Bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HCM KHOA SINH HOÏC *****  ***** BAÙO CAÙO TOÅNG KEÁT ÑEÀ TAØI NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC CAÁP CÔ SÔÛ ÑEÀ TAØI : BÖÔÙC ÑAÀU NGHIEÂN CÖÙU QUI TRÌNH TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO GOÁC PHOÂI CHUOÄT MAÕ SOÁ : CS.2004.23.64 CHUÛ NHIEÄM ÑEÀ TAØI: TS. Döông Thò Baïch Tuyeát Thaønh Phoá Hoà Chí Minh - 12/2005 ThS.Nguyeãn Ñaêng Quaân CN.Phaïm Vaên Phuùc (ÑHKHTN Tp. HCM) CN.Leâ Phan Quoác CN.Tröông Vaên Trí (ÑHSP Tp.HCM) ThS.Phan Kim Ngoïc Coäng taùc vieân: DANH MUÏC CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT AS Adult stem cell Teá baøo maàm tröôûng thaønh D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Moâi tröôøng D`MEM dpc day postcoitum Ngaøy sau giao phoái Ebs Embryonic bodys Theå phoâi EC Embryonic carcinoma Teá baøo khoái u EGC Embryonic germ cell Teá baøo maàm phoâi ES Embryonic stem cell Teá baøo goác phoâi FBS Fetal bovine serum Huyeát thanh baøo thai boø FGF Fibroblast growth factor Nhaân toá taêng tröôûng nguyeân baøo sôïi GC Germ cell Teá baøo maàm ICM Inner mass cell Khoái teá baøo beân trong LIF Leukimia inhibitory factor Nhaân toá öùc cheá baïch caàu MEF Mouse embryonic fibroblast Teá baøo fibroblast phoâi chuoät MHC Major Histocompatibitity complex Phöùc hôïp töông hôïp moâ PGC Primordial germ cell Teá baøo maàm sinh duïc sô khai LÔØI MÔÛ ÑAÀU Theá kyû 21 - vôùi söï buøng noå cuûa thaønh töïu Coâng Ngheä Sinh hoïc ñaõ ñem laïi nguoàn lôïi to lôùn cho cuoäc soáng nhaân loaïi. Con ngöôøi khoâng ngöøng tìm kieám nhöõng höôùng nghieân cöùu môùi trong Sinh hoïc Phaân töû vaø Sinh hoïc teá baøo. Ñaëc bieät laø vieäc nghieân cöùu teá baøo goác (Stem cell) nhaèm taän duïng nguoàn giaù trò voâ taän cuûa loaïi teá baøo naøy trong coâng taùc chöõa beänh nhaát laø beänh nan y. “Teá baøo goác” ñaõ trôû thaønh moät khaùi nieäm khoâng coøn xa laï trong lónh vöïc Y- Sinh hoïc do nhöõng ñaëc tính öu vieät cuûa noù. Tuy nhieân Coâng ngheä teá baøo goác (Stem cell biotech) cuõng ñaõ trôû thaønh noãi baên khoaên cho nhaân loaïi khi noù ñöôïc nghieân cöùu vaø thao taùc treân chính con ngöôøi. Nhieàu quoác gia treân theá giôùi ñaõ cho pheùp tieán haønh caùc thao taùc treân teá baøo goác phoâi ngöôøi (Human embryo) vaø cuõng coù nhieàu nöôùc caám, trong ñoù coù Vieät Nam. Vaán ñeà naøy coøn ñang coù nhieàu tranh caõi vaø hieån nhieân seõ coøn bò haïn cheá cho ñeán khi tìm ra caùc phöông phaùp kieåm soaùt chaët cheõ. Trong caùc ñoái töôïng nghieân cöùu phoå bieán hieän nay, chuoät nhaét traéng coù leõ laø khaù quen thuoäc trong phoøng thí nghieäm vì nhöõng ñaëc tính thuaän lôïi cuûa noù: kích thöôùc nhoû, voøng ñôøi ngaén, ñaëc ñieåm sinh lyù gaàn vôùi ngöôøi … Vieäc thu nhaän teá baøo goác töø phoâi chuoät ñaõ ñöôïc thöïc hieän töø raát laâu treân theá giôùi vaø ñaõ ñaït ñöôïc nhieàu thaønh töïu. Tuy nhieân, lónh vöïc nghieân cöùu naøy coøn raát haïn cheá ôû Vieät Nam. Ñeå baét ñaàu tieáp caän vôùi ñoái töôïng nghieân cöùu môùi naøy, chuùng toâi böôùc ñaàu nghieân cöùu qui trình taùch vaø nuoâi caáy teá baøo goác phoâi chuoät. Maëc duø böôùc ñaàu ñaõ ñaït ñöôïc moät soá keát quaû nhaát ñònh nhöng chaéc chaén raèng coøn nhieàu ñieàu chöa hoaøn thieän. Raát mong söï quan taâm vaø goùp yù cuûa nhöõng ai quan taâm ñeán vaán ñeà naøy ñeå ñeà taøi ñöôïc hoaøn thieän hôn. Chaân thaønh caûm ôn. TP HCM, thaùng 12/2005 Thay maët nhoùm taùc giaû Döông Thò Baïch Tuyeát PHAÀN 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1. TEÁ BAØO GOÁC 1.1. Khaùi nieäm Teá baøo goác laø moät loaïi teá baøo chöa chuyeân hoaù, coù khaû naêng phaân chia voâ haïn trong caùc toå chöùc soáng, coù nguoàn goác töø phoâi, baøo thai hay moâ cô theå tröôûng thaønh. Döôùi ñieàu kieän thích hôïp hay coù tín hieäu kích thích, teá baøo goác seõ phaùt trieån thaønh nhieàu loaïi teá baøo chuyeân hoaù taïo thaønh caùc cô quan hay toå chöùc cuûa cô theå. [1][2] 1.2. Ñaëc ñieåm  Coù khaû naêng phaân chia voâ haïn.  Caáu truùc di truyeàn (Boä NST löôõng boäi) trong caùc teá baøo vaãn duy trì vaø oån ñònh vôùi moãi loaøi.  Coù theå bieät hoaù thaønh caùc loaïi teá baøo chuyeân hoaù khaùc nhau thu töø 3 lôùp maàm nguyeân thuûy.  Coù khaû naêng nhaân doøng teá baøo.[1][2] 1.3. Phaân loaïi Goàm 2 nhoùm chính : [7][9]  Teá baøo goác phoâi (Embryonic Stem Cell – ES)  Teá baøo goác phoâi – ES  Teá baøo maàm phoâi (Embryonic Germ Cell – EGC)  Teá baøo goác tröôûng thaønh (Adult Stem Cell – AS) 1.4. Sô löôïc tình hình nghieân cöùu Caùc teá baøo goác phoâi (ES _ Embryo stem cell, ) laàn ñaàu tieân ñöôïc coâ laäp vaøo nhöõng naêm 1980 bôûi nhieàu nhoùm nghieân cöùu laøm vieäc ñoäc laäp. Nhöõng nhaø nghieân cöùu naøy ñaõ nhaän ra ñaëc tính bieät hoùa ña höôùng cuûa teá baøo ES ñeå cho ra caùc loaïi teá baøo cuûa caû ba lôùp maàm sô khôûi. Gossler vaø coäng söï ñaõ mieâu taû khaû naêng vaø lôïi ñieåm cuûa vieäc duøng teá baøo ES ñeå taïo ra ñöôïc caùc ñoäng vaät chuyeån gene. Thomas vaø Capechi ñaõ baùo caùo veà khaû naêng bieán ñoåi boä gene cuûa caùc teá baøo ES baèng taùi toå hôïp töông ñoàng. Smithies vaø caùc ñoàng nghieäp sau ñoù ñaõ chöùng minh raèng caùc teá baøo ES ñöôïc bieán ñoåi gen khi vaøo Blastocyst, coù theå truyeàn laïi nhöõng bieán ñoåi di truyeàn naøy qua caùc doøng teá baøo . Ngaøy nay caùc bieán ñoåi di truyeàn treân boä gene chuoät baèng kyõ thuaät teá baøo ES laø moät caùch tieáp caän quan troïng ñeå tìm hieåu chöùc naêng cuûa caùc teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ in vivo. Caùc nghieân cöùu veà caùc teá baøo ES cuûa caùc ñoäng vaät höõu nhuõ: chuoät ñoàng, chuoät, choàn, heo vaø boø ñaõ ñöôïc coâng boá; tuy nhieân, chæ coù teá baøo ES chuoät laø thaønh coâng trong vieäc truyeàn laïi caùc bieán ñoåi di truyeàn töø teá baøo ES thoâng qua doøng teá baøo maàm sinh duïc. Gaàn ñaây, caùc quan taâm veà caùc teá baøo goác ñaõ taêng maïnh nhôø nhöõng baùo caùo veà coâ laäp teá baøo ES ôû ngöôøi vaø linh tröôûng. Caùc coâng trình taïo phoâi lai giöõa ngöôøi vaø thoû, bieán teá baøo goác thaønh tröùng vaø tinh truøng, thu teá baøo maàm maø khoâng laøm cheát phoâi … ñaõ thu ñöôïc nhieàu keát quaû khaû quan trong hai thaäp kyû qua. Ñaëc bieät, vaøo thaùng 5/2004 A. Melton vaø coäng söï ñaõ bieät hoaù 17 loaïi teá baøo khaùc nhau töø ES thu nhaän töø khoái teá baøo beân trong cuûa blastocyst ôû ngöôøi. Caùc nhaø khoa hoïc Haøn quoác ñaõ toû ra vöôït troäi vaø ñaõ coù caùc coâng trình coù tính tieân phong trong lónh vöïc thu nhaän teá baøo goác phoâi ngöôøi. Tính ñeán nay, treân theá giôùi, ít nhaát ñaõ coù 4 ngaân haøng teá baøo goác ra ñôøi vaø ñi vaøo hoaït ñoäng (Haøn quoác, Anh, Myõ, Trung quoác). Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phoâi ngöôøi giai ñoaïn 8 teá baøo Rieâng ôû Vieät Nam, vieäc nghieân cöùu teá baøo goác chæ môùi ñang trong giai ñoaïn khôûi ñaàu vaø ñöôïc taäp trung chuû yeáu taïi hai trung taâm lôùn (Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân Haø noäi vaø Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân TP HCM). Maëc daàu vaäy, caùc phoøng Thí nghieäm coâng ngheä cao cuûa hai Tröôøng noùi treân cuõng ñaõ ñaït ñöôïc moät soá thaønh töïu laøm tieàn ñeà cho caùc nghieân cöùu saâu hôn veà teá baøo goác. Chaúng haïn nhö xaây döïng caùc quy trình thu nhaän nguoàn phoâi in vitro, in vivo töø ñoäng vaät laøm nguyeân lieäu cho khai thaùc teá baøo goác, caáy gheùp da thu ñöôïc töø nuoâi caáy teá baøo ñeå ñieàu trò caùc ca boûng, gheùp teá baøo goác CD34+ maùu ngoaïi vi ñeå ñeå ñieàu trò beänh lyù aùc tính, thu teá baøo goác sinh maùu töø tuyû xöông, cuoáng roán … [7][9] 2. TEÁ BAØO GOÁC PHOÂI 2.1. Khaùi nieäm vaø ñaëc ñieåm Teá baøo goác phoâi ñöôïc ñònh nghóa bôûi nguoàn goác cuûa noù, chuùng coù nguoàn goác töø daïng blastocyst cuûa phoâi. Blastocyst laø moät daïng phaùt trieån taát yeáu cuûa phoâi tröôùc khi baùm vaøo thaønh töû cung. ÔÛ giai ñoaïn naøy, phoâi chuoät goàm lôùp teá baøo ngoaøi (ngoaïi phoâi bì), khoang phoâi vaø khoái teá baøo beân trong. Teá baøo goác taêng nhanh veà soá löôïng vaø bieät hoùa chöùc naêng thaønh caùc cô quan tröôûng thaønh. Neáu taùch teá baøo goác ra khoûi phoâi vaø chuyeån chuùng vaøo moät cô quan khaùc hay cô theå tröôûng thaønh, chuùng coù theå hoøa nhaäp, tieáp tuïc phaân chia vaø theå hieän khaû naêng chuyeân bieät theo cô quan ñoù. Töông töï, neáu caùc teá baøo naøy ñöôïc coâ laäp invitro, taïo doøng (colony) vaø taùc ñoäng bieät hoùa, chuùng seõ coù khaû naêng bieán ñoåi hình thaùi vaø ñaëc ñieåm sinh lyù ñeå cho caùc daïng teá baøo khaùc trong phoøng thí nghieäm.[1][2] Haàu heát nhöõng teá baøo trong cô theå ñeàu coù nguoàn goác töø söï töï sao cheùp teá baøo goác. Do ñoù, caùc nhaø khoa hoïc nhaän thaáy caàn phaûi phaùt trieån ñaëc ñieåm ñaëc bieät naøy ñeå giuùp teá baøo goác bieät hoùa toát hôn. Austin Smith ñaõ xaùc ñònh caùc ñaëc ñieåm cuï theå cuûa teá baøo goác phoâi nhö sau:  Chuyeån hoùa töø lôùp teá baøo beân trong hay noäi phoâi bì cuûa blastocyst.  Toàn taïi vaø duy trì oån ñònh boä nhieãm saéc theå ôû daïng löôõng boäi.  Coù theå phaùt trieån thaønh caùc loaïi teá baøo khaùc nhau vaø xuaát phaùt töø 3 lôùp maàm rieâng bieät cuûa phoâi (noäi bì, trung bì vaø ngoaïi bì).  Coù khaû naêng hôïp thaønh moät theå thoáng nhaát trong taát caû caùc moâ thai trong suoát thôøi kyø phaùt trieån.  Coù khaû naêng nhaân doøng teá baøo vaø phaùt trieån thaønh teá baøo tröùng vaø tinh truøng.  Bieåu hieän nhaân toá sao cheùp Octo-4, laøm hoaït hoùa hay kìm haõm moät gene ñích vaø duy trì söï phaùt trieån nhanh cuûa teá baøo goác phoâi khoâng bieät hoùa.  Coù theå tieáp tuïc phaùt trieån vaø töï ñoåi môùi chính noù.  Doøng caùc teá baøo goác phoâi ñôn baøo coù theå phaùt trieån thaønh doøng teá baøo thuaàn hay doøng teá baøo coù nguoàn goác nhö nhau.  Trong toång hôïp DNA, khaùc vôùi teá baøo sinh döôõng, teá baøo goác phoâi khoâng ñoøi hoûi caùc taùc nhaân kích thích beân ngoaøi khi baét ñaàu sao cheùp DNA.  ÔÛ moãi teá baøo sinh döôõng cuûa ñoäng vaät höõu nhuõ caùi, moät trong hai nhieãm xaéc theå X trôû neân baát hoaït hoaøn toaøn , nhöng söï baát hoaït cuûa nhieãm saéc theå X khoâng xuaát hieän ôû teá baøo ES.[1][2][7][9] Hình 1.2: Sô ñoà bieät hoùa caùc teá baøo töø tuùi phoâi ôû ngöôøi 2.2. Nguoàn goác cuûa teá baøo goác phoâi Phoâi ñoäng vaät coù vuù khi phaùt trieån thì töøng ñaùm teá baøo trong ñaùm ñaïi phoâi baøo chìm xuoáng, tröôùc khi phoâi baùm vaøo thaønh töû cung. Ñaây laø caùc teá baøo ña naêng, coù nghóa laø chuùng coù khaû naêng phaùt trieån thaønh caùc teá baøo cuûa 3 lôùp maàm sô caáp. Caùc teá baøo ña naêng naøy ñöôïc hình thaønh töø khoái teá baøo beân trong cuûa phoâi ôû giai ñoïan tuùi phoâi, sau ñoù moät soá trong chuùng di chuyeån ra phía ngoaøi ñeå taïo ngoaïi phoâi bì. Maët khaùc caùc teá baøo ña naêng naøy cuõng coù khaû naêng keùo daøi söï töï ñoåi môùi töùc laø chuùng coù theå khoâng bieät hoùa theo sô ñoà ñònh saün. Caùc teá baøo ôû vuøng naèm saùt giöõa ngoaïi phoâi bì vaø khoái teá baøo beân trong seõ taïo ra teá baøo goác phoâi toát nhaát.[9][10] 3. TEÁ BAØO MAÀM SINH DUÏC 3.1. Khaùi nieäm Teá baøo maàm sinh duïc (goïi taét teá baøo maàm – Germ Cell ) laø nhöõng teá baøo goác ña naêng coù theå phaân chia lieân tuïc vöøa töï laøm môùi vöøa bieät hoùa taïo thaønh caùc giao töû (tinh truøng, tröùng) töø ñoù taïo ra cô theå môùi.[5] 3.2. Söï hình thaønh vaø toàn taïi cuûa caùc teá baøo maàm Trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, hôïp töû sau khi ñöôïc taïo thaønh, qua nhöõng laàn phaân chia ñaàu tieân caùc teá baøo con ñöôïc sinh ra. Nhöõng teá baøo naøy seõ phaùt trieån theo caùc höôùng khaùc nhau vôùi caáu truùc vaø chöùc naêng rieâng bieät. Moät trong nhöõng höôùng bieät hoùa laø höôùng hình thaønh neân caùc teá baøo maàm sô khai (teá baøo maàm sinh duïc sô khai – Primordial Germ Cell – PGC ). Nguyeân nhaân taïo ra höôùng bieät hoùa laø vì trong teá baøo chaát cuûa hôïp töû chöùa nhieàu nhaân toá ‘‘quyeát ñònh’’ (determint factor), caùc nhaân toá naøy laïi phaân boá khoâng ñoàng ñeàu. Do ñoù, khi hôïp töû phaân caét thì moãi teá baøo con seõ nhaän ñöôïc moät phaàn teá baøo chaát coù chöùa caùc nhaân toá ‘‘quyeát ñònh’’ coù thaønh phaàn vaø haøm löôïng khoâng gioáng nhau. Nhöõng teá baøo con naøo nhaän ñöôïc nhaân toá naøy seõ bieät hoùa theo höôùng maø nhaân toá quyeát ñònh quy ñònh.[4][5] Caùc teá baøo maàm sinh duïc xuaát hieän töø giai ñoaïn khaù sôùm trong söï phaùt trieån cuûa phoâi, ñoù laø giai ñoaïn phoâi vò hoùa (phoâi ba laù). Caùc teá baøo ôû raõnh sinh duïc (PGC) laø neàn taûng cho doøng teá baøo maàm sinh duïc. Theá heä con chaùu cuûa chuùng seõ hình thaønh neân caùc giao töû ôû ñoäng vaät tröôûng thaønh. Caùc teá baøo PGC giöõ vai troø quan troïng trong söï soáng soùt cuûa moät loaøi. ÔÛ ñoäng vaät höõu nhuõ noùi chung vaø chuoät noùi rieâng, PGC laø moät quaàn theå caùc teá baøo di ñoäng. Chuùng ñöôïc hình thaønh trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, sau ñoù di chuyeån, kheách ñaïi vaø ñònh cö ôû boä phaän sinh duïc. Caùc teá baøo maàm laàn ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh khi coù moät daáu hieäu yeáu cuûa nhöõng teá baøo döông tính vôùi phaûn öùng alkaline phosphatase taïi raõnh sinh duïc nguyeân thuûy vaøo ngaøy 7 dpc (day postcoitum). Soá löôïng teá baøo maàm sinh duïc nguyeân thuûy chöøng 50 – 80 teá baøo vaøo cuoái giai ñoaïn phoâi vò hoùa (giai ñoaïn ba laù phoâi). Vaøo giai ñoaïn 8 – 8,5 dpc thì soá löôïng teá baøo cuûa chuùng chöøng 100 teá baøo, ñònh vò taïi lôùp trong ruoät sau vaø di chuyeån leân lôùp bieåu moâ ruoät sau vaøo ngaøy 9 – 9,5 dpc, taïi ñaây soá löôïng cuûa chuùng taêng leân chöøng 350 teá baøo. Töø ñaây, chuùng di chuyeån theo höôùng löng doïc theo caùc nieâm maïc ruoät sau veà phía caàu sinh duïc phaùt trieån (genital ridge) vaø ñònh cö ôû ñaây vaøo ngaøy 10,5 dpc, khi ñoù soá löôïng cuûa chuùng khoaûng 1000. Beân trong boä phaän sinh duïc, caùc teá baøo maàm sinh duïc tieáp tuïc phaân chia vaø quaàn theå teá baøo ñaït chöøng 25000 teá baøo vaøo ngaøy 13,5 dpc. [5] Caàu sinh duïc (genital ridge) laø tieàn thaân cuûa cô quan sinh duïc sau naøy. Caùc teá baøo maàm toàn taïi trong caàu sinh duïc seõ di chuyeån veà cô quan sinh duïc ñang hình thaønh trong caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi. ÔÛ giai ñoaïn 12.5 dpc, caàu sinh duïc baùm vaøo trung thaän (mesonephros) hay coøn goïi laø thaän thai (fetus kidney). Sau khi boû heát phaàn noäi quan, caàu sinh duïc vaø trung thaän naèm gaàn saùt vaøo löng. Coù theå quan saùt baèng maét thöôøng hay qua kính luùp hoaëc kính hieån vi soi noåi ñeå thaáy hai boä phaän naøy. Kích thöôùc cuûa caàu sinh duïc vaø trung thaän chöøng 1 – 2 mm tuyø thuoäc troïng löôïng, kích thöôùc phoâi. Khi chöa taùch rôøi, caàu sinh duïc vaø trung thaän taïo thaønh hình löôõi lieàm. Döôùi kính hieån vi, löôõi lieàm coù hai lôùp: moät lôùp beân phía chieàu cong beân trong coù maøu saùng hôn laø caàu sinh duïc, moät lôùp coù maøu saãm hôn laø trung thaän. Hình 1.3: Söï ñònh vò vaø toàn taïi cuûa teá baøo maàm ôû caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi (Phaàn maøu ñoû laø caùc teá baøo maàm sinh duïc). Ñeå nghieân cöùu GC in vitro, ngöôøi ta döïa vaøo söï ñònh vò cuûa chuùng trong phoâi theo tuoåi maø thu nhaän vaø nuoâi caáy. Sau 12,5 dpc, caùc teá baøo maàm sinh duïc taäp trung vaøo caùc cô quan sinh duïc. Buoàng tröùng naèm caïnh thaän trong khi ñoù tinh hoaøn thì naèm ôû vò trí gaàn boùng ñaùi. Bieåu ñoà 1.1: Moái quan heä giöõa tuoåi (dpc) vaø soá löôïng teá baøo maàm sinh duïc ôû phoâi chuoät Mus musculus var.Albino. Theo Tam vaø Snow (1981). [ 5] 3.3. Xaùc ñònh teá baøo maàm Hieän taïi coù ba phöông phaùp xaùc ñònh teá baøo maàm sinh duïc döïa vaøo: (1) Ñaëc ñieåm hình daïng, (2) Khaùng theå nhaän dieän khaùng nguyeân ñaëc tröng cho teá baøo GC (3) Söï bieåu hieän cuûa enzym Alkaline phosphatase. 3.3.1. Ñaëc ñieåm hình daïng teá baøo maàm Caùc teá baøo GC sau khi ñöôïc rôøi ra töø caùc maûnh moâ coù theå phaân bieät ñöôïc chuùng vôùi caùc teá baøo sinh döôõng khaùc khi xem döôùi kính hieån vi soi noåi hay caét lôùp. Teá baøo maàm sinh duïc vöøa môùi thu nhaän thì seõ coù hình troøn, beà maët laùng vaø phaûn chieáu aùnh saùng. Chuùng coù ñöôøng kính töø 18 - 20 μm neân lôùn hôn haàu heát caùc teá baøo sinh döôõng. Chuùng laên troøn ñeàu treân maët ñaùy cuûa gieáng nuoâi. Sau moät thôøi gian nuoâi caáy ngaén, caùc teá baøo sinh döôõng baùm vaøo ñaùy bình trong khi ñoù caùc teá baøo maàm sinh duïc vaãn khoâng baùm vaøo ñaùy bình. Teá baøo GC haàu nhö khoâng coù maøu do vaäy coù theå phaân bieät vôùi nhöõng teá baøo hoàng caàu khoâng nhaân, khoâng baùm vaø coù cuøng kích thöôùc vôùi teá baøo GC bôûi caùc teá baøo hoàng caàu coù maøu ñoû hoàng nhaït. Sau moät vaøi giôø nuoâi caáy treân lôùp teá baøo ñôn (lôùp feeder, thöôøng laø fibroblast), chuùng seõ dính vaøo lôùp teá baøo beân döôùi vaø thay ñoåi hình daïng – hình daïng cuûa chuùng coù veû nhö hình cuûa fibroblast. Khi ñoù, chuùng ta khoâng theå naøo xaùc ñònh ñöôïc chuùng qua hình daïng maø ñeå xaùc ñònh chuùng phaûi thoâng qua khaùng theå hay alkaline phosphatase. 3.3.2. Xaùc ñònh döïa vaøo khaùng theå Caùc teá baøo maàm sinh duïc theå hieän moät soá khaùng nguyeân beà maët chuyeân bieät (Donovan vaø coäng söï, 1986). Caùc khaùng nguyeân naøy seõ keát hôïp ñöôïc vôùi khaùng theå TG-1 vaø SSEA-1. Söï hieän dieän cuûa caùc khaùng nguyeân naøy laø moät phöông tieän ñaùng tin caäy cho vieäc xaùc ñònh teá baøo GC soáng trong nuoâi caáy. Tuy nhieân, thaät caån thaän raèng caùc phaûn öùng khaùng theå khoâng hoaøn toaøn ñaëc hieäu cho teá baøo GC. Moät soá khaùng theå ña doøng ñöôïc bieát phaûn öùng chuyeân bieät vôùi teá baøo GC nhöng cuõng ñoàng thôøi phaûn öùng vôùi caùc kieåu teá baøo khaùc. [5] 3.3.3. Xaùc ñònh döïa vaøo Alkaline phosphatase Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng caùc teá baøo GC theå hieän söï hoaït ñoäng maïnh cuûa Alkaline phosphatase. Hoaït tính cuûa Alkaline phosphatase ñaàu tieân ñöôïc xaùc ñònh vaøo ngaøy thöù 7 dpc vaø tieáp tuïc bieåu hieän cho ñeán cuoái ñôøi soáng cuûa phoâi.[5] Maëc duø trong phoâi cuõng coù nhöõng teá baøo khaùc cuõng döông tính vôùi alkaline phosphatase nhöng söï hieän dieän cuûa teá baøo döông tính vôùi alkaline phosphatase thu nhaän töø maãu moâ sinh duïc (nhö caàu sinh duïc) laø khoâng theå nhaàm laãn ñöôïc bôûi vì khoâng coù kieåu teá baøo naøo bieåu hieän ñaëc tính naøy. Teá baøo maàm thu nhaän töø caàu sinh duïc ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông nhuoäm Alkaline phosphatase. Traïng thaùi chöa bieät hoaù cuûa teá baøo maàm coù theå ñöôïc nhaän bieát nhôø möùc ñoä bieåu hieän cao cuûa enzym Alkaline Phosphatase. Enzym naøy hoaït ñoäng toái öu trong moâi tröôøng pH kieàm, do vaäy goïi laø Alkaline phosphatase (Alkaline nghóa laø kieàm). Trong teá baøo, Alkaline phosphatase giöõ vai troø raát quan troïng trong vieäc phaân giaûi caùc nhoùm phosphate cuûa caùc phaân töû nucleotide, protein vaø akaloide. ÔÛ teá baøo goác vaø teá baøo maàm trong moät khoaûng thôøi gian nhaát ñònh trong thôøi gian phaùt trieån cuûa phoâi thì enzym naøy hoaït ñoäng maïnh. Söï bieåu hieän maïnh cuûa enzym naøy haàu nhö ít xaûy ra ôû caùc teá baøo ñaõ bieät hoaù. Do vaäy, söï bieåu hieän maïnh cuûa enzym naøy laø moät daáu hieäu ñeå xaùc ñònh teá baøo goác vaø teá baøo maàm.[5][9] Cô cheá phaûn öùng Ñaàu tieân, Naphthol AS-BI phosphaste seõ bò caét ñi goác Phosphate thaønh Naphthol AS-BI. Sau ñoù, Naphthol AS-BI seõ phaûn öùng trôû laïi vôùi Fast Blue BB Salt vaø taïo ra saûn phaåm coù maøu xanh baùm treân beà maët teá baøo. Maøu xanh naøy coù theå quan saùt döôùi kính hieån vi. Naphthol AS-BI phosphaste Naphthol AS-BI APase Naphthol AS-BI + Fast Blue BB Salt Blue Pigment (Saéc toá maøu xanh). 4. NGUOÀN GOÁC THU NHAÄN VAØ PHÖÔNG PHAÙP THU NHAÄN TEÁ BAØO GOÁC ÑA NAÊNG Haàu heát caùc nhaø khoa hoïc söû duïng teá baøo goác ña naêng (pluripotent stem cell hay leuripotent stem cell) ñeå chæ nhöõng teá baøo goác thu nhaän töø tuùi phoâi. Töø pluri coù nguoàn goác töø tieáng Hy laïp laø plures nghóa laø nhieàu. Do vaäy, nhöõng teá baøo goác ña naêng coù theå bieät hoùa thaønh baát kì teá baøo naøo tröø caùc teá baøo thu nhaän töø maøng phoâi. Ñaây laø moät ñaëc tính ñöôïc quan saùt trong ñieàu kieän in vivo vaø caû trong ñieàu kieän in vitro.[5] Caùc teá baøo goác ña naêng coù theå ñöôïc thu nhaän töø ba nguoàn goác:  Caùc teá baøo goác phoâi (ES) thu nhaän töø phoâi giai ñoaïn blastocyst.  Caùc teá baøo maàm sinh duïc (GC) thu nhaän töø phoâi thai (chuoät töø giai ñoaïn 8,5 – 12,5 dpc, ngöôøi 5 – 7 tuaàn tuoåi)  Caùc teá baøo khoái u chöùa nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau cuûa caùc lôùp maàm. Hình 1.4 : Nguoàn thu nhaän caùc teá baøo goác ña naêng Do trong quaù trình phaùt trieån cuûa phoâi, tính töø luùc sau khi thuï tinh (Do) thì caùc söï kieän tieáp theo xaûy ra theo moät thôøi gian coù theå döï ñoaùn tröôùc. Nhôø ñoù maø ngöôøi ta coù theå thöïc hieän caùc kyõ thuaät vi thao taùc ñeå thu nhaän moät hoãn hôïp teá baøo chöùa caùc teá baøo goác phoâi ES, teá baøo maàm EG ôû caùc giai ñoaïn phoâi khaùc nhau töø caùc phoâi thuï tinh töï nhieân in vivo hoaëc töø caùc phoâi thuï tinh in vitro baèng caùch theo doõi thôøi gian phaùt trieån cuûa phoâi.[9] Töø hoãn hôïp teá baøo thu nhaän ñöôïc ngöôøi ta tieán haønh caùc phöông phaùp nuoâi caáy khaùc nhau ñeå töø ñoù caáy chuyeàn, phaân laäp baèng nhieàu phöông phaùp vaø cuoái cuøng thu nhaän ñöôïc caùc doøng teá baøo goác ña naêng. Thöôøng thì caùc nhaø khoa hoïc söû duïng caùc kyõ thuaät coâng ngheä cao ñeå phaân laäp caùc teá baøo goác ña naêng nhö vieäc söû duïng coâng cuï FACS (Fluorescen Activated Cell Sorting) ñeå phaân loaïi caùc teá baøo goác raát hieám töø haøng trieäu teá baøo khaùc. Vôùi kyõ thuaät naøy, dòch huyeàn phuø caùc teá baøo ñöôïc gaén vôùi ñuoâi huyønh quang (nghóa laø chæ gaén leân caùc marker beà maët cuûa teá baøo goác caùc tag huyønh quang thích hôïp), sau ñoù ñöôïc chuyeån ñeán moät duïng cuï taïo ra söùc eùp xuyeân qua mieäng heïp - raát heïp ñeán noãi caùc teá baøo phaûi xuyeân qua töøng caùi moät taïi moät thôøi ñieåm. Nhôø vaøo vieäc thoaùt khoûi mieäng, caùc teá baøo sau ñoù chuyeån qua, töøng caùi moät, xuyeân qua moät nguoàn aùnh saùng, thöôøng laø laser, vaø sau ñoù xuyeân qua moät tröôøng ñieän töø. Caùc teá baøo huyønh quang tích ñieän aâm, trong khi caùc teá baøo khoâng huyønh quang tích ñieän döông, söï khaùc ñieän tích cho pheùp caùc teá baøo goác ñöôïc taùch ra khoûi caùc teá baøo khaùc. Coâng cuï naøy coøn ñöôïc duøng ñeå phaân laäp teá baøo goác döïa vaøo söï khaùc nhau veà ñoä lôùn teá baøo, hình daïng beà maët, ñoä trong suoát, ñoä ñaäm ñaëc NST, caùc marker beà maët, marker beân trong cuûa teá baøo … Hình 1.5: Phöông phaùp phaân loaïi teá baøo coù hoaït tính phaùt huyønh quang FACS 5. ÖÙNG DUÏNG CUÛA TEÁ BAØO GOÁC Teá baøo ES ñaõ môû ra raát nhieàu öùng duïng. Vaán ñeà ñöôïc xem laø noùng boûng nhaát laø söû duïng tính ña theá cuûa teá baøo naøy trong lieäu phaùp caáy gheùp – nghóa laø thay theá hoaëc phuïc hoài moâ ñaõ bò phaù huûy, bò thöông hoaëc beänh taät. Caùc beänh coù theå söû duïng teá baøo ES ñeå ñieàu trò goàm: Parkinson, tieåu ñöôøng , chaán xöông coät soáng , söï suy thoaùi teá baøo, loaïn döôõng cô, tim vaø taïo xöông. Tuy nhieân, tuøy theo muïc ñích ñieàu trò cho moãi loaïi beänh maø teá baøo ES phaûi ñöôïc ñieàu khieån ñeå bieät hoùa thaønh caùc teá baøo chuyeân bieät tröôùc khi caáy gheùp. Caùc nghieân cöùu naøy ñang ñöôïc tieán haønh, tuy nhieân soá löôïng phoøng thí nghieäm ES ngöôøi thì raát ít. Nhö vaäy, vieäc söû duïng teá baøo ES vaãn coøn laø tieàm naêng vaø caàn tính thöïc nghieäm cao. Thuaän lôïi khaùc cuûa teá baøo ES laø noù coù khaû naêng taêng sinh voâ haïn trong oáng nghieäm, do vaäy noù coù nhieàu trieån voïng ñeå phaùt trieån thaønh nhieàu daïng teá baøo thoâng qua söï ñieàu khieån bieät hoùa, sau ñoù ñöôïc caáy gheùp ñeå thay theá hoaëc phuïc hoài caùc cô quan bò toån thöông. Caùc teá baøo ES thuaän lôïi cho vieäc caáy gheùp neáu chuùng khoâng bò heä thoáng mieãn dòch cuûa cô theå thaûi loaïi . Teá baøo goác phoâi ngöôøi coù theå ñöôïc duøng ñeå nghieân cöùu caùc baát thöôøng trong söï phaùt trieån cuûa phoâi ngöôøi: khuyeát taät baåm sinh, quaùi thai vaø nhaát laø saåy thai… Vieäc nghieân cöùu teá baøo ES ngöôøi coù theå ñöôïc xaùc ñònh bôûi caùc nguyeân nhaân ôû möùc ñoä phaân töû vaø möùc ñoä teá baøo. Teá baøo ES cuõng coù theå ñöôïc duøng ñeå thaêm doø taùc ñoäng cuûa nhieãm saéc theå baát thöôøng trong söï phaùt trieån cuûa phoâi sôùm. Ñieàu naøy bao goàm khaû naêng kieåm soaùt söï phaùt trieån cuûa caùc moâ ung thö giai ñoïan sôùm. Teá baøo goác phoâi coøn duøng ñeå kieåm tra caùc loaïi thuoác trò beänh môùi, saøng loïc caùc ñoäc toá tieàm aån. Cuoái cuøng teá baøo ES ngöôøi coù theå ñöôïc söû duïng ñeå phaùt trieån caùc phöông phaùp môùi cho kyõ thuaät di truyeàn nhö taùi toå hôïp töông ñoàng.[5][9] Hình 1.6 : Chieán löôïc gheùp teá baøo goác Hình 1.7: Chieán löôïc duøng teá baøo goác trong lieäu phaùp gene. Ñoái vôùi teá baøo maàm ( cuõng laø teá baøo goác ña naêng vaø laø nguoàn goác cho caùc teá baøo sinh duïc) thì ngoaøi öùng duïng cuûa moät teá baøo goác ña naêng thì teá baøo maàm ñöôïc söû duïng vaøo nhöõng muïc ñích chuyeân bieät nhö :  Ñieàu trò beänh voâ sinh baèng caùch nuoâi moâ sinh duïc ñeå thu nhaän teá baøo maàm vaø cho bieät hoaù thaønh teá baøo sinh duïc hoaøn chænh ñeå coù theå tham gia thuï tinh.  Nuoâi caáy bieät hoùa teá baøo maàm coøn coù yù nghóa trong baûo toàn gioáng. Nhöõng loaøi ñoäng vaät quyù hieám sau khi bò cheát coù theå thu nhaän teá baøo cô quan sinh duïc ñeå tröõ laïnh. Sau ñoù, nhöõng teá baøo naøy coù theå bieät hoùa vaø cho thuï tinh ñeå sinh con. Ñieàu naøy coù yù nghóa lôùn neáu con vaät chöa tröôûng thaønh.  Söû duïng teá baøo maàm sinh duïc laøm moâ hình cho vieäc kieåm nghieäm caùc chaát gaây voâ sinh. PHAÀN 2 VAÄT LIEÄU – PHÖÔNG PHAÙP 2.1. VAÄT LIEÄU VAØ HOÙA CHAÁT 2.1.1. Ñoái töôïng nghieân cöùu Chuoät nhaét traéng (Mus musculus var. Albino) : töø hai ñeán ba thaùng tuoåi, caân naëng töø 20 – 30g, coù söùc soáng khoûe maïnh, saïch beänh, do Vieän Pasteur TP.HCM cung caáp. (chuoät ñöïc vaø caùi ñeàu tröôûng thaønh veà sinh duïc), Hình 2.1: Chuoät nuoâi trong chuoàng 2.1.2. Duïng cuï – thieát bò 2.1.2.1.Duïng cuï  Chuoàng nuoâi chuoät: Kích thöôùc 30cm x 20cm x 20cm, naép ñaäy baèng löôùi theùp, coù loùt traáu khoâ, thoaùng, khoâ  Duïng cuï giaûi phaãu: - Khay inox - Taám loùt cao su - Ghim coá ñònh chuoät - Keùo thaúng vaø keùo cong - Keïp thaúng vaø keïp cong - Becher (200ml,100ml)  Duïng cuï taùch vaø thu nhaän teá baøo - OÁng tieâm 1ml, 5ml - Ñaàu kim tieâm 26G - Maøng loïc teá baøo Cell Strainer 70μm - Ñóa Petri nhöïa (ñöôøng kính 35 x10 mm) - Micropipette (100 – 1000μl, 40 – 200 μl) - Ñaàu tip (1000 μl, 100 μl) - Eppendorf 1,5ml - Buoàng ñeám hoàng caàu - Bình Roux (25cm2, 75cm2) - Ñóa nuoâi 24 gieáng - Lame, lamelle - Phin loïc voâ truøng 0,22 μm 2.1.2.2.Thieát bò - Laminar - Heä thoáng kính vi thao taùc - Kính hieån vi ñaûo ngöôïc - Kính hieån vi quang hoïc - Maùy vi tính - Maùy ño pH - Caân phaân tích - Heä thoáng chuïp aûnh - Tuû laïnh maùt - Tuû laïnh – 20oC - Tuû aám CO2 2.1.3.Hoùa chaát 2.1.3.1.Hoùa chaát kích thích ruïng tröùng vaø thuï tinh + PMSG (Prenant Mare’s Serum Gonadotropin 1000 IU)  Daïng boät  Baûo quaûn 2 – 7oC, traùnh aùnh saùng.  Coâng duïng: kích thích nang tröùng phaùt trieån.  Pha PMSG 100IU/ml: caân moät löôïng PMSG töông ñöông 100IU hoøa vaøo 1ml dung dòch NaCl 0,9%.  Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/ chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/ chuoät) + Humagon: 75IU FSH/75IU LH  Daïng boät.  Baûo quaûn 25 oC, traùnh aùnh saùng.  Coâng duïng: kích thích nang tröùng phaùt trieån.  Pha dung dòch Humagon: caân moät löôïng 75IU hoøa vaøo 0,75 ml dung dòch NaCl 0,9%.  Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/chuoät). + Prenyl: Human Chorionic Gonadotropin 1500IU (Organon, Haø Lan).  Daïng boät.  Baûo quaûn: 2 - 15 oC, traùnh aùnh saùng.  Coâng duïng: kích thích tröùng chín vaø ruïng.  Pha Prenyl: caân moät löôïng 150IU hoøa vaøo 1,5 ml dung dòch NaCl 0,9%.  Tieâm vôùi lieàu 0,1ml/ chuoät (töông ñöông vôùi noàng ñoä 10IU/ chuoät). 2.1.3.2. Moâi tröôøng giaûi phaãu PBS (Phosphate Buffer Saline) Caân hoãn hôïp muoái nhö sau : 8g NaCl + 0.2g KCl + 0.2g KH2PO4 + 2.285g Na2HPO4.12H2O Sau ñoù cho nöôùc caát 2 laàn vaøo cho ñuû 1000 ml. Ñem haáp khöû truøng 2.1.3.3. Dung dòch Trypsin/EDTA 0,25% Caùch pha:  Caân 0,25g trypsin hoøa vaøo 98ml PBS , boå sung 2ml EDTA 1%.  Loïc voâ truøng baèng phin loïc 0,22μm. 2.1.3.4. Moâi tröôøng nuoâi phoâi D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), boå sung 10% huyeát thanh thai boø (FBS – Fetal Bovin Serum). Caùch pha:  Caân 2g boät D’MEM vaø 0,74g NaHCO3 ,hoøa vaøo 150ml nöôùc caát 2 laàn.  Chænh pH töø 7,4 ñeán 7,5 baèng dung dòch HCl 1M. Sau ñoù boå sung nöôùc caát cho ñuû 200ml.  Boå sung 10% huyeát thanh .  Loïc baèng phin loïc 0,22μm.  Giöõ laïnh ôû -4 oC. 2.1.3.5. Hoùa chaát nhuoäm Alkaline phosphatse  Naphthol AS-BI (Sigma) - C18H15BrNO6P  Fast Blue BB Salt (Sigma) - 2C17H18ClN3O3 · ZnCl2 Hai dung dòch Fast Blue BB Salt vaø Naphthol AS-BI phosphate phaûi giöõ rieâng taïi nhieät ñoä – 20 C. Khi söû duïng troän laïi dung dòch treân vaø duøng lieàn, khoâng söû duïng neáu dung dòch troän quaù 30 phuùt. 2.1.3.6. Dung dòch Collagenase 1 mg/ml - 100 mg boät Collagenase II (Sigma) - Dung dòch PBS vöøa ñuû 100 ml Loïc voâ truøng baèng maøng loïc minipore 0,2 μm (Mini Start). Giöõ laïnh ôû – 4 o C 2.2. PHÖÔNG PHAÙP TIEÁN HAØNH 2.2.1. Phöông phaùp gaây ñoäng duïc chuoät caùi vaø cho thuï tinh töï nhieân 2.2.1.1. OÅn ñònh ñieàu kieän soáng cuûa chuoät  Chuoät nhaét ñöôïc oån ñònh ñieàu kieän soáng taïi phoøng thí nghieäm sinh lyù ngöôøi vaø ñoäng vaät khoaûng 3 – 5 ngaøy tröôùc khi gaây ñoäng duïc.  Chuoät ñöïc vaø chuoät caùi ñöôïc nuoâi rieâng trong chuoàng nhöïa, moãi chuoàng 4 – 5 con.  Chuoät._.