Báo cáo tổng kết đề tài - Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi

a từng được ai sử dụng để công bố trong bất kì công trình nào khác. Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã được ghi rõ nguồn gốc. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Trần Minh Hoàng iii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi LỜI CẢM ƠN Trong thực tế không có sự thành công nào mà không có sự giúp đỡ từ những người khác. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, đánh dấu kết thúc quãng thời gian học tập ở Trường Đại học Công nghệ TP.HCM tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ gia đình, thầy cô, bạn bè trong suốt bốn năm qua. Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo cơ hội cho tôi được học tập tại trường. Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tâm huyết trong quá trình giảng dạy suốt những năm qua. Xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Thị Hai đã cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã cung cấp cơ chất β-glucan và enzyme cellulase C20032; Ths. Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp bào tử nấm Linh chi. Cám ơn quý thầy cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện làm việc cho tôi và nhóm thực hiện đồ án. Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, nếu không có sự giúp đỡ của cô chắc chắn đồ án tốt nghiệp của tôi gặp rất nhiều thiếu sót. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những sự giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cám ơn! Sinh viên thực hiện Trần Minh Hoàng iv Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ x DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................... 2 3. Mục đích của đề tài ............................................................................................ 2 4. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 3 5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 3 6. Kết quả đạt được ban đầu .................................................................................. 3 7. Hạn chế của đề tài .............................................................................................. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 4 1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi ............................................................................ 4 1.1.1 Phân loại ....................................................................................................... 4 1.1.1.1 Phân loại theo khoa học ...................................................................... 4 1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc ................................................. 5 1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi ......................................................... 9 1.1.2.1 Cuống nấm .......................................................................................... 9 1.1.2.2 Mũ nấm ................................................................................................ 9 1.1.2.3 Thụ tầng ............................................................................................. 10 1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi .......................................................................... 10 1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi .................................................................. 14 1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi ............................. 15 1.1.4.1 Dinh dưỡng ........................................................................................ 15 1.1.4.2 Nhiệt độ ............................................................................................. 15 1.1.4.3 Độ ẩm ................................................................................................ 15 1.1.4.5 Không khí........................................................................................... 15 v Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.1.4.6 Ánh sáng .............................................................................................. 16 1.1.4.7 Trị số pH .............................................................................................. 16 1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi .................................................. 16 1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát ....................................................... 16 1.1.5.2 Triterpenoid ....................................................................................... 17 1.1.5.3 Hợp chất saponin .............................................................................. 21 1.1.5.4 Những thành phần khác .................................................................... 22 1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi ................................................................... 22 1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư .......................................................................... 22 1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch ....................................................... 23 1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa ................................................................... 24 1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường ............................................................ 24 1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi ......................................................... 24 1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma .................................................................. 27 1.2.1 Phân loại ..................................................................................................... 27 1.2.2 Lịch sử phát triển ....................................................................................... 27 1.2.3.1 Đặc điểm hình thái ............................................................................... 28 1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng ........................................................................... 29 1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma ...................................... 31 1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp ....................................... 31 1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase ............................................................................ 31 1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase ..................................................................... 33 1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase ............................................................................ 34 1.2.4.4 Hệ enzyme protease ............................................................................. 35 1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào ......................................................... 36 1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật ............................................................ 37 1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 ......................................................................... 41 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 44 vi Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất ........................................................................... 44 2.1.1 Vật liệu ..................................................................................................... 44 2.1.2 Nơi tiến hành ............................................................................................. 44 2.1.3 Thời gian thực hiện .................................................................................. 44 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 44 2.1.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 44 2.1.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 45 2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng ............................................................... 45 2.1.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 45 2.1.5.2 Môi trường sử dụng ............................................................................ 47 2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ............................ 49 2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch nuôi cấy .................................................................................................................. 53 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA ..................................................................................................................... 54 2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng ...................................................................................................................... 54 2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn ....................................................................................................................... 54 2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 .... 56 2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine ............................................................. 56 2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau .............. 56 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032 ........................................ 57 2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose ..................................................................... 57 2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase ..................................................... 58 2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến ............................................................ 59 2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine ..................................................................... 59 vii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 2.6.2 Phản ứng xác định hoạt tính protease ..................................................... 60 2.7 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucanase trong dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 ................................................................................................................... 60 2.7.1 Dựng đường chuẩn β-glucan ................................................................... 61 2.7.2 Phản ứng xác định hoạt tính β-glucanase ................................................ 61 2.8 Phương pháp xác định protein trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phầm C20032 bằng phương pháp Bradford ............................. 62 2.8.1 Dựng đường chuẩn Albumin .................................................................... 62 2.8.2 Xác định hàm lượng protein trong mẫu ................................................... 62 2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và enzyme chế phẩm C20032. ............................................................. 64 2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 ................................................... 64 2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. ........ 65 2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi ................................... 67 2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ....................................................................... 68 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 70 3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm C20032 10% và dịch nuôi cấy ............................................................................... 70 3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10% .................... 70 3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy lỏng .................................................................................... 71 3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn ..................................................................................... 72 3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn và chế phẩm C20032 10% ........................................................................................................... 73 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 ...................................................... 75 3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm viii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. ....................... 75 3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 10% ..................................................................................................................... 76 3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% ................................................ 77 3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum ............................... 81 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 85 4.1 Kết luận ........................................................................................................ 85 4.2 Kiến nghị ..................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 87 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 1 ix Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA: Potato Dextrose Agar EC: Enzyme cellulase C20032 DNC: Dịch nuôi cấy G. lucidum: Ganoderma lucidum T.harzianum: Trichoderma harzianum T. hamatum: Trichoderma hamatum T. polysporum: Trichoderma polysporum T. viride: Trichoderma viride T. reesei: Trichoderma reeisei B.cinerea: Botrytis cinerea T. hamatum: Trichoderma hamatum T. virens: Trichoderma virens BSA: Bovine serum albumin DD: Dung dịch TCA: Trichloacetic acid FC: Folin – Ciocalteu CMC: Sodium carboxymethyl cellulose DNS: acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic MT: Môi trường ĐC: Đối chứng TB: Trung bình NT: nghiệm thức x Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang 1 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở 11 các mẫu vật khác nhau 2 1.2 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở 25 các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5mg/ml) 3 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của T. harzianum 36 4 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong 40 chế phẩm 5 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của 41 Novozyme 6 2.1 Bảng dựng đường chuẩn glucosamine 56 7 2.2 Lập đường chuẩn glucose 58 8 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58 9 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59 10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60 11 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme 61 β-glucanase 12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61 13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62 14 2.9 Bảng bố trí sự thay đổi tỉ lệ enzyme DNC và chế phẩm 65 C20032 10% 15 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 68 16 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032 70 10% 17 3.2 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum 72 MT nuôi cấy lỏng iv Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 18 3.3 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T. harzianum 73 MT nuôi cấy rắn 19 3.4 Kết quả hoạt tính enzyme của DNC nấm T. harzianum và 74 chế phẩm C20032 10% 20 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện 75 nhiệt độ và pH thay đổi. 21 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong 77 chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5 22 3.7 Bảng kết quả % bào tử linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ 78 lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 23 3.8 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có 79 mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm 24 3.9 Bảng tổng hợp tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay 81 đổi nồng độ chế phẩm C20032 25 3.10 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có 82 mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng độ enzyme chế phẩm C20032 v Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC HÌNH STT Hình Nội dung Trang 1 1.1 Xích chi Ganoderma lucidum 5 2 1.2 Thanh chi Ganoderma genus 6 3 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis 6 4 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus 7 5 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus 7 6 1.6 Tử chi Ganoderma sinense 8 7 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc 8 8 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma 13 lucidum 9 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi 13 Ganodermataceae 10 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi 14 11 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại Triterpenoids trong bào 19 tử nấm Linh chi 12 1.12 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi 20 13 1.13 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi 28 trường thạch dịch chiết khoai tây PDA 14 1.14 Sợi nấm và cuống bào tử của T. harzianum 29 15 1.15 Cấu trúc chitin 31 16 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32 17 1.17 Cấu tạo cellulose 34 18 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của 38 vách tế bào 19 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 42 Novozyme vi Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 20 1.20 pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme 42 21 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 66 22 3.1 Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy 74 T.harzianum MT nuôi cấy lỏng và MT nuôi cấy rắn 23 3.2 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch 76 nuôi cấy nấm T. harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau 24 3.3 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có trong chế 77 phẩm C20032 10% điều kiện pH5 25 3.4a Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi khi chưa bị 78 phá vỡ 26 3.4b Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ soi dưới kính hiển vi khi 78 thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4 27 3.5 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay 79 đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 28 3.6 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay 82 đổi nồng độ chế phẩm C20032 29 3.7 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi 83 ngày thứ 7 (NT1: 1DNC: 1EC10%) 30 3.8 Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi soi dưới kính hiển vi 83 ngày thứ 10 (NT1: 1DNC: 1EC10%) vii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Sơ đồ Nội dung Trang 1 2.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm 50 2 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối 51 ưu của enzyme chitinase từ DNC nấm T. harzianum T2 3 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm 52 linh chi bằng enzyme DNC nấm T. harzianum T2 kết hợp chế phẩm EC 20032 4 2.4 Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu 53 enzyme dịch nuôi cấy 5 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp 64 giữa DNC và chế phẩm C20032 10% 6 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thay đổi nồng độ enzyme chế 69 phẩm C20032 kết hợp với DNC nấm T. harzianum T2 7 4.1 Quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương 86 pháp enzyme viii Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại dược phẩm quý, nó được sử dụng như một loại thượng dược trong các bài thuốc để điều trị một số căn bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe. Tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh chi trong việc điều trị người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc và nấu chúng trong nhiều giờ để tách các hoạt chất mà không chú ý đến thành phần, các biện pháp tách chiết các hoạt chất sao cho tối ưu. Bên cạnh đó, Tây y hiện đại cho rằng thảo dược không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể được xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi cũng được xếp vào loại thảo dược thực phẩm chức năng. Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam cho nên việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ sức khỏe, tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung bướu, tim mạch, huyết áp, tiểu đường Trong hai thập kỉ qua, các phương pháp phân tích khoa học hiện đại đã cho phép xác định được một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin, amino acid, phenol Trong đó Triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần chính có nhiều hoạt tính sinh học của nấm. Mặc dù có một lượng lớn các hoạt chất sinh học được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt chất sinh học này đa số đuợc thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu thực hiện việc trích ly các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi bởi bào tử được cấu tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững nên làm giảm khả năng chiết xuất các chất. Do đó, việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình phân tích thành phần các chất có trong bào tử. Để góp phần nghiên cứu việc chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi, tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 kết 1 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 được trình bày trong đồ án tốt nghiệp “NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI” 2. Tình hình nghiên cứu Các công trình nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong nấm Linh chi được thực hiện chủ yếu trên quả thể và tơ nấm. Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver (Canada) đã dành riêng một hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New York (Hoa Kỳ). Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc. Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc lập của họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc quý. Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm Hội thảo cho các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản. Tại mỗi Hội nghị số báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh chi. Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi. Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam. Gần đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào tiến trình này. Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch. Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng “súp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi bệnh (Lui Xing Jia, 1994). Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch và làm dịu thần kinh, Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun đã công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên men vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi. 3. Mục đích của đề tài Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi thu dịch chiết bào tử 2 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 4. Mục tiêu của đề tài Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp kết hợp enzyme chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm linh chi. 5. Phương pháp nghiên cứu Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm Đề tài được xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis Systems (SAS) 6. Kết quả đạt được ban đầu Tìm ra được phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp kết hợp chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum Xác định được tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi trên một lượng nhất định. 7. Hạn chế của đề tài Tỷ lệ bào tử phá vỡ còn thấp làm hạn chế việc định lượng hoạt chất trong dịch trích ly sau phá vỡ cũng như hiệu suất trích ly hoạt chất. 3 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên, hạnh nhĩ... Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần nông bản thảo kinh”, tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước . Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền. Từ đầu thế kỷ 17, nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng. Ngay từ thời Hoàng đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh chi. Trong “Bản thảo cương mục”, các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi trọng. Cho nên, dễ hiểu là các nhà Đông y Việt Nam kế tục Lý Thời Trân, đã phát hiện ra Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý của đất rừng Đại Nam”. 1.1.1 Phân loại 1.1.1.1 Phân loại theo khoa học Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae). Tên tiếng Anh là Varnished conk hay lingzhi. Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010) - Loài: Ganoderma lucidum - Chi: Ganoderma - Họ: Ganodermataceae - Bộ: Ganodermatales - Lớp phụ: Hymenomycetidae - Lớp: Hymenomycetes - Ngành phụ: Basidiomycotina - Ngành: Nấm thật – Eumycota - Giới: Nấm – Mycota hay Fungi Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này. Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác 4 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm (1881). 1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi. Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng chi có vị đắng. Tên khoa học là Ganoderma lucidum. Xích chi giúp ích tâm khí, chủ vị, tăng trí tuệ. Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực. Hình 1.1 Xích chi – Ganoderma lucidum Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua. Tên khoa học là Ganoderma genus. Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái. 5 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.2 Thanh chi Ganoderma genus Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng. Tên khoa học là Fomitopsis officinalis. Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi. Hình 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng. Tên khoa học là Laetiporus sulphureus. Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần. 6 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn. Tên khoa học là Polyporus melanopus. Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường. Hình 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt. Tên khoa học là Ganoderma sinense. Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứ...kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng kể khả năng hoạt động của các hoạt chất sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe. Ngoài ra, một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông cũng được sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi phí đầu tư cao. Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí. Nó có thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào tử nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic. Trong đồ án này, tôi đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng với chế phẩm enzyme Cellulase C32002 của Novozyme để phá vách bào tử nấm Linh chi. 26 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma Trichoderma là chi nấm khá phổ biến trong tự nhiên, tuy nhiên hệ thống phân loại của chúng chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác), nhiều loài trong chi này có khả năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng được tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000). 1.2.1 Phân loại - Giới (Kingdom): Nấm (Fungi) - Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota) - Lớp (Class): Sordariomycetes - Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae - Bộ (Order): Hypocreales - Họ (Family): Hypocreaceae - Chi (Genus): Trichoderma - Loài (Species) : Trichoderma spp. 1.2.2 Lịch sử phát triển Chủng nấm Trichoderma được phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả được 3 loài: 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết được 7 loài nấm Trichoderma đó là: 27 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). 4- Trichoderma aureum Pers. (1796). 5- Trichoderma laeve Pers. (1796). 6- Trichoderma dubium Pers. (1801). 7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801). Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma được mô tả. 1.2.3 Đặc điểm chung của Trichoderma 1.2.3.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.13 – Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành 28 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi tăng trưởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân nhánh mạnh, thường hình thành ở dạng gần như vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm thường mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Hình 1.14 – Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu vàng. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. 1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thường có mặt trong môi trường nuôi cấy loài nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng 29 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi của Trichoderma. Nhưng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trường nuôi cấy không nên có sự có mặt của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hưởng phần nào đến sự sinh trưởng của Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng trưởng được ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels, 2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng Trichoderma có tốc độ tăng trưởng nhanh, đường kính khuẩn lạc đạt trung bình 2 cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982). Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất hiện trong điều kiện sáng. Bào tử trên môi trường thạch agar dưới ánh sáng 85 Lux trong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio cảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút hoặc dưới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng từ 380 nm - 440 nm, và không hình thành bào tử ở bước sóng dưới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử cảm quang bị hạn chế phát triển dưới sự có mặt của các hóa chất như: azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum bromide, các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T. hazianum, T. viride và T. virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có acide thích hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trường trung tính. 30 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập được chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4). Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6), được sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp. còn sinh tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh: trichlorofore từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum. Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn sinh tổng hợp được một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh như: exo và endoglucanase, cellobiose và chitinase. 1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp đuộc nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease để phân hủy nguồn xác bã thực vật và vách tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình 1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase Chitin là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polymer ở nấm và côn trùng, có công thức hóa học [C8H13NO5]n Hình 1.15 – Cấu trúc chitin Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. 31 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, cồn, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. Chitinase là enzyme thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị β – 1,4 – N – acetyl glucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân làm 3 lớp (Sahai và Manocha, (1993)) 1. Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetyl chitobiose 2. Endochitinase: phân cắt liên kết bên trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacetyl chitobiose. Endochitinase có vai trò quan trọng trong quá trình ký sinh nấm. 3. β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer Glucosamin là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. Hình 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Người ta đã tinh chế được rất nhiều chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N – acetyl – β – D – glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra còn có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz et al, (1992)), chitobiosidase 40 kDa, enzyme này có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với enzyme endochitinase 42 kDa (Harman et al, (1993)), exochitinase 28 kDa (Deane et al,(1998)) và β – 1,4 – N – acetyl glucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây biểu hiện các enzyme thủy phân chitin khác nhưng chưa tinh chế được (Harman et al, (1995)). Chitinase ở Trichoderma spp. được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như β – glucanase, sự phối hợp giữa hai enzyme này làm tăng hiệu quả hoạt động thủy phân. Mặt khác, theo báo cáo của Lorito (1994) cho biết, có sự phối hợp tác động lên màng tế bào giữa enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như chất tổng hợp. 1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase β – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng β – 1,3 – glucan và nhánh là dạng β– 1,6 – glucan. β – glucanase cũng là một enzyme quan trọng của Trichoderma spp. trong đời sống hoại sinh và ký sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: β-1,3-glucanase và β-1,6-glucanase  β-1,3– glucanase: enzyme phân cắt liên kết o – glycosidic của β-1,3– glucan nhờ 2 cơ chế 1. Exo-β-1,3– glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên kết polymer 2. Endo-β-1,3– glucanase cắt liên kết β ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide, giải phóng oligosaccharide. Trichoderma spp. phân giải β-1,3– glucan thường kết hợp giữa 2 hoạt tính exo và endo- β-1,3– glucanase, β-1,3– glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra β-1,3– glucanase giúp thực vật chống lại mầm bệnh. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo vách tế bào của các loài nấm khác nhau, Trichoderma spp. tiết β– glucanase ở các mức độ khác nhau. Lorito năm 1994 đã tách 33 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi chiết in vitro được một endo - β-1,3– glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử B.cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase. Ở một số chủng khác như T. harzianum T – 24, El-Katatny (2001) đã tách chiết được một endo- β-1,3– glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rolfsii khi kết hợp với một endochitinase 43 kDa. Lorito (1995) đã tạo dòng gen của β-1,6– endoglucanase kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác.  β-1,6– glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp. tiết β-1,6– glucanase, enzyme này phân cắt liên kết β-1,6– glucan trong vách tế bào nấm. 1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase Hình 1.17 Cấu tạo cellulose Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D – glucose nối nhau bởi liên kết β – 1,4 – glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase. Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp. được phân thành 3 lớp: 1. Exo β-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) hay C1 giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose 2. Endo β-1,4-D-glucanase hay Cx phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc cellulose. 3. β-1,4-D- glucosidase phân cắt cello – oligosaccharide thành glucose khử. Quá trình thủy phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất là hai enzyme cellobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme β-glucosidase (Hui et 34 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi al, (2001)). T reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, T. harzianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả trong việc tạo ra nhiều loại cellulase. 1.2.4.4 Hệ enzyme protease Theo Delgado và Janara (2000) khi khảo sát trên T. harzianum đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, trong môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon T. harzianum tiết protease acid làm tác nhân điều hòa, đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase. Ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T. harzianum sinh ra trong môi trường có nguồn carbon khó bị phân hủy như vách tế bào nấm. Theo Haab (1990) đã tách chiết được một protease acid 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase. Một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000) đã tách chiết được một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin khi nuôi cấy T. harzianum. Protease của Trichoderma spp. có tác dụng thủy phân protein vốn là một phần của bộ khung vách tế bào. 35 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của Trichoderma harzianum Gen Hoạt tính Giống Tài liệu tham khảo Chitinase exc2 73 N- TM Haran et al (1995) excl/nagl 73 acetylglucosaminidase T25-1 Draborg et al - 64-69 T25-1, P1a (1995) - 28 T189 Peterbauer et al ech42 52 N- TM, TY (1996) chit42 42 acetylglucosaminidase IMI206040a Deane et al (1998) cht42 44 Endochitinase CECT 2413 Haran et al (1995) ThEn42 42 Endochitinase Gv2908 Carsolio et al - 42 O1a (1994) - 40 P1a Garcia et al (1994) chit36 37 CECT 2413 Back et al (1990) chit33 36 Chitobiosidase 109 Lorito et al (1998) - 33 Endochitinase TM Harman et al - 31 Endochitinase CECT 2413 (1993) - Endochitinase TM, TY Cruz et al (1992) - Endochitinase Viterbo et al (2001) Haran et al (1995) Glucanase bgn13.1 78 β-1,3-endoglucanase P1a, CECT Cruz et al (1992) - 74 2413 El Katatny et al - 36 β-1,3-endoglucanase T24 (2001) - 17 β-1,3-endoglucanase 39.1 b16-2 43 β-1,6-endoglucanase CECT 2413 Lorito et al (1998) lam1.3 110 β-1,3-exoglucanase CECT 2413 Lora et al (1995) - 75 β-1,3-exoglucanase T – Y Cohen – Kupiec et al (1999) 1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào Enzyme là protein trong tế bào, chúng được hình thành bởi các chuỗi đặc biệt của các axit amin mà kết hợp với nhau trong hình dạng khác nhau để làm các công việc đặc biệt như phá vỡ tạo thành đường và các phân tử chất béo, giải phóng hợp chất cao 36 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi phân tử bên trong tế bào hoặc làm ra nhiều enzyme hơn. Các enzyme khác nhau có chức năng riêng, việc ứng dụng chức năng của từng loại enzyme có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học. Ngay trong các tế bào vi khuẩn nhỏ nhất có thể có khoảng 1000 loại enzyme làm việc. Việc nghiên cứu ứng dụng các enzyme này có ý nghĩa thực tiễn với sự phát triển của khoa học đời sống, ứng dụng vào nhiều mặt kinh tế xã hội. Hiện nay trên thị trường Việt Nam có nhiều loại chế phẩm enzyme thương mại ứng dụng trên nhiều lĩnh vực. Ngành công nghiệp enzyme rất cần thiết cho các ngành công nghệ thực phẩm, nước giải khát, trong phân tích y học và trong công nghiệp, ngày nay chúng được thêm vào bột giặt để tăng hiệu quả giặt tẩy Chế phẩm enzyme thương mại thường được tổng hợp bởi thực vật, động vật, vi sinh vật hoặc nuôi cấy mô động, thực vật nhưng hiện nay đa số các enzyme thường được tổng hợp nhờ quá trình lên men vi sinh vật ở quy mô công nghiệp nhờ giá thành rẻ, hoạt tính cao, chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể dễ dàng điều khiển sinh tổng hợp enzyme theo chiều hướng có lợi theo nhu cầu vì vi vật có khả năng cảm ứng với môi trường nuôi cấy rất nhanh. 1.3.1 . Enzyme phá vách tế bào thực vật Vách tế bào thực vật được cấu tạo bởi vách cellulose bao phủ bề mặt màng nguyên sinh chất và không bào, bảo vệ các thành phần bên trong của tế bào. Hệ thống vách tế bào có mối tương quan sinh lý chặt chẽ tạo ra một hệ thống thẩm thấu có hiệu lực, vách tế bào dày lên đảm bảo cho sự cứng rắn, thực hiện được chức năng năng nâng đỡ. Ngoài ra vách tế bào còn giữ vai trò trong một số hoạt động hấp thu, thoát hơi nước, di chuyển và tiết. Trong quá trình hình thành vách, có nhiều thành phần hóa học khác nhau tham gia cấu tạo nên vách tế bào, những thành phần đó là cơ chất không định hình (matrix) có nhiều trong màng sơ cấp như pectin, hemicellulose làm chất xây dựng bộ khung sườn của vách, những chất này sắp xếp trong mạng tinh thể có dạng sợi. Cellulose là chất cơ sở chủ yếu để cấu trúc nên bộ khung sườn nằm trong cơ chất của vách. Vì vậy, đối với một số enzyme phá vách tế bào thực vật, cellulose đóng vai trò là cơ chất của quá trình thủy phân phá vách. 37 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Enzyme cellulolytic phân hủy cellulose, polymer cellulose chính là thành phần quan trọng của màng tế bào thực vật. Nhiều vi khuẩn sản xuất phức hợp enzyme cellulolytic gọi là cellulosomes, các enzyme cellulolytic được nấm tiết ra được gọi là cellulase. Hình 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của vách tế bào Dựa vào nghiên cứu của Ding và cộng sự (2013) sử dụng kính hiển vi nanomette vi mô cho thấy các enzyme phá vách tế bào từ nấm và vi khuẩn xâm nhập vào vách tế bào qua cấu trúc lỗ của vách, các enzyme này sử dụng cơ chất cellulose biến đổi thành đường. Nhờ các enzyme ứng dụng tiềm năng này làm cơ sở cho sản xuất các sản phẩm giá trị cao như ethanol hay axit hữu cơ từ các nguồn cellulose tái tạo rẻ tiền. Những tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu cellulosomes đang cung cấp thông tin 38 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi cơ bản cho sự phát triển nghiên cứu của cả in vitro và in vivo một cách hệ thống để nghiên cứu về các phương pháp phá vách tế bào ứng dụng trong công nghiệp. Trên thị trường Việt Nam, để phá vách tế bào chỉ có các chế phẩm enzyme cellulase công nghiệp có nguồn gốc từ Aspergillus spp. hoặc từ Trichoderma spp. Ứng dụng của các chế phẩm này thường được dùng để sản xuất ethanol công nghiệp hoặc axit hữu cơ công nghiệp. Mặc dù một số lượng lớn các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase, tuy nhiên vi sinh vật của chủng Trichoderma và Aspergillus được sử dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp bởi hoạt tính mạnh chi phí sản xuất thấp, hiệu quả thu hồi cao. Một số hãng sản xuất cũng đã ứng dụng hai chủng nấm trên để sản xuất enzyme thương mại cung cấp cho thị trường. 39 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong chế phẩm Tên enzyme Chủng vi sinh vật Enzyme hoạt động Hãng sản xuất Lysing Trichoderma Cellulase Sigma Poole UK Enzyme harzianum Protease Cat No L2265 Chitinase Lysing Trichoderma β-glucanase InterSpex Enzyme harzianum Cellulase Foster City USA Protease Cat No 0412 - 1 Chitinase Kitalase Rhizoctonia solani β-glucanase ICN FLOW Protease High Wycombe UK Pectinase Cat No 153527 Amylase Lysing Trichoderma Cellulase ICN FLOW Enzyme harzianum Protease High Wycombe UK Xylanase Cat No 152338 Chitinase Glucanex Trichoderma spp β-glucanase Novo Nordisk Ferment Ltd Neumatt CH Cat No 367 - 5106 Các enzyme cellulase thương mại được áp dụng để tăng chất lượng sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc. Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm cellulase sẽ mềm ra, làm tăng hệ số đồng hóa và chất lượng sản phẩm được tăng lên. Enzyme cellulase thương mại cũng làm tăng hiệu suất trích 40 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực vật như trà, cà phê, đậu nành Enzyme cũng làm thủy phân các nguyên liệu gỗ, phế liệu gỗ cho công nghiệp sản xuất giấy, ethanol 1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 Chế phẩm enzyme cellulase C20032 là sản phẩm thương mại của Novo Nordisk. Sản phẩm ngoài enzyme cellulase là chủ yếu còn có hệ enzyme chitinase, protease, β- glucanase. Hệ enzyme của C20032 được coi là phù hợp để nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bởi hệ enzyme trong chế phẩm nhìn chung có thể đáp ứng được khả năng phá cấu trúc vách chitin đôi của bào tử đảm nấm Linh chi. Bảng 1.5 Thông tin chế phẩm enzyme cellulase C20032 của Novozyme Chế phẩm Nhiệt độ tối ưu pH tối ưu Tính năng, ưu điểm C20032 45oC – 50oC 5 – 5,5 Cải thiện quá trình thủy phân cellulose khi kết hợp với CTec2. Hỗ trợ trong trường hợp tiền xử lý acid nhẹ hoặc kiềm. Chuyển đổi hemicellulose để đường lên men Hiệu quả ở nồng độ chất rắn cao. Tương thích với nhiều nguyên liệu Nồng độ cao và ổn định Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk 41 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Hình 1.19 Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk Hình 1.20. pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme Nguồn: Novozymes products – Novo Nordisk 42 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Việc sử dụng enzyme cellulase C20032 của Novozyme vào ứng dụng phá vách tế bào bào tử nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào hệ enzyme tìm thấy trong chế phẩm. Ngoài cellulase, các enzyme trong chế phẩm nghiên cứu còn cho thấy có sự xuất hiện của β-glucanase, protease, chitinase. 43 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất 2.1.1 Vật liệu  Mẫu thí nghiệm - Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh được cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến. Rây bào tử để loại bỏ một số tạp chất. Sấy ở nhiệt độ 40oC. Bảo quản trong điều kiện khô ráo. - Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp. HCM, cơ sở 1, 475A Điện Biên Phủ, P. 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM. 2.1.2 Nơi tiến hành Thí nghiệm được thực hiện tại trung tâm thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công nghệ TP. HCM, cơ sở 475A, Điện Biên Phủ, P.25, Q. Bình Thạnh, TP.HCM 2.1.3 Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ 10/03/2016 đến 15/06/2016 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 2.1.4.1 Thiết bị - Tủ cấy vi sinh - Tủ lạnh - Kính hiển vi quang học - Autoclave - Máy ly tâm - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Bếp từ - Máy nước cất - Bể điều nhiệt 44 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi - Máy lắc - Máy đo quang phổ UV 2.1.4.2 Dụng cụ - Erlen 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml - Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml - Cốc sứ - Ống đong 50ml, 100ml - Đĩa peti - Pipette thủy tinh 5ml, 10ml - Micropipette 100µl, 1000µl – đầu tuýp tương ứng - Ống ly tâm 50ml - Ống nghiệm - Đũa thủy tinh - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Bao nylon hấp, giấy báo, dây thun 2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng 2.1.5.1 Hóa chất - Dầu soi kính hiển vi - Tween 80 - β – glucan (30% w/w) - Thuốc thử Lugol + Iodine 1g + KI 2g + Nước cất 300 ml Hòa tan rồi giữ trong lọ tối màu - Bovine serum albumin (BSA) 0,1 mg/ml: Cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml. - Dung dịch thuốc thử Bradford: 45 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi +Coomassie Brilliant Blue G – 250: 0,01g + Ethanol tuyệt đối 4,7g + Acid phosphoric 85%: 8,5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. - HCl 0,2N - Đệm phosphate pH 7 (0,05M) - Dung dịch casein 1%: hòa tan 1g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate 0,05M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1N hoặc NaOH tới pH=7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm phosphate tới vạch - Na2CO3 6%: hòa tan 6g Na2CO3 trong nước cất, định mức tới 100ml - Dung dịch Trichloacetic acid (TCA) 5%: Hòa tan 5g TCA trong nước cất, định mức tới 100ml, lắc đều - Dung dịch tyrosine 1mM (1µmol/ml): cân 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và chuyển sang bình định mức 100ml, định mức tới vạch ta thu được dung dịch gốc 10mM. Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần bằng HCl 0,2N được dung dịch tyrosine 1mM - Thuốc thử Folin – Ciocalteu (gọi tắt là FC): pha loãng 5 lần bằng nước cất: 1 thể tích FC gốc + 4 thể tích H2O) - Đệm Natri acetate 0,05M - Dung dịch Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) 1% w/v CMC: cân chính xác 10g CMC, hòa tan trong đệm Natri acetate 0,05M - Dung dịch acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic (DNS): cân 20g DNS cho vào beaker 2000 ml, thêm khoảng 800 ml nước cất. Đặt beaker vào chậu nước 80oC khuấy đều; hòa tan 32g NaOH với 300 ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào dung dịch DNS, khuấy nhiệt ở 80oC. Tiếp tục thêm 600g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình 46 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi định mức 2000 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai tối màu. - Dung dịch lactose: hòa tan 0.12g lactose monohydrate với 80 ml nước cất, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch lắc đều. - Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose. - Dịch cơ chất β – D – glucan 1%: cân chính xác 3,334g β – D – glucan hòa trong 50 ml đệm Natri acetate 0,05M pH5, chuyển vào bình định mức 100ml, bổ sung đệm đến vạch. - Dung dịch Mononatri orthophosphate 0,2M: hòa tan 27,8g NaH2PO4 và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M: hòa tan 53,05g Na2HPO4.7H2O và định mức đến 1000 ml - Dung dịch acid acetic 0,2M: hòa tan 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml - Dung dịch Natri acetate 0,2M: cân 16,4g CH3COONa hòa tan bằng nước cất và định mức đến 1000 ml - Dung dịch đệm pH7: hút 39,0 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 61,0 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml - Dung dịch đệm pH6: hút 87,7 ml dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M trộn với 12,3 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M rồi định mức đến 200ml - Dung dịch đệm pH5: hút 14,8 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 35,2 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml - Dung dịch đệm pH4: hút 41,0 ml dung dịch acid acetic 0,2M trộn với 9,0 ml dung dịch natri acetate 0,2M rồi định mức đến 100ml 2.1.5.2 Môi trường sử dụng  Môi trường PDA D-Glucose 4g 47 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Agar 4g Dịch chiết khoai tây 200ml Cloramphenicol 0.005g pH: 6-7 Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây được cắt hạt lựu, cho vào cốc 2 lít, đong nước cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng 10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong.  Môi trường tăng sinh lỏng nấm Trichoderma harzianum - Glucose 1g - NH4NO3 0,5 g - MgSO4.7H2O 0,5 g - K2HPO4 0,7 g - KH2PO4 0,3 g - FeSO4.7H2O 0,01 g - ZnSO4 0,001 g - Cloramphenicol 0,005 g - Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6 – 7  Môi trường tăng sinh rắn nấm Trichoderma harzianum - Nấm linh chi nghiền 20g - Malt 5g - Dung dịch khoáng 10ml - Cao nấm men 0,5g - Chitin huyền phù 0,25g - Nước bổ sung 40ml - Độ ẩm 70%, pH5  Pha dung dịch khoáng + NH4NO3 0,5g + KH2PO4 0,2g 48 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi + NaCl 0,1g + MgSO4.7H2O 0,1g Hòa tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml  Môi trường chitin – agar 1% Đong 100ml dịch huyền phù chitin 1% vào bình môi trường Ducan bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa, mỗi đĩa khoảng 20ml môi trường.  Môi trường casein – agar 1% Đong 100ml dịch casein 1% vào bình môi trường bổ sung 2g agar, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội đến khoảng 50oC tiến hành đổ đĩa...chi có khả năng sản sinh enzyme giúp phá vách bào tử nấm hiệu quả hơn. - Điều kiện thí nghiệm chưa đầy đủ trang thiết bị khiến kết quả thí nghiệm có thể bị ảnh hưởng do có hiện tượng kết lắng bào tử dưới đáy ống nghiệm. Cần khảo sát trên máy lắc điều nhiệt để so sánh kết quả. - Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sau khi phá vách bào tử. - Định lượng được hoạt chất sau trích ly 87 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Lân Dũng (2010) Công nghệ nuôi trồng nấm. Tập 2, NXB Nông nghiệp. 2. Nguyễn Minh Khang, (2005). Khảo sát sinh trưởng nấm Linh Chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3. Trần Thị Huỳnh Mai. Tổng quan về quy trình phá vỡ bào tử nấm linh chi và bước đầu nghiên cứu điều kiện nảy mầm của bào tử này. Đồ án tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Kim Phi Phụng, (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 5. Lê Xuân Thám, (1996). Nấm Linh Chi nguồn dược liệu quý ở Việt Nam. Nhà xuất bản Mũi Cà Mau. 6. Nguyễn Thị Sáu (2014). Bài giảng công nghệ trồng và chế biến nấm, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 7. Nguyễn Văn Bá và cộng sự (2005). Giáo trình môn nấm học, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ 8. Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM 9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 10. Đinh Minh Hiệp (2007). Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học, Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM 11. Nguyễn Hoài Hương, Đỗ Thị Tuyến (2014). Giáo trình thực hành công nghệ enzyme, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 12. Đồng Thị Ngọc (2015). Bước đầu nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi, 88 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi đồ án tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 13. Nguyễn Trường Thọ (2004), “Luận văn thạc sĩ Nghiên cứu sử dụng nấm mốc Trichoderma harzianum phòng bệnh héo rũ cây dưa leo do Pythium sp.”, ĐH khoa học tự nhiên, ĐHQG. TPHCM  Tài liệu tiếng Anh 14. Boh B, et al. Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds. Biotechnol Annu Rev, 2007. 15. Borchers AT, et al. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol Med, 1999. 16. Báo cáo FDA 1/8/1999. 17. Borchers AT, et al. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol Med, 1999. 18. Bao X, et al. Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Carbohydr Res, 2005. 19. Bao XF, et al. Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum. Phytochemistry, 2002. 20. Bingji Ma, Wei Ren, Yan Zhou, Jinchuan Ma, Yuan Ruan, and Chun-Nan Wen, Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum. N Am J Med Sci. 2011 Nov; 3(11): 495–498. 21. Chen RY, Yu DQ. Studies on the triterpenoid constituents of the spores of Ganoderma Lucidum Karst. J Chine Pharm Sci. 1993;2(2):91–96. 22. Chen RY, Yu DQ. Application of 2D NMR techniques in the structure determination of ganosporelactone A and B. Acta Pharm Sin. 1991;26(6):430– 436. 23. Chaiyavat Chaiyasut*, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun, Breaking the spores of Ganoderma lucidum by fermentation with Lactobacillus plantarum. Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Chiangmai University, Thailand. Accepted 30 September, 2010. 89 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 24. Chen , Zhong JJ. p53 is important for the anti-invasion of ganoderic acid T in human carcinoma cells. Phytomedicine, 2010. 25. Chen X, et al. Monitoring of immune responses to a herbal immuno-modulator in patients with advanced colorectal cancer. Int Immunopharmacol. (1999). 26. Cao LZ, Lin ZB. Regulation on maturation and function of dendritic cells by Ganoderma lucidum polysaccharides. Immunol Lett. (2002). 27. De-hui Dai, Wei-lian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li. 2011. Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1. African Journal of Biotechnology Vol. 10(13), pp. 24762485. 28. Heim, Y. R. Li, Q. Chen, Z. Lin, D. Xia, L. Ma, 1992. Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst. Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih. 17 (4):266 – 8. 256 (1992). 29. Hikino H, et al. Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med. (1985). 30. Hikino H, et al. Mechanisms of hypoglycemic activity of ganoderan B: a glycan of Ganoderma lucidum fruit bodies. Planta Med. (1989). 31. Hansen, L. 1958. On the anatomy of the Danish species of Ganoderma. Bot. Tidsskrifft 54:333 – 352 (1958). 32. Hou CY, Sun YT, Yan L, et al. Studies on the chemical constituents of the spores from Ganoderma Lucidum. Acta Bot Sin. 1988;30(1):66–70. 33. Jungjing MA, Zhengyi FU, Peiyan MA, Yanli SU, Qingjie Z (2007). Breaking and characteristics of Ganoderma lucidum spores by high speed centrifugal shearing pulverizer. J. W uhan Univ. Tech-Mater. Sci. Ed. 22: 617- 621. 34. Jiang J, et al. Ganoderic acids suppress growth and invasive behavior of breast cancer cells by modulating AP-1 and NF-kappaB signaling. Int J Mol Med. (2008). 35. Jose D. Connolly, Rober A. Hill. Dictionary of terpenoid. Volume 1. Chapman & Hall. London. 1991. 90 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 36. Lui X. J.,1994. Hepatopathy and uterofunctional Bleeding mainly Treated with Ganoderma lucidum. Proc. 94 Inter. Sym. On Ganoderma Res., p58-9. Beijing, China, 1994. 37. Lee I, et al. Selective cholinesterase inhibition by lanostane triterpenes from fruiting bodies of Ganoderma lucidum. Bioorg Med Chem Lett. (2011). 38. Lin YL, et al. An immunomodulatory protein, Ling Zhi-8, induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB and MAPK pathways. J Leukoc Biol. (2009). 39. Mims. C. W., and F. Seabury. 1989. Ultrastructure of tube formation and basidiospores development in Ganoderma lucidum Mycologia 81: 754 – 764 (1989) 40. Min BS, Nakamura N, Miyashiro H, et al. Triterpenes from the spores of Ganoderma Lucidum and their inhibitory activity against HIV-1 protease. Chem Pharm Bull.1998;46(10):1607–1612 41. Min BS, Gao JJ, Nakamura N, et al. Triterpenes from the spores of Ganoderma Lucidum and their cytotoxicity against meth-A and LLC tumor cells. Chem Pharm Bull.1998;48(7):1026–1033. 42. Mau JL, Lin HC, Chen CC. Antioxidant properties of several medicinal mushrooms. J Agric Food Chem. (2001). 43. Ma J, et al. New lanostanoids from the mushroom Ganoderma lucidum. J Nat Prod. (2002). 44. Perreau. J. 1973. Contribution aletude des ornaments sporaux chez Ganodermes. Rev mycol. Paris 37:241 – 252 (1973). 45. Wachtel-Galor S, Tomlinson B, Benzie IF. Ganoderma lucidum ("Lingzhi"), a Chinese medicinal mushroom: biomarker responses in a controlled human supplementation study. Br J Nutr. (2011). 46. Wu Y, Wang D. A new class of natural glycopeptides with sugar moietydependent antioxidant activities derived from Ganoderma lucidum fruiting bodies. J Proteome Res. (2009). 91 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 47. Zhao, J.D.,Zhang, X.Q., 1994. Resources and taxonomy of lingzhi Ganoderma in China. Proc. 94 inter. Sym. On Ganoderma Res.:44 – 47. Beijing, China, 1994. 48. Richard A. Dixon, 2013, Microbiology: Break down the walls, Nature 493, 36 – 37, ISSN 0028 – 0836 49. Patent CN 1165032A, Method for breaking cell wall of Ganoderma lucidum spore, 1997 50. Altomare, C.Norwell, W.A. Bjokman, T. Harman, G.E (1999), “Solubiliation of phosphate and micronutrients by the plant – growth promoting and biocontrol fungus Trichoderma harzianum Rifai 1295 – 22”, Applied and Environmental Microbiology, pp. 2926 – 2933. 51. De la Cruz, J., Llobell, A (1999), “Purification and properties of a basis endo- β-1,6-glucanase from the antagonistic fungus Trichoderma harzianum”, Journal of Biochemistry, vol 265, pp.145 – 151. 52. De la Cruz, J., Pintor-Toro, J.A., Bennitez, T., LLobel, A., Romero, L., C. (1995), “ A novel endo-β-1,3-glucanase, BGN13.1 involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum”, Journal of Bacteriology, vol 177, pp. 6397 – 6945. 53. El-Katatny, M.H., Gudelj, M., Robra, K.H., Elnaghy, M.A., Gubitz, G.M. (2000), “Characterization of chitinase and an endo-β-1,3-glucanase from Trichoderma harzianum”, Applied Microbiology and Biotechnology, vol 10, pp.1 – 17 54. Harman, G.E, Howell, C.R., Viterbo, A.Chet, I., Lorito, M (2004), “Trichoderma species – opportunistic, avirulent plant symbionts” Nature reviews microbiology, vol. 154, pp 131 – 135 55. Lorito, M.Farkas, V., Rebuffat, S., Kubicek, C.P (1996), “Cell wall synthesis is a major target of mycoparasitic antagonism by Trichoderma harzianum”, Journal of Bacteriology, pp. 6328-6385 56. Lorito, M., Petebauer, C., Hayes, C.K., Harman, G.E (1994), “ Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different 92 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi antifungal compounds enhances inhibition of spore germination”, Microbiology, vol. 140, vol 178, pp 623 – 629.  Tài liệu internet 57. https://lib.lhu.edu.vn/ViewFile/10103 58. Method ME015. Extraction of triterpenoid saponins from plants. 866-995- 5100 | mwave@milestonesci.com 59. Phytother. Res.(2008), DOI: 10.1002/ptr.2707 (Zhang et al.). www.interscience.wiley.com 60. P A113&dq=optimum+temperature+for+chitinase&source=bl&ots=yknWbO MMME &sig=pt5A8prvnO337mhdrrFw9y2lisE&hl=vi&sa=X&ei=4qOU9X5H8qws QT5loDYCw&ved=0CEEQ6AEwAw#v=onepage&q=optimum%20te mperature%20for%20chitinase&f=false 61. PA 145&dq=invertase+from+trichoderma+harzianum&source=bl&ots=EdlpYo3 Hd3& sig=G0IfLKqGeorHtG4rVeD6lgI_Id0&hl=vi&sa=X&ei=qQbAU9_2NML0 8QXp8 oKwBw&ved=0CEUQ6AEwAw#v=onepage&q=sucrose&f=false 62. 63. https://www.flickr.com 64. https://www.shutterstock.com 65. 66. enzyme-preparations-protoplast-formation-aspergillus 93 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi PHỤ LỤC Bảng phụ lục 1 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 2 Đối chứng NT1 NT2 % 0,85% ± 0,22 0,71% ± 0,24 NT3 NT4 NT5 % 5,33% ± 1,19 4,19% ± 1,01 0,78% ± 0,33 Bảng phụ lục 2 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 3 Đối chứng NT1 NT2 % 2,49% ± 0,33 3,41% ± 0,64 NT3 NT4 NT5 % 13,29% ± 0,81 8,03% ± 0,65 4,98% ± 0,53 1 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng phụ lục 3 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi thể tích yếu tố enzyme kết hợp ở ngày thứ 4 Đối chứng NT1 NT2 % 3,20% ± 0,85 3,91% ± 1,05 NT3 NT4 NT5 % 18,55% ± 0,85 10,95% ± 1,17 6,47% ± 0,96 Bảng phụ lục 4 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 4 Đối chứng NT1 NT2 % 18,98% ± 0,57 14,78% ± 0,89 NT3 NT4 NT5 % 5,19% ± 0,86 3,91% ± 0,65 2,70% ± 0,65 2 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Bảng phụ lục 6 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 7 Đối chứng NT1 NT2 % 21,46% ± 0,96 17,20% ± 0,81 NT3 NT4 NT5 % 6,47% ± 0,75 4,83% ± 0,65 3,70% ± 0,69 Bảng phụ lục 7 - Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ dưới kính hiển vi khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 ở ngày thứ 10 Đối chứng NT1 NT2 % 24,45% ± 1,86 18,76% ± 1,54 NT3 NT4 NT5 % 7,39% ± 0,65 6,18% ± 0,86 4,26% ± 0,77 3 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ ANOVA XỬ LÝ ANOVA ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO NGÀY 4 NGÀY 7 VÀ NGÀY 10 VỚI SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ ENZYME CHẾ PHẨM (10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%) GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT2: 3.93 U/g DNC + 3.20 U/g EC 5% NT3: 3.93 U/g DNC + 0.64 U/g EC 1% NT4: 3.93 U/g DNC + 0.32 U/g EC 0.5% NT5: 3.93 U/g DNC + 0.064 U/g EC 0.1% KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Ngay4 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 639.1753733 159.7938433 295.07 <.0001 Error 10 5.4154000 0.5415400 Corrected Total 14 644.5907733 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.991599 8.076689 0.735894 9.111333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Ngay4 4 639.1753733 159.7938433 295.07 <.0001 4 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.54154 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3388 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay4 A 18.9767 3 NT1 B 14.7833 3 NT2 C 5.1867 3 NT3 C D C 3.9100 3 NT4 D D 2.7000 3 NT5 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.54154 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 1.9043 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay4 A 18.9767 3 NT1 B 14.7833 3 NT2 C 5.1867 3 NT3 C D C 3.9100 3 NT4 D D 2.7000 3 NT5 5 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 7 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 5 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Ngay7 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 6 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 778.5574400 194.6393600 321.16 <.0001 Error 10 6.0606000 0.6060600 Corrected Total 14 784.6180400 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.992276 7.253993 0.778499 10.73200 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Ngay7 4 778.5574400 194.6393600 321.16 <.0001 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 7 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.60606 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.4163 6 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay7 A 21.4667 3 NT1 B 17.1967 3 NT2 C 6.4700 3 NT3 D 4.8300 3 NT4 D D 3.6967 3 NT5 The SAS System 19:15 Thursday, June 20, 2016 8 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.60606 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 2.0145 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay7 A 21.4667 3 NT1 B 17.1967 3 NT2 C 6.4700 3 NT3 C D C 4.8300 3 NT4 D D 3.6967 3 NT5 7 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 10 The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Ngay10 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 956.2338667 239.0584667 175.57 <.0001 Error 10 13.6158667 1.3615867 Corrected Total 14 969.8497333 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.985961 9.535852 1.166870 12.23667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Ngay10 4 956.2338667 239.0584667 175.57 <.0001 The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.361587 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.1228 8 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay10 A 24.5833 3 NT1 B 18.7633 3 NT2 C 7.3900 3 NT3 C D C 6.1833 3 NT4 D D 4.2633 3 NT5 The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.361587 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 3.0195 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay10 A 24.5833 3 NT1 B 18.7633 3 NT2 C 7.3900 3 NT3 C D C 6.1833 3 NT4 D D 4.2633 3 NT5 9 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi XỬ LÝ ANOVA ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO NGÀY 2, NGÀY 3, NGÀY 4 VỚI SỰ THAY ĐỔI TỈ LỆ ENZYME PHỐI HỢP GIỮA DỊCH NUÔI CẤY VÀ ENZYME CHẾ PHẨM GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC NT2: 6.40 U/g EC 10% NT3: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT4: 3.93 U/g DNC + 12.8 U/g EC 10% NT5: 7.86 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 2 The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NGAY2 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 58.97836000 14.74459000 27.93 <.0001 Error 10 5.27940000 0.52794000 Corrected Total 14 64.25776000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.917840 30.60635 0.726595 2.374000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NGAY2 4 58.97836000 14.74459000 27.93 <.0001 The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 10 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.52794 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.3219 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGAY2 A 5.3300 3 NT3 A A 4.1933 3 NT4 B 0.8533 3 NT1 B B 0.7833 3 NT5 B B 0.7100 3 NT2 The SAS System 09:20 Thursday, July 15, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.52794 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 1.8802 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N NGAY2 A 5.3300 3 NT3 A A 4.1933 3 NT4 B 0.8533 3 NT1 B B 0.7833 3 NT5 B B 0.7100 3 NT2 11 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 3 The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Ngay3 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 229.1097733 57.2774433 153.00 <.0001 Error 10 3.7436000 0.3743600 Corrected Total 14 232.8533733 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.983923 9.493891 0.611850 6.444667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Ngay3 4 229.1097733 57.2774433 153.00 <.0001 The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.37436 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.1131 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay3 A 13.2933 3 NT3 B 8.0300 3 NT4 C 5.0033 3 NT5 D 3.4100 3 NT2 D D 2.4867 3 NT1 12 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 22:01 Thursday, June 20, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.37436 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 1.5833 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay3 A 13.2933 3 NT3 B 8.0300 3 NT4 C 5.0033 3 NT5 D 3.4100 3 NT2 D D 2.4867 3 NT1 KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4 The SAS System 20:20 Thursday, June 20, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.361587 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 3.0195 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay10 A 24.5833 3 NT1 B 18.7633 3 NT2 C 7.3900 3 NT3 C D C 6.1833 3 NT4 D D 4.2633 3 NT5 13 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Ngay4 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 470.0384933 117.5096233 135.53 <.0001 Error 10 8.6706000 0.8670600 Corrected Total 14 478.7090933 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.981888 10.72683 0.931161 8.680667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Ngay4 4 470.0384933 117.5096233 135.53 <.0001 The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.86706 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.694 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay4 A 18.5500 3 NT3 B 10.9433 3 NT4 C 6.4667 3 NT5 D 3.9100 3 NT2 D D 3.5333 3 NT1 14 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi The SAS System 21:48 Thursday, June 20, 2016 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.86706 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 2.4096 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N Ngay4 A 18.5500 3 NT3 B 10.9433 3 NT4 C 6.4667 3 NT5 D 3.9100 3 NT2 D D 3.5333 3 NT1 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO VỚI SỰ THAY ĐỔI THỂ TÍCH DỊCH NUÔI CẤY VÀ ENZYME CHẾ PHẨM GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC NT2: 6.40 U/g EC 10% NT3: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT4: 3.93 U/g DNC + 12.8 U/g EC 10% NT5: 7.86 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 2 The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 1 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 0.8533333 0.2150194 NT2 3 0.7100000 0.2424871 NT3 3 5.3300000 1.1889912 NT4 3 4.1933333 1.0075879 NT5 3 0.7833333 0.3251666 Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ 15 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 3 The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 2 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 2.4866667 0.3262412 NT2 3 3.4100000 0.6400000 NT3 3 13.2933333 0.8064945 NT4 3 8.0300000 0.6513831 NT5 3 4.9733333 0.5337915 Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ NGÀY 4 The SAS System 19:28 Thursday, July 5, 2016 3 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 3.2000000 0.8500000 NT2 3 3.9100000 1.0531382 NT3 3 18.5500000 0.8500000 NT4 3 10.9433333 1.1717224 NT5 3 6.4666667 0.9617345 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ĐẾM HỒNG CẦU TẾ BÀO VỚI SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ ENZYME CHẾ PHẨM (10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%) GIẢI THÍCH NT1: 3.93 U/g DNC + 6.40 U/g EC 10% NT2: 3.93 U/g DNC + 3.20 U/g EC 5% NT3: 3.93 U/g DNC + 0.64 U/g EC 1% NT4: 3.93 U/g DNC + 0.32 U/g EC 0.5% NT5: 3.93 U/g DNC + 0.064 U/g EC 0.1% KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 4 The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 1 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 18.9766667 0.5669509 NT2 3 14.7833333 0.8895130 NT3 3 5.1866667 0.8639637 NT4 3 3.9100000 0.6513831 NT5 3 2.7000000 0.6513831 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ 16 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 7 The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 2 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 21.4666667 0.9620984 NT2 3 17.1966667 0.8064945 NT3 3 6.4700000 0.7474624 NT4 3 4.8300000 0.6513831 NT5 3 3.6966667 0.6864644 Ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỦ LÝ NGÀY 10 The SAS System 19:57 Thursday, July 5, 2016 3 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ NT1 3 24.4500000 1.8610750 NT2 3 18.7633333 1.5392964 NT3 3 7.3900000 0.6513831 NT4 3 6.1833333 0.8550049 NT5 3 4.2633333 0.7682664 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY NẤM TRICHODERMA T2 Ở pH VÀ NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH4 The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 1 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 0.1104865 0.0032428 nhietdo40 3 0.1261317 0.0122975 nhietdo50 3 0.1272248 0.0097314 nhietdo60 3 0.1070022 0.0031774 nhietdo70 3 0.0367013 0.0139166 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ 17 Nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH5 The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 2 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 0.1508634 0.0041619 nhietdo40 3 0.1568755 0.0074831 nhietdo50 3 0.1697196 0.0010518 nhietdo60 3 0.1503851 0.0038088 nhietdo70 3 0.0842517 0.0200863 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH6 The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 3 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 0.1337151 0.0084183 nhietdo40 3 0.1349449 0.0088132 nhietdo50 3 0.1428017 0.0040076 nhietdo60 3 0.1274297 0.0018933 nhietdo70 3 0.0772148 0.0108499 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE Ở PH7 The SAS System 20:20 Thursday, July 5, 2016 4 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 0.1049526 0.0016693 nhietdo40 3 0.1057724 0.0015108 nhietdo50 3 0.1177284 0.0092663 nhietdo60 3 0.1085052 0.0040372 nhietdo70 3 0.0940214 0.0217549 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CHITINASE CÓ TRONG CHẾ PHẨM CELLULASE Ở PH5 The SAS System 20:35 Thursday, July 5, 2016 1 The MEANS Procedure Variable N Mean Std Dev ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ nhietdo30 3 2.3447290 0.0204959 nhietdo40 3 2.4540404 0.0426656 nhietdo50 3 2.4813683 0.0313080 nhietdo60 3 2.2695775 0.0313080 nhietdo70 3 2.1875939 0.0118333 ƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒƒ 18