trồng chủ yếu để xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thu được ở nội địa. Hai giống cẩm chướng châu Mỹ và cẩm chướng Địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới. Một phần diện tích cẩm chướng khá lớn được trồng trong môi trường bảo vệ hoàn toàn [21]. Ixraen có 150 ha hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu đạt 119 triệu USD. 2.1.5.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam. Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh. Trước đây hoa cẩm chướng trên thị trường chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan, nhưng vài năm trở lại đây, cẩm chướng trồng từ Đà Lạt, Lào Cai đang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước. Trong khoảng thời gian từ 23/1- 09/02/2007, kim ngạch xuất khẩu hoa của nước ta đạt 243.5 nghìn USD. Đây là khoảng thời gian xuất khẩu hoa của nước ta tăng mạnh vào nhiều thị trường Châu Á. Các sản phẩm hoa cắt xuất khẩu chủ yếu là hoa cúc, cẩm chướng, hoa hồng, hoa lan…trong đó xuất khẩu cẩm chướng đạt 55.144 USD. Tổng cục Hải quan cho biết, cuối tháng 6/2007, DaLat Hasfarrm là công ty dẫn đầu các doanh nghiệp xuất khẩu hoa cây cảnh cả nước, chiếm 99% tổng kim ngạch xuất khẩu. 4 loại hoa chủ lực của công ty là: cúc, cẩm chướng, hồng và kỳ lân, xuất khẩu sang các thị trường khác nhau. Trong đó sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ 2 sau hoa cúc, với đơn giá xuất khẩu trung bình 0,19 USD/cái. Cùng với hoa cúc và hoa hồng, cẩm chướng là một trong 3 chủng loại hoa xuất khẩu chính vào Nhật Bản - thị trường xuất khẩu hoa lớn nhất của nước ta đầu năm 2007. Trồng hoa cẩm chướng sau 3 - 4 tháng đã bắt đầu cho thu hoạch. Một sào Bắc Bộ trong một vụ cho thu từ 96000 - 120000 bông. Như vậy thâm canh đúng kỹ thuật thì mỗi vụ phần lãi thu được là 17 - 30 triệu đồng/sào [2]. Có thể nói, cẩm chướng là loại hoa có triển vọng sản xuất cũng như không thể thiếu trong danh mục các loại hoa cắt cành xuất khẩu ở nước ta. Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn, và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung. 2.2. Đột biến và phương pháp gây đột biến bằng phóng xạ trong công tác chọn tạo giống cây trồng 2.2.1. Đột biến 2.2.1.1. Khái niệm, phân loại đột biến Đột biến (mutation) là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật. Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy. Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống. Có những đột biến lặn, nhưng cũng có những đột biến trội. Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành[10]. Căn cứ vào tính chất biến đổi cấu trúc di truyền mà người ta chia đột biến thành 2 dạng cơ bản: đột biến gen và đột biến NST Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc của gen liên quan đến một hoặc vài cặp nucleotide xảy ra ở một điểm nào đó trong phân tử ADN. Thường gặp dạng mất, thêm, thay thế, hoặc đảo vị trí một cặp nucleotide [15]. Đột biến NST là những biến đổi về cấu trúc NST (mất đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn) hoặc số lượng NST (thể nhị bội, thể đa bội). Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật. Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới [12]. Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên): đột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác động của tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học,…) có trong môi trường sống, và do những biến loạn về trao đổi chất trong tế bào. Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…), các tác nhân hoá học (các chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid,...) Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến rất thấp (khoảng 10-6)[3]và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn. Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát Vì vậy, việc nghiên cứu đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, mhằm tăng tần xuất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng. Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới. 2.2.1.2. Đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã, đang được quan tâm phát triển. Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6-10 thế hệ. Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm) chỉ cần 3-6 thế hệ. Đồng thời sử dụng phương pháp đột biến có thể giải quyết những vấn đề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện: Khi biến dị tự nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền. Khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được. Khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai. Khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của giống [14]. Với phương pháp đột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hoá gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể. Do các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người đã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học như colchicine, EMS,...trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được các thành tựu đáng kể. Kết quả của nhiều nước thu được chứng tỏ đây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để tạo ra giống mới. Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm. 2.2.1.3. Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro Khi sử dụng các phương pháp cải tạo giống truyền thống như kết hợp phương pháp lai, sinh sản sinh dưỡng với phương pháp gây đột biến, các nhà sản xuất đã tạo ra hàng loạt giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu của xã hội. Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế như thời gian tác động không lâu (khoảng 10 năm), cây bị tác động mạnh về sinh lý, sinh hoá, nhu cầu về giống tốt rất lớn trong khi số lượng cung cấp lại hạn chế. Với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật hiện nay, việc kết hợp xử lý đột biến nhân tạo và nuôi cấy mô trở thành một trong những hướng tạo giống cây trồng quan trọng. Vật liệu xử lý có thể là các cơ quan đang trong giai đoạn phát triển mạnh: đỉnh chồi, callus...Tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý hay hoá học. Xử lý đột biến chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mong muốn, tạo nguồn vật liệu phong phú cho chọn giống và lai tạo giống. Đồng thời kỹ thuật này có thể giải quyết vấn đề khó khăn: thể khảm sau xử lý chiếu xạ. Broetjes và cộng sự 1976 đã đưa ra giả thuyết rằng tái sinh in vitro có thể loại bỏ thể khảm. Vì vậy kỹ thuật này càng có ý nghĩa hơn đối với cây nhân giống vô tính, nhờ tiềm năng nhân nhanh trong thời gian ngắn, rút ngắn chu trình chọn lọc đột biến.Tài liệu Xử lý đột biến in vitro sẽ giảm tác động không tốt của các tác nhân gây đột biến tới môi trường, con người và động vật. 2.2.2. Đột biến phóng xạ 2.2.2.1. Tác nhân phóng xạ gây đột biến Nhờ sự phát hiện mới trong vật lý nguyên tử đã mở rộng phạm vi nghiên cứu, ứng dụng phóng xạ trong tạo giống cây trồng. Có 2 dạng phóng xạ là phóng xạ hạt và phóng xạ điện từ. Phóng xạ hạt là dòng chuyển động của những hạt cơ bản: nơtron, proton,... Phóng xạ điện từ là các sóng điện từ như tia gamma, tia X... Tia gamma và tia X là 2 dạng tia được sử dụng như nguồn chiếu xạ cơ bản trong các thực nghiệm, phổ biến nhất là tia gamma với nguồn Co60 và Cs137. Do có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn. Cơ chế gây đột biến của tác nhân bức xạ: Theo lý thuyết của A.M.Kuzin cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến gồm 3 giai đoạn chính: Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức dưới phân tử và phân tử. Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, ở giai đoạn này diễn ra các phản ứng tương tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học, tạo ra các peoxit hữu cơ đồng thời diễn ra các phản ứng oxi hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới và các gốc độc tính. Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống. Tức là các biến đổi hoá học gây nên do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào. Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như thế gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp ADN và tổng hợp protein trong tế bào sống đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc ADN, làm phát sinh đột biến di truyền [12]. Tia gamma không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp. Nó có khả năng biến các nguyên tử phân tử thành những phân tử mang điện tích và tạo nên sự ion hoá. Nhờ sự ion hoá mà trong tế bào xảy ra những biến đổi về mặt hoá học vật liệu di truyền và những chất khác khi hấp thụ năng lượng bức xạ. Kết quả quá trình này dẫn tới những biến đổi trong phân tử DNA, gây ra đột biến điểm, đôi khi gây ra sự gẫy đứt tạo nên đột biến cấu trúc NST. Quá trình phát sinh đột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Đặc tính lý học của loại tia phóng xạ - Liều lượng, cường độ phóng xạ - Sự phục hồi các biến dị tiềm năng - Các yếu tố khác: dưỡng khí, nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý. 2.2.2.2. Những nghiên cứu chọn giống bằng đột biến phóng xạ 2.2.2.2.1. Trên thế giới Các nghiên cứu về phóng xạ được bắt đầu từ 1925 với việc phát hiện ra hiệu quả gây đột biến của tia Rơnghen đối với cơ thể sống. Đối với cây trồng, phương pháp này đã tạo nên hàng loạt các biến dị di truyền trong thời gian tương đối ngắn. Sử dụng bức xạ đã trở thành phương tiện của các nhà chọn giống. Trên thế giới nhiều quốc gia đã thành lập những trung tâm phóng xạ để phục vụ công tác tạo giống. Thống kê của FAO/IAEA đến năm 2009 đã có 3100 giống cây trồng tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm trong đó chiếu xạ chiếm 88,8%, các tác nhân hoá chất chiếm 9,5%, tác nhân khác là 1,7% [9]. Thành công của phương pháp chọn giống phóng xạ đã đạt được ở rất nhiều đối tượng cây trồng: cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh, cây rau...Những đặc tính được cải tiến sau khi gây đột biến như rút ngắn chiều cao, chín sớm; tăng cường chống chịu sâu bệnh, thích ứng với điều kiện bất lợi của môi trường; đa dạng màu sắc và kiểu hình ở hoa và cây cảnh. Cùng với những phương pháp chọn tạo giống khác, xử lý đột biến phóng xạ đã trở thành công cụ hữu hiệu trong tạo giống cây trồng. Năm 1967, Swaminathan (Ấn Độ) đã dùng tia gamma và tia tử ngoại chiếu lên hạt giống lúa mỳ Mehico Suora 64 đã tạo ra giống đột biến Sarbati có hàm lượng protein cao hơn giống gốc 2,3%. Ở viện nghiên cứu Crasnoda của Nga năm 1976 đã xử lý tia laze lên hạt lúa mì tạo được giống đột biến Ljubov có hàm lượng protein tăng và năng suất tăng 15% so với giống gốc. Kutefa (Trung Quốc) năm 1989 xử lý tia Rơnghen liều 9,3 Krad lên hạt nảy mầm giống lúa Wuxian 20 và chọn tạo được giống mới tăng năng suất so với giống gốc 30%. Cũng xử lý lên hạt nảy mầm giống LungJing ở 2 liều 1K và 2K tác giả đã thu được dạng đột biến thấp cây hơn giống gốc 30cm và cho năng suất vượt giống gốc 2,3 tấ._.n/ha. Tại hội nghị di truyền quốc tế (1993) Sidorova và Morgun đã công bố việc tạo thành công 2 giống lúa mì mùa đông thông qua biến dị tái sinh từ callus và chiếu xạ tia gamma lên hạt [13]. Trong các cây công nghiệp thì cây họ đậu là đối tượng quan trọng có nhiều nghiên cứu thành công với kỹ thuật chọn giống phóng xạ. Năm 1965, Tedoradze XG đã sử dụng tia gamma liều 17K xử lý hạt đậu tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu được giống đậu tương chín sơm, chống chịu bệnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha. Ở Ấn Độ tác giả Kerketta V., Haque M.F. bằng xử lý phóng xạ lên hạt giống đậu tương Birsa 1 có vỏ hạt màu đen đã thu được những dòng đột biến có vỏ hạt màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống gốc [22]. Tạo được giống đậu đỗ chống bệnh cũng là một thành công của phương pháp chiếu xạ. Tác giả Laseejan S., xử lý tia gamma liều 15-30K lên hạt 11 giống và chọn lọc qua các thế hệ thu được 16 dòng cho sản lượng hạt cao và chống bệnh gỉ sắt. Sonnino A. khi xử lý phóng xạ lên chồi cây khoai tây đã thu nhận được các đột biến cây lùn, thay đổi màu sắc củ và vỏ củ. Trên đối tượng hoa, cây cảnh cũng thu được nhiều thành công từ chọn giống chiếu xạ. Trong những năm từ 1987-1989, các nhà chọn giống Ấn Độ đã tạo được 37 dạng đột biến ở hoa cúc, 14 dạng đột biến hoa hồng khác nhau về kích thước, màu sắc hoa. Năm 2000, các tác giả Thái Lan đã tiến hành chiếu xạ cụm chồi hoa cúc bằng tia gamma ở các liều chiếu xạ là 10, 30, 50, 70, 90, 110 Gy. Kết quả thu được cho thấy liều chiếu xạ 10 Gy cho tỷ lệ sống cao nhất. Sau chiếu xạ đã tạo ra các cây cúc cho hoa có màu sắc kích thước và số lượng cánh hoa khác nhau trên cùng một bông hoa. Tác giả Xiao-Shan Shen, Jue - Zhen Wan, Wei- Yi Luo và CS (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến chồi đồng tiền trong các môi trường nuôi cấy M1, M2, M3 (là các môi trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi, môi trường tạo rễ) trong in vitro. Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều chiếu xạ gây chết callus đồng tiền là từ 8 - 9K và liều chiếu xạ có hiệu quả gây đột biến là 5 - 6K. Trên cây hoa cẩm chướng: Năm 1985, Buiati và các cộng sự đã sử dụng tia X ở liều 2500 rad và 5000 rad, chiếu vào đỉnh sinh trưởng và chồi ra rễ gây ra biến dị màu sắc ở hoa cẩm chướng Địa Trung Hải (giống Corrida). Năm 1962, các tác giả người Mỹ đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống UconnWhite Sim No.1 và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về cấu trúc hoa. Năm 1972, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Sim Feu Follet và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về màu sắc hoa. Năm 1982, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Maiella-lonchabi, Galatee-lonvego và đã thu được các dòng cẩm chướng có khả năng kháng lại nấm Fusarium. Năm 1983, các tác giả người Thái Lan đã sử dụng tia gamma để tạo được giống hoa cẩm chướng Chaichoompon có mầu sắc khác lạ. Cũng trong năm này, các tác giả người Nhật đã tạo được giống hoa cẩm chướng Scarlet Bell đột biến về mầu sắc nhờ tia gamma. Năm 1985, các tác giả người Đức đã thu được các giống cẩm chướng lùn khi xử lý tia gamma trên giống Bonitas. Cùng năm này các tác giả Hà Lan đã thu được 6 giống hoa cẩm chướng có màu sắc mới bằng xử lý tia X. Năm 1993 A.C.Cassells, C.Walsh và C.Periappuram đã nghiên cứu tạo đột biến trên cây cẩm chướng bằng cách sử dụng tia X. Vật liệu xử lý là các đoạn thân có mang mắt ngủ của giống Mystere. Kết quả thu được các cây cẩm chướng có sự đa dạng về màu sắc hoa, kiểu dáng lá. Tỷ lệ cây tạo biến dạng là 2%. Phân tích về kiểu gen cho thấy có sự sai khác so với cây trước khi tạo đột biến. Năm 1996, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm thực vật thuộc công ty Kirin Brewery, Nhật Bản đã thu được giống cẩm chướng Mrs. Elegant thay đổi về kích thước hoa khi sử dụng tia gamma làm tác nhân gây đột biến. Năm 2004 họ cũng thu nhận được 2 giống cẩm chướng có hình thái và màu sắc hoa mới nhờ xử lý tia X. Theo dữ liệu của Cơ quan Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA), đến nay đã có tới 256 giống hoa cúc và 26 giống cẩm chướng tạo ra nhờ phương pháp xử lý đột biến phóng xạ và hoá chất. 2.2.2.2.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam các nhà khoa học đã ứng dụng nhanh chóng các phương pháp chọn giống đột biến vào công tác chọn giống cây trồng và đạt nhiều thành quả to lớn, góp phần nâng cao năng suất chất lượng cây lương thực, thực phẩm. Trong công tác chọn tạo giống lúa nước ta có nhiều kết quả đáng tự hào. Từ 1989 đến năm 2000, Viện Di truyền Nông nghiệp đã công bố 6 giống lúa quốc gia, trong đó giống DT10 được tạo ra nhờ xử lý tia gamma liều 20K lên hạt khô của giống C4-63. Cũng từ xử lý tia gamma liều 20K lên hạt khô của con lai F1 giữa giống TB1 và IR22, Viện Kỹ thuật Nông nghiệp tỉnh Thái Bình đã chọn lọc được M147 có P1000 hạt là 40g [11]. Năm 1992, Phạm Văn Ro bằng phương pháp phóng xạ đối với một số giống lúa như Tài nguyên đục, Tép hành đã chọn tạo được các giống có thời gian sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với giống gốc. Năm 1994, Nguyễn Minh Công và Đào Xuân Tân tạo được 2 dòng đột biến từ nếp Quýt Bắc Ninh có hàm lượng protein cao hơn hẳn giống gốc bằng xử lý tia gamma lên hạt nảy mầm [1]. Nghiên cứu mới đây của Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản “Hiệu ứng chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) lên hạt lúa và những biến đổi di truyền trong M1 và M2” đã rút ra kết luận: xử lý chiếu xạ tia gamma lên hạt lúa ướt (ngâm nước sau 20h) với 3 liều lượng 15K, 20K và 25K đã tạo ra hiệu ứng đột biến cao. Từ đó tạo nguồn vật liệu khởi đầu rất đa dạng và phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa [8]. Chiếu xạ tia gamma liều 18K lên hạt giống đậu tương AK-04 có hạt màu xanh, tác giả Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài và CS đã tạo chọn được dòng DT95 có khả năng sinh trưởng khoẻ và cho năng suất cao, có trường hợp tới 200% so với giống đối chứng [17]. Trên cây lạc, tác giả Lê Song Dự khi chiếu liều 5K lên giống Bạch sa đã tạo ra giống mới B5000 có năng suất cao hơn giống gốc 20-30%, hàm lượng protein đạt 21.48%, dầu 52.5% [4]. Nước ta hiện nay có 44 giống cây trồng tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến vật lý và hoá học. Phần lớn các giống cây này tập trung trên đối tượng cây lương thực, cây công nghiệp...trên cây hoa vẫn còn hạn chế. Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro. Năm 2005, Đào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện DTNN đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều lượng 1, 3, 5, 7 và 15K nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu. Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là 5K và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa có chóp cánh màu xanh [6]. Năm 2007, Viện Sinh học Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12K và liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỷ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 6K. Xử lý chiếu xạ trên cây hoa cẩm chướng ở nước ta đã có nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Vinh và CS, tuy nhiên chưa có công bố tạo ra giống hoa mới. Chúng tôi tiến hành đề tài “Bước đầu nghiên cứu xử lý đột biến thực nghiệm trên cây cẩm chướng bằng tia gamma” nhằm làm cơ sở cho tạo giống hoa cẩm chướng mới bằng xử lý phóng xạ, góp phần phát triển hướng tạo đột biến thực nghiệm bằng chiếu xạ trong công tác chọn tạo giống cây trồng ở nước ta. 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Các thí nghiệm tiến hành trên hai giống Cẩm chướng hiện có ở Việt Nam là cẩm chướng trắng (White Tundra) và cẩm chướng đỏ (Nelson) có nguồn gốc từ Công ty Dalat Hasfarm. - Vật liệu nghiên cứu: Đỉnh đoạn thân mang mắt ngủ cây cẩm chướng in vitro. 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống, sinh trưởng và biến dị của mẫu cấy. 2. Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và biến dị của các chồi sau chiếu xạ qua cấy chuyển lần 2. 3. Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau chiếu xạ. 4. Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển trong điều kiện tự nhiên của cây cẩm chướng in vitro sau chiếu xạ. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của mẫu cấy. LiÒu chiÕu x¹ Giống Cẩm chướng trắng Cẩm chướng đỏ Đ/C (Không chiếu xạ) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6 Vật liệu thí nghiệm lấy từ các cây in vitro khỏe. Các mẫu được cấy trên môi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Mẫu thí nghiệm là các đỉnh đoạn thân mang mắt ngủ được cắt thành từng đoạn nhỏ dài 0,5 - 1cm được cấy trên môi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa, trong các đĩa peptri với số lượng 60mẫu/đĩa. Sau đó được đem đi chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60). Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và biến dị của các chồi sau chiếu xạ cấy chuyển lần 2. LiÒu chiÕu x¹ LÇn cÊy chuyÓn 2 Gièng tr¾ng Gièng ®á §/C (Kh«ng chiÕu x¹) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6 Các chồi sau chiếu xạ ở thí nghiệm 1 được tiếp tục nuôi cấy trên môi môi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Chu kỳ cấy chuyển 4 tuần/lần. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi biến dị sau chiếu xạ. LiÒu chiÕu x¹ Giống Cẩm chướng trắng Cẩm chướng đỏ Đ/C (Không chiếu xạ) CT1 CT1 1Krad CT2 CT2 2Krad CT3 CT3 3Krad CT4 CT4 4Krad CT5 CT5 5Krad CT6 CT6 Mẫu cấy là các chồi sau lần cấy chuyển ở thí nghiệm 2. Các mẫu được cấy trên môi trường ra rễ là MS + 0,5mg/l NAA + 0,5 gam than hoạt tính. * Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được cấy 60 mẫu chia làm 3 lần nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ một tuần một lần. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển trong điều kiện tự nhiên của cây cẩm chướng in vitro sau chiếu xạ. Các cây in vitro thu được ở thí nghiệm 3 được đưa ra vườn ươm để thích nghi với điều kiện tự nhiên bằng kỹ thuật thuỷ canh. Sau 4 tuần đưa ra trồng ở ruộng sản xuất. CT1: Đ/C (Không chiếu xạ) CT2: 1Krad CT3: 2Krad CT4: 3Krad CT5: 4Krad CT6: 5Krad Thí nghiệm bố trí tuần tự không nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi: 2 tuần/lần. Tại vườn ươm theo kỹ thuật thuỷ canh của Trung tâm nghiên cứu phát triển rau Châu Á (AVRDC). Tại vườn trồng theo quy trình của Viện Rau quả - Hà Nội 3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các thí nghiệm in vitro được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành. Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962 với 6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol). Môi trường nhân nhanh là: MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Môi trường ra rễ tạo cây là: MS + 0,5mg/l NAA + 0,5 gam than hoạt tính. Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây mẫu được nuôi cấy trong trụ miệng hẹp 250ml. Tất cả các môi trường muôi cấy được điều chỉnh độ pH bằng 6,0 trước khi tiệt trùng và được khử trùng ở 1200C trong 20 phút. - Điều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định: + Cường độ ánh sáng: 2000 Lux + Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối + Độ ẩm: 70 - 80% + Nhiệt độ: 20 - 220C 3.3.2.2. Phương pháp chiếu xạ tia gamma - Vật liệu là chồi in vitro cây cẩm chướng được cắt bỏ lá, đoạn thân được cắt thành các mẫu có kích thước khoảng 0,5 - 1cm, lựa chọn mẫu đồng đều nhau các đoạn thân mang mắt ngủ cẩm chướng in vitro. Mẫu được cấy trên môi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa trong đĩa petri với số lượng 60 mẫu/đĩa. - Mẫu được chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) ở các liều 0, 1, 2, 3, 4, 5, Krad trong thời gian 1h. - Quá trình chiếu xạ tiến hành tại Bệnh Viện K - Hà Nội. - Các mẫu sau chiếu xạ được cấy trên môi trường nhân nhanh tốt nhất đã tìm được MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa để duy trì khả năng sống, tái sinh và đánh giá ảnh hưởng của các liều chiếu xạ. 3.3.2.3. Kỹ thuật trồng trọt Các thí nghiệm đưa cây in vitro ra ngoài vườn ươm được tiến hành như sau: Khi cây đạt tiêu chuẩn (cây cao trên 3,5 cm, có từ 4 - 5 rễ trở lên, rễ dài khoảng 2,5 - 3,0 cm) thì rút nhẹ nhàng ra khỏi bình, rửa sạch môi trường bán ở rễ và đem trồng trong bồn thuỷ canh với dung dịch dinh dưỡng Anthura. - Tại vườm ươm: Theo phương pháp thuỷ canh tĩnh của Trung tâm nghiên cứu phát triển rau Châu á (AVRDC). Thuỷ canh là một trong những phương pháp canh tác tiên tiến nhất trong nền sản xuất hiện đại, cây được trồng trong nước và dung dich dinh dưỡng. Với phương pháp này, cây trồng có thể tăng trưởng và phát triển mạnh do được cung cấp khoáng chất trực tiếp thông qua hệ thống rễ luôn tiếp xúc với môi trường.Một hộp xốp có kích thước thay đổi tuỳ theo từng loại cây trồng. Thường có chiều dài 50 - 60 cm, rộng 40 cm và cao 30 cm. Hộp xốp có tác dụng giữ cho dung dịch nuôi cấy không bị thay đổi về nhiệt độ gây sốc cho cây. - Tại vườn trồng: Chọn đất trồng cẩm chướng phải cao ráo, đất tốt, nhiều mùn luống cao tránh nắng, luống rộng 1,2 - 1,5m, cao 20 - 25cm. Đất phải làm kỹ, nhỏ mịn, lên luống phẳng, thông thường luống rộng 80cm, mặt luống 60cm. Phân bón: 10kg phân chuồng mục, 1kg Tecmo phốt phát, 1kg vôi bột, 0,5kg kali sunphát, trộn đều rải trên đất, xới nhẹ để trộn. Cây non ở tại vườn ươm khoảng 25 - 27 ngày rồi mới trồng ra ruộng mật độ 25 x 30cm. Mật độ khoảng cách bằng trồng với khoảng 30 x 30cm Sau khi trồng ta tưới nước, tưới thường xuyên 1 ngày/lần cho tới khi cây ra nụ. 3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.3.1. Các chỉ tiêu theo dõi trong phòng: - Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Số mẫu sống/Tổng số mẫu thí nghiệm) x 100. - Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = (Số mẫu bật chồi/Số mẫu sống) x 100. - Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = (Số mẫu tạo rễ/Số mẫu sống) x 100. - Tỷ lệ chồi biến dị (%) = (Số chồi biến dị/Số chồi thu được) x 100. - Số chồi /mẫu = Tổng số chồi thu được/ Tổng số mẫu bật chồi. - Chiều cao trung bình chồi (cm) = Tổng chiều cao chồi/ tổng số chồi - Số lá trung bình (lá) = Tổng số lá/Tổng số chồi tạo thành. - Hệ số nhân (chồi/mẫu) = Tổng số chồi tạo thành/Tổng số mẫu bật chồi. - Số rễ TB của chồi = Tổng số rễ / Tổng số chồi ra rễ. - Chiều dài TB rễ (cm) = Tổng chiều dài rễ dài nhất /Tổng số mẫu ra rễ. 3.3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi ngoài vườn: - Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống x 100 Tổng số cây đưa ra - Chiều cao cây trung bình (cm/cây) = Tổng chiều cao cây Tổng số cây theo dõi - Số cặp lá trung bình (cặp lá/cây) = Tổng số cặp lá Tổng số cây theo dõi - Thời gian sinh trưởng, phát triển (ngày) 3.4. Phương pháp xử lý số liệu. Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình Microsoft Excel và chương trình IRRISTAT5.0. 3.5. Địa điểm nghiên cứu Phòng công nghệ sinh học thực vật, Viện Sinh học nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3.6. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 6/2008 đến 6/2009 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các liều lượng chiếu xạ đến khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của mẫu cấy. Ở mỗi loài thực vật, trên các vật liệu chiếu xạ khác nhau có các ngưỡng gây đột biến chiếu xạ khác nhau. Để xác định ngưỡng của liều chiếu xạ lên chồi cẩm chướng chúng tôi tiến hành chiếu xạ với các liều chiếu xạ 0Krad(Đ/C), 1Krad, 2Krad, 3Krad, 4Krad, 5Krad. Tiến hành chiếu xạ bằng tia gamma (nguồn Co60), trong thời gian 1h. Thí nghiệm tiến hành trên vật liệu là đoạn thân mang chồi nách giống Trắng và giống Đỏ, được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962 với 6,2 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol) sau đó đem đi xử lý chiếu xạ tia gamma. Các mẫu sau chiếu xạ được cấy trên môi trường là MS + 1mg/l Kinetin + 10% nước dừa. Theo dõi mẫu xử lý sau 4 tuần chúng tôi thu được kết quả trình bày ở các bảng 4.1a, 1b, 2a, 2b và các hình 4.1, 4.2, 4.3, 4.4: 0Krad (Đ/C) 1Krad 2Krad 3Krad 4Krad 5Krad Bảng 4.1a. Ảnh hưởng của tia gamma đến sinh trưởng, phát triển chồi cẩm chướng in vitro giống đỏ (sau xử lý 4 tuần) Chỉ tiêu Liều xử lý Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá) 0Krad (Đ/C) 100 100 1,67 2,67 3,79 6,33 1Krad 98,33 100 14,97 2,43 3,58 6,03 2Krad 96,67 94,73 27,93 2,17 3,73 6,02 3Krad 90,33 89,40 35,40 1,93 4,63 6,22 4Krad 68,89 86,07 40,00 1,68 2,51 5,69 5Krad 47,33 83,63 46,67 1,45 1,49 5,43 LSD0,05 0,64 CV% 1,8 Hình 4.2: Ảnh hưởng của tia gamma đến tỷ lệ biến dị của chồi cẩm chướng in vi tro giống Đỏ Bảng 4.1b. Ảnh hưởng của tia gamma đến sinh trưởng, phát triển chồi cẩm chướng in vitro giống trắng (sau xử lý 4 tuần) Chỉ tiêu Liều xử lý Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá) 0Krad (Đ/C) 100 100 0,00 2,47 3,53 4,32 1Krad 95,03 94,43 19,10 2,33 3,67 4,59 2Krad 91,40 89,73 23,40 2,57 3,77 4,17 3Krad 89,37 88,83 32,50 2,23 4,23 4,62 4Krad 75,67 79,47 68,47 1,90 2,27 3,93 5Krad 45,73 78,73 75,67 1,63 1,90 3,34 LSD0,05 0,10 CV% 2,6 Hình 4.4: Ảnh hưởng của tia gamma đến tỷ lệ biến dị của chồi cẩm chướng in vi tro giống trắng Một số biểu hiện của chồi cẩm chướng quan sát được trong quá trình theo dõi: Tuần đầu tiên sau xử lý chiếu xạ, các mẫu bắt đầu phát sinh chồi. Tuy nhiên giữa các công thức không có biểu hiện khác nhau rõ ràng. Sang tuần thứ 2, ở các công thức đối chứng và công thức liều chiếu xạ thấp (1Krad, 2Krad), các chồi sinh trưởng mạnh thể hiện ở sự tăng chiều cao và số lá. Ở liều chiếu xạ cao (4Krad, 5Krad) nhận thấy chồi chuyển sang màu xanh nhạt và tăng trưởng chậm. Qua bảng số liệu trình bày ở bảng 4.1a và 4.1b chúng tôi rút ra một số nhận xét: Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ sống, tỷ lệ chết: Ở liều 1Krad, 2Krad trên cả 2 giống cẩm chướng Đỏ và Trắng đều cho tỷ lệ sống và tỷ lệ bật chồi cao, gần tương đương với đối chứng. Cụ thể tỷ lệ sống ở giống Đỏ là 98,33% (1Krad), 96,673% (2Krad) và lần lượt trên giống Trắng là 95,03% (1Krad), 91,40% (2Krad). Tại liều chiếu xạ cao hơn (4Krad, 5Krad), tỷ lệ sống và tỷ lệ bật chồi giảm rõ rệt, tỷ lệ sống giảm từ 68,89% xuống 47,33%, tỷ lệ bật chồi giảm từ 75,67% còn 45,73% trên giống Đỏ và tương tự ở giống Trắng. Qua bảng chúng tôi thấy liều chiếu xạ 5Krad là liều gây chết thể hiện ở tỷ lệ chết cao trên 2 giống. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ chồi biến dị: Tại liều chiếu xạ cao gây chết lớn như 4Krad, 5Krad tỷ lệ sống của chồi cẩm chướng giảm tuy nhiên tỷ lệ biến dị thu được lại cao hơn so với liều chiếu xạ 1Krad, 2Krad. Cụ thể tỷ lệ biến dị thu được tăng từ 14,97% (1Krad) đến 46,67% (5Krad) trên cẩm chướng Đỏ, từ 19,10% (1Krad) đến 75,67% (5Krad) trên giống Trắng. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng phát triển của chồi sau xử lý chiếu xạ: Ở liều chiếu xạ 1Krad, 2Krad các chồi sinh trưởng và phát triển tương đương với đối chứng. Có thể thấy rõ qua chỉ tiêu chiều cao trung bình và số lá trung bình/chồi. Ở liều chiếu xạ 4Krad, 5Krad, sinh trưởng của chồi thấp hơn so với đối chứng. Ở liều 4Krad, chiều cao của giống Đỏ và Trắng lần lượt là 2,51cm; 2,27cm, tương ứng ở liều 5Krad là 1,49 cm; 1,90 cm. Quan sát về hình thái chồi ở các liều khác nhau nhận thấy: ở liều chiếu thấp (1Krad, 2Krad), chồi có màu xanh đậm giống đối chứng, ở liều cao hơn chồi có màu xanh nhạt (4Krad, 5Krad). Như vậy có thể rút ra một số kết luận: - Sự sinh trưởng, phát triển của chồi cẩm chướng tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ. - Liều chiếu xạ càng cao thì tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi càng thấp, tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. - Liều chiếu xạ 4Krad, 5Krad là liều có tỷ lệ biến dị cao. - Khoảng liều xạ có hiệu quả cho tỷ lệ sống và tỷ lệ biến dị cao trên cả 2 giống là từ 3 - 5Krad. *Phân loại các dạng chồi biến dị Sau khi xử lý chiếu xạ 4 tuần, chúng tôi tiến hành cấy chuyển. Trong quá trình cấy chuyển, các cụm chồi được tách ra và đánh dấu theo từng dòng ở từng công thức xử lý. Qua quan sát hình thái bên ngoài chồi, dựa vào các biểu hiện khác thường so với đối chứng, chúng tôi tiến hành phân loại chồi thành các dạng chính sau: Dạng 1: Cây phát triển bình thường, có rất ít sai khác so với đối chứng, lá màu xanh đậm. Dạng 2: Cây có phiến lá to hơn đối chứng, xẻ thuỳ 2 hoặc 3, màu xanh đậm. Dạng 3: Cây có một số lá dính hình hoa, dạng chồi này có số lá ít. Dạng 4: Chồi ngắn, to, mọng nước, màu xanh nhạt. Dạng 5: Chồi cong queo, thân và lá mảnh, phiến lá dày hơn đối chứng; ngọn tiêu biến. Dạng 6: Lá nhỏ, mảnh. Từ một đốt thân phân nhiều nhánh. Sau khi phân loại dạng chồi, chúng tôi tính tỷ lệ xuất hiện các dạng chồi ở các liều chiếu khác nhau và tiến hành đo đếm chỉ tiêu chiều cao, số lá của các dạng này, nhằm làm rõ hơn ảnh hưởng của tia gamma tới đặc điểm hình thái của các dạng chồi. Kết quả trình bày ở bảng 4.2a và 4.2b. Qua bảng ta thấy: Các dạng chồi từ 1 đến 5 xuất hiện trên cả 2 giống cẩm chướng, riêng dạng 6 chỉ xuất hiện trên giống Đỏ ở liều chiếu xạ 4Krad và 5Krad. Dạng 2 xuất hiện ở hầu hết các liều chiếu trên cả 2 giống. Tỷ lệ chồi dạng 2 tăng dần từ liều xạ 1Krad đến liều xạ 2Krad (11,73 - 15,47% đến 16,42-23,45%), giảm xuống ở liều 5Krad. Dạng 3 dạng 4 có số lượng ít hơn. Dạng 5 chỉ xuất hiện ở liều chiếu xạ cao là 4Krad, 5Krad và là dạng biến dị chủ yếu ở các liều này. Các dạng chồi có chỉ số sinh trưởng rất khác nhau ở các liều chiếu xạ khác nhau. Đối với giống Đỏ: dạng 1 và dạng 2 có chiều cao trung bình và số lá trung bình lớn nhất, tiếp theo đến các dạng 3, dạng 5 và dạng 6 gần tương đương nhau, thấp nhất là dạng 4. Đối với giống Trắng: các chỉ số chiều cao và số lá trung bình giảm dần ở các dạng là: dạng 2, dạng 1, dạng 3, dạng 5, dạng 4. Bảng 4.2a. Đặc điểm các dạng chồi giống Đỏ thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) Liều xử lý Dạng 1 Dạng 2 Dạng 3 Dạng 4 Dạng 5 Dạng 6 TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) 0Krad (Đ/C) 98,56 3,76 5,02 1,48 3,89 5,26 0 0 0 0 1Krad 93,25 3,81 4,84 15,47 4,20 5,58 3,41 3,46 3,75 0 0 0 2Krad 85,67 3,97 5,03 23,45 4,19 5,46 6,28 3,65 3,80 3,36 2,83 5,01 0 0 3Krad 64,43 4,02 5,19 27,38 4,27 5,32 7,53 3,76 3,89 3,76 2,65 5,18 32,03 3,02 4,03 0 4Krad 54,38 3,12 4,23 10,66 3,22 5,13 16,89 2,97 3,60 7,38 2,58 5,24 28,05 2,58 3,89 6,35 2,76 6,24 5Krad 25,66 1,85 3,46 9,58 3,12 5,02 19,87 2,76 3,37 9,27 2,34 5,03 26,01 1,69 3,24 9,18 2,68 6,76 Hình 4.6: Tỷ lệ về các dạng chồi ở các liều xử lý của giống cẩm chướng Đỏ Tóm lại có thể kết luận: - Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ sống, tỷ lệ chết: Ở liều 1Krad, 2Krad trên cả 2 giống cẩm chướng Đỏ và Trắng đều cho tỷ lệ sống và tỷ lệ bật chồi cao, gần tương đương với đối chứng. Cụ thể tỷ lệ sống ở giống Đỏ là 98,33% (1Krad), 96,673% (2Krad) và lần lượt trên giống Trắng là 95,03% (1Krad), 91,40% (2Krad). Qua bảng chúng tôi thấy liều chiếu xạ 5Krad là liều gây chết thể hiện ở tỷ lệ chết cao trên 2 giống. - Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến tỷ lệ chồi biến dị: Liều chiếu xạ 4Krad, 5Krad tỷ lệ sống của chồi cẩm chướng giảm tuy nhiên tỷ lệ biến dị thu được lại cao hơn so với liều chiếu xạ 1Krad, 2Krad. Cụ thể tỷ lệ biến dị thu được tăng từ 14,97% (1Krad) đến 46,67% (5Krad) trên cẩm chướng Đỏ, từ 19,10% (1Krad) đến 75,67% (5Krad) trên giống Trắng. - Ảnh hưởng của liều chiếu xạ đến sinh trưởng phát triển của chồi sau xử lý chiếu xạ: Bảng 4.2b. Đặc điểm các dạng chồi giống Trắng thu được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) Liều xử lý Dạng 1 Dạng 2 Dạng 3 Dạng 4 Dạng 5 TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) TL (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá) 0Krad (Đ/C) 100 3,72 4,47 0 0 0 0 1Krad 81,91 3,69 4,93 11,73 4,12 5,35 6,26 3,25 3,45 0 0 2Krad 73,25 3,89 4,89 16,42 4,16 5,45 8,17 3,36 3,65 5,08 2,33 4,53 0 3Krad 66,37 4,02 4,96 18,35 4,21 5,51 9,22 3,47 3,79 5,11 2,55 4,84 31,44 2,14 3,19 4Krad 35,54 3,63 4,59 16,02 3,11 4,38 9,32 3,09 3,12 7,66 2,43 5,13 34,09 2,22 3,49 5Krad 26,25 3,17 4,27 17,57 3,27 4,82 10,67 2,93 3,34 8,86 2,31 5,52 37,45 2,68 3,86 Hình 4.7: Tỷ lệ về các dạng chồi ở các liều xử lý của giống cẩm chướng Trắng Ở liều chiếu xạ 1Krad, 2Krad các chồi sinh trưởng và phát triển tương đương với đối chứng. Ở liều chiếu xạ 4Krad, 5Krad, sinh trưởng của chồi thấp hơn so với đối chứng. Quan sát về hình thái chồi ở các liều khác nhau nhận thấy: ở liều chiếu thấp (1Krad, 2Krad), chồi có màu xanh đậm giống đối chứng, ở liều cao hơn chồi có màu xanh nhạt (4Krad, 5Krad). - Sự sinh trưởng, phát triển của chồi cẩm chướng tỷ lệ nghịch với liều chiếu xạ. - Liều chiếu xạ càng cao thì tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi càng thấp, tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. - Liều chiếu xạ 4Krad, 5Krad là liều có tỷ lệ biến dị cao. - Khoảng liều xạ có hiệu quả cho tỷ lệ sống và tỷ lệ biến dị cao trên cả 2 giống là từ 3 - 5Krad. 4.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và biến dị của các chồi sau chiếu xạ qua cấy chuyển lần 2. Để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của các chồi biến dị. Chúng tôi đã tiến hành ở lần cấy chuyển 2 sau 4 tuần được thể hiện qua bảng 4.3a và 4.3b như sau: Bảng 4.3a. Sự sinh trưởng, phát triển của chồi giống đỏ sau xử lý ở lần cấy chuyển 2 (sau 4 tuần) Chỉ tiêu Liều xử lý Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) Số chồi/mẫu Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá) 0Krad (Đ/C) 100 100 1,38 2,66 3,79 6,32 1Krad 98,73 100 12,88 2,38 3,66 6,07 2Krad 95,62 93,63 25,73 2,13 3,63 6,08 3Krad 91,30 89,47 34,45 1,87 4,64 6,32 4Krad 89,02 87,27 40,06 1,56 2,49 5,54 5Krad 81,33 82,69 45,63 1,49 1,52 5,57 LSD0,05 0,78 CV% 2,2 Hình 4.8: Tỷ lệ chồi biến dị của giống cẩm chướng Đỏ Bảng 4.3b. Tỷ lệ các dạng chồi biến dị của giống đỏ sau lần cấy chuyển 2 Liều xử lý Dạng 1 (%) Dạng 2 (%) Dạng 3 (%) Dạng 4 (%) Dạng 5 (%) Dạng 6 (%) 0Krad (Đ/C) 95,87 4,13 0 0 0 0 1Krad 86,76 6,75 6,49 0 0 0 2Krad 73,83 8,86 7,76 9,55 0 0 3Krad 68,74 9,05 8,11 7,21 6,89 0 4Krad 61,99 10,12 8,76 5,57 7,35 6,21 5Krad 61,66 10,15 8,83 6,12 8,21 5,03 Qua bảng 4.3a và 4.3b nhận thấy: Tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi giảm dần theo chiều tăng liều chiếu xạ. Tuy nhiên, đến liều 5Krad tỷ lệ sống của chồi vẫn cao (81,33%). Sinh trưởng của chồi qua các chỉ tiêu chiều cao, số lá cao hơn so với chồi không qua tiền nuôi cấy. Phân loại các dạng chồi sau xử lý, chúng tôi cũng thu được 6 dạng chồi với đặc điểm cơ bản như trường hợp không tiền nuôi cấy. Tỷ lệ các dạng thu được ở các liều chiếu khác nhau là khác nhau. Ở liều chiếu xạ cao 5Krad vẫn xuất hiện đầy đủ cả 6 dạng chồi. Bảng 4.4a. Sự sinh trưởng, phát triển của chồi giống Trắng sau xử lý ở lần cấy chuyển 2 (sau 4 tuần) Chỉ tiêu Liều xử lý Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Tỷ lệ chồi biến dị (%) Số chồi/mẫu Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá) 0Krad (Đ/C) 100 100 0,00 2,41 3,75 4,80 1Krad 98,21 100 14,46 2,53 3,96 4,79 2Krad 94,68 92,72 23,66 2,67 4,17 5,03 3Krad 96,77 94,85 27,52 2,72 4,31 4,37 4Krad 91,33 91,04 34,65 2,25 3,35 4,44 5Krad 90,02 92,61 38,62 2,39 3,42 4,60 LSD0,05 0,45 CV% 1,0 Hình 4.9: Tỷ lệ chồi biến dị của giống cẩm chướng Trắng Bảng 4.4b. Tỷ lệ các dạng chồi biến dị của giống đỏ sau lần cấy chuyển 2 Liều xử lý Dạng 1 (%) Dạng 2 (%) Dạng 3 (%) Dạng 4 (%) Dạng 5 (%) 0Krad (Đ/C) 100 0 0 0 0 1Krad 84,16 11,22 4,62 0 0 2Krad 71,03 15,89 7,96 5,12 0 3Krad 67,63 17,05 8,11 7,21 0 4Krad 61,22 10,12 8,76 5,55 14,35 5Krad 61,37 10,15 8,86 6,12 13,50 Nhận xét: Qua bảng 4.4a và 4.4b nhận thấy: Tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi giảm dần theo chiều tăng liều chiếu xạ. Tuy nhiên, đến liều 5Krad tỷ lệ sống của chồi vẫn cao (90,02%). Phân loại các dạng chồi sau xử lý, chúng tôi cũng thu được 5 dạng chồi với đặc điểm cơ bản như trường hợp không tiền nuôi cấy. Tỷ lệ các dạng thu được ở các liều chiếu khác nhau là khác nhau. Ở liều chiếu xạ cao 5Krad vẫn xuất hiện đầy đủ cả 5 dạng chồi. Tóm lại sau lần cấy chuyển 2 chúng tôi thu được kết quả sau: - Qua các lần chiếu xạ đối với 2 giống cẩm chướng Đỏ và cẩm chướng Trắng tỷ lệ sống vẫn cao, tỷ lệ bật chồi giảm dần theo chiều tăng của liều chiếu xạ. - Tỷ lệ các chồi biến dị của 2 giống cẩm chướng Đỏ và cẩm chướng trắng thì các dạng thu được ở các liều chiếu xạ khác nhau. Ở chiều chiếu xạ 5Krad vẫn xuất hiện đầy đủ các dạng chồi, riêng với giống Đỏ xuất hiện dạng 6. 4.3. Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau chiếu xạ. Các chồi sau xử lý chiếu xạ, sau khi được nuôi cấy trong môi trường nhân nhanh được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường ra rễ là MS + 0,5mg/l NAA + 0,5 gam than hoạt tính. Ngọn của các dạng chồi được cấy vào môi trường ra rễ để theo dõi. Bảng 4.5. Khả năng ra rễ của chồi cẩm chướng giống Đỏ (sau 3 tuần) Chỉ tiêu Liều xử lý Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/cây (rễ) Chiều dài rễ TB(cm) Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi (lá) Hệ số nhân (chồi/mẫu) 0Krad (Đ/C) 100 6,58 2,10 4,19 5,44 2,57 1Krad 100 5,68 1,79 4,06 5,23 2,41 2Krad 100 7,43 3,08 4,32 5,86 2,88 3Krad 95,56 6,67 2,05 4,08 3,69 2,60 4Krad 67,45 4,29 1,25 3,47 6,67 1,85 5Krad 92,39 6,17 1,48 3,90 4,31 2,35 LSD0,05 1,35 0,15 0,10 CV% 0,8 1,4 2,9 Bảng 4.6. Khả năng ra rễ của chồi cẩm chướng giống Trắng (sau 3 tuần) Chỉ tiêu Liều._.