Báo cáo Đề tài - Nghiên cứu quy trình chiết tách chất màu tự nhiên từ hoa đậu biếc (clitoria ternatean) và ứng dụng trong chế biến một số thực phẩm

iến một số thực phẩm. Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Tuyết Danh sách cán bộ tham gia chính: STT Họ và tên Học vi Chức danh Đơn vị công tác 1 Trần Thị Duyên Thạc sỹ Giảng viên Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu Nội dung chính: Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm:  Xây dựng quy trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc  Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu và độ bền màu của anthocyanin  Khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin  Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin  Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin  Nghiên cứu tính kháng khuẩn và ứng dụng chất màu tự nhiên anthocyanin vào một số thực phẩm. Kết quả đạt được: Đề tài tiến hành khảo sát được một số yếu tố tối ưu trong quá trình trích ly chất màu tự nhiên anthocyanin từ hoa đậu biếc. Tiến hành trích ly với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (hoa đậu biếc: etanol) là 1:10, tại nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h. Khảo sát ứng dụng của bột hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm và tính kháng khuẩn của bột đối với vi khuẩn lactic và nấm men:  Bột khi ứng dụng vào thực phẩm có màu xanh biếc rất bắt mắt.  Bột không có tính kháng khuẩn nên sử dụng được trong thực phẩm có chứa vi khuẩn lactic và nấm men. Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2018 – 7/2020 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký và ghi rõ họ tên) ii MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.v DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................ix LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4 1.1. Hoa đậu biếc .............................................................................................. 4 1.1.1. Tên khoa học và mô tả ........................................................................ 4 1.1.2. Phân bố ................................................................................................ 5 1.1.3. Công dụng ........................................................................................... 5 1.1.4. Thành phần hóa học của hoa đậu biếc ................................................. 6 1.2. Tổng quan về chất màu thực phẩm ............................................................ 8 1.2.1. Tầm quan trọng của chất màu trong chế biến thực phẩm ................... 8 1.2.2. Vai trò chất màu thực phẩm ................................................................ 8 1.2.3. Phân loại chất màu thực phẩm ............................................................ 9 1.3. Giới thiệu về chất màu anthocyanin ........................................................ 11 1.3.1. Khái niệm vế chất màu anthocyanin ................................................. 11 1.3.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin ................................................... 11 1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học của các anthocyanin .............................. 14 1.3.4. Khái niệm về các chất màu pyranoanthocyanin ................................ 19 1.3.5. Chức năng sinh học và ứng dụng của anthocyanin ........................... 20 1.4. Tổng quan về các phương pháp chiết .................................................... 22 1.4.1. Các khái niệm cơ bản về quá trình chiết ........................................... 22 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết .......................................... 23 1.4.3. Các phương pháp chiết ...................................................................... 25 1.4.4. Vài kỹ thuật chiết hiện đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên .... 25 1.5. Tình hình nghiên cứu, khai thác và sử dụng anthocyanin tự nhiên ......... 28 1.5.1. Tình hình trên thế giới ............................................................................ 28 1.5.2. Tình hình trong nước .............................................................................. 29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 31 2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiêm cứu .................................................... 31 i 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................... 31 2.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 31 2.2.1. Quy trình đề xuất để chiết tách chất màu từ hoa đậu biếc ................ 31 2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly chất màu từ hoa đậu biếc .......................................................................................... 33 2.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin ....................................................................................................... 34 2.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ hoa đậu biếc ........................................................................................................... 36 2.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khả năng trích ly ...37 2.2.6. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc ............................................................................. 38 2.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc ............................................................................. 40 2.2.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trích ly anthocyanin ....................................................................................................... 41 2.2.9. Khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc ............................................................................. 42 2.2.10. Khảo sát sự ảnh hưởng hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột hoa đậu biếc sau khi sấy phun ........................................................................ 44 2.2.11. Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun của hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm .................................................................................................. 44 2.2.12. Khảo sát sự ảnh hưởng của bột và cao boa đậu biếc đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm....................................................... 45 2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 46 2.3.1. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu .................................... 46 2.3.2. Phương pháp định tính thành phần cao ............................................. 46 2.3.3. Phương pháp xác định tính kháng khuẩn .......................................... 47 2.3.4. Phương pháp phân tích cảm quan ..................................................... 48 2.3.5. Phương pháp cô quay chân không..................................................... 51 ii 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp vi sai ........................................................................................................... 51 2.3.7. Phương pháp xác định hiệu xuất chiết .............................................. 52 2.3.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ............................................. 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN .............................. 53 3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố trích ly ........................................................... 53 3.1.1. Ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc .................................................................................................... 53 3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc .................................................................................................. 55 3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ hoa đậu biếc ......... 56 3.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly ... 57 3.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc .................................................................................................... 59 3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc .................................................................................................... 60 3.1.7. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc .................................................................................................. 62 3.1.8. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc ........................................................................................................... 63 3.1.9. Ảnh hưởng của hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột màu hoa đậu biếc .................................................................................................... 64 3.2. Định tính anthocyanin .............................................................................. 65 3.3. Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun của hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm ......................................................................................................... 66 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của bột và cao boa đậu biếc đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm........................................................... 71 3.5. Quy trình hoàn thiện cho trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc...73 3.6. Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm .................................................... 74 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 75 4.1. Kết luận .................................................................................................... 75 iii 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 77 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 80 Phụ lục 1. Kết quả xử lý ANOVA cho các thí nghiệm ........................................ 80 Phụ lục 2. Một số thiết bị sử dụng khi làm đồ án ................................................. 86 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton. DMSO: Dimethyl sulfoxit, là một hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO. TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB. v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây hoa đậu biếc ......................................................................................... 4 Hình 1.2. Hoa đậu biếc ................................................................................................ 4 Hình 1.3. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin .......................................... 12 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của các anthocyanidin thường gặp trong tự nhiên ........ 13 Hình 1.5. Ví dụ về cấu trúc của một anthocyanin phức tạp (delphinidin 3,7,3’,5’-tetra-(6-O-p-coumaroyl-β-glucosid)) .................................... 13 Hình 1.6. Sự thay đổi cấu trúc phân tử và màu sắc của anthocyanin theo pH .......... 15 Hình 1.7. Sự tổ hợp màu liên phân tử giữa delphinidin 3-glucosid và rutin tạo thành ra 2 dạng phức: phức kẹp (A) và phức song song (B) .............................................. 18 Hình 1.8. Sự tổ hợp màu nội phân tử của các antyhocyanin acyl hóa ...................... 19 Hình 1.9. Cấu trúc phân tử của một số pyranoanthocyanin ...................................... 20 Hình 1.10. Sơ đồ thiết bị chiết SFE .......................................................................... 27 Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị chiết ASE .......................................................................... 27 Hình 1.12. Một số dạng sản phẩm anthocyanin thương mại .................................... 29 Hình 2.1. Quy trình chiết tách màu anthocyanin từ hoa đậu biếc ............................. 32 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi thích hợp .............................................. 34 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm chọn nồng độ dung môi thích hợp ................................ 35 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp ........................................................ 36 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp .................. 38 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ chiết thích hợp ....................................... 39 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết thích hợp ...................................... 41 Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết thích hợp ............................... 42 Hình 2.9. Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết thích hợp ........................................... 43 Hình 3.1. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ 60oC ............................................................... 53 Hình 3.2. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ 60oC sau 12h .................................................. 53 Hình 3.3. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ thường ............................................................ 53 Hình 3.4. Mẫu nước chiết ở nhiệt độ thường sau 12h ............................................... 53 Hình 3.5. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ 60oC .................................................................. 54 Hình 3.6. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ 60oC sau 12h .................................................... 54 Hình 3.7. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ thường .............................................................. 54 vi Hình 3.8. Mẫu cồn chiết ở nhiệt độ thường sau 12h ................................................. 54 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin ........ 55 Hình 3.10. Màu sắc anthocyanin của hoa đậu biếc ở môi trường pH từ 1-14 .......... 56 Hình 3.11. Dãy đổi màu của anthocyanin trong pH(ph = 5÷9) ................................ 57 Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin ............................................................................................................... 58 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết anthocyanin ...................... 59 Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết anthocyanin ..................... 61 Hình 3.15. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin ..... 62 Hình 3.16. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin ................. 63 Hình 3.17. Màu của từng loại bột với khối lượng maltodextrin tương ứng ............. 64 Hình 3.18. Định tính mẫu bột màu ............................................................................ 65 Hình 3.19. Định tính dung dịch chiết ........................................................................ 65 Hình 3.20. Ứng dụng của mẫu bột chứa 20g maltodextrin ....................................... 66 Hình 3.21. Ứng dụng của mẫu bột chứa 25g maltodextrin ....................................... 66 Hình 3.22. Ứng dụng của mẫu bột chứa 30g maltodextrin ....................................... 67 Hình 3.23. Sản phẩm chứa 2g bột rau câu ............................................................ 67 Hình 3.24. Sản phẩm chứa 4g bột rau câu ............................................................ 67 Hình 3.25. Sản phẩm chứa 6g bột rau câu ................................................................ 68 Hình 3.26. Sản phẩm chứa 40g nếp .......................................................................... 68 Hình 3.27. Sản phẩm chứa 50g nếp .......................................................................... 68 Hình 3.28. Sản phẩm chứa 60g nếp .......................................................................... 69 Hình 3.29. Sản phẩm chứa 40g bột bánh bò ............................................................. 69 Hình 3.30. Sản phẩm chứa 50g bột bánh bò ............................................................. 69 Hình 3.31. Bánh bao sau khi tạo hình ....................................................................... 70 Hình 3.32. Bánh bao chứa 0,8g bột màu ................................................................... 70 Hình 3.33. Bánh bao chứa 1g bột màu ...................................................................... 70 Hình 3.34. Bánh bao chứa 1,2g bột màu ................................................................... 70 Hình 3.35. Môi trường lỏng vi khuẩn Lactic ............................................................ 71 Hình 3.36. Môi trường hansen của nấm men ............................................................ 71 Hình 3.37. Khả năng kháng nấm men của bột màu .................................................. 72 Hình 3.38. Khả năng kháng nấm men của cao chiết ................................................. 72 vii Hình 3.39. Khả năng kháng lactic của bột màu ........................................................ 72 Hình 3.40. Khả năng kháng lactic của cao chiết ....................................................... 72 Hình 3.41. Quy trình hoàn thiện trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc.....73 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Chức năng các thành phần của cây hoa đậu biếc ....................................... 5 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây hoa đậu biếc ................................................. 6 Bảng 1.3. Liều sử dụngcho phép của một số chất màu hữu cơ tổng hợp ................... 9 Bảng 1.4. Một số chất màu tự nhiên thông dụng ...................................................... 10 Bảng 1.5. Các nhóm chính của anthocyanin ............................................................. 12 Bảng 2.1. Tỷ lệ nguyên liệu/etanol...37 Bảng 2.2. Điểm chất lượng sản phẩm bột màu từ hoa đậu biếc ............................... 50 Bảng 3.1. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với các nồng độ dung môi khác nhau .................................................................................................. 55 Bảng 3.2. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với các tỉ lệ nguyên liệu/dung môi khác nhau .............................................................................. 58 Bảng 3.3. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly ở các nhiệt độ khác nhau .................................................................................................................. 59 Bảng 3.4. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với các khác khoảng thời gian khác nhau ...................................................................................... 61 Bảng 3.5. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly bằng hai phương pháp khác nhau ............................................................................................ 62 Bảng 3.6. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với số lần chiết khác nhau .................................................................................................................. 63 Bảng 3.7. Bảng định tính mẫu hoa đậu biếc ............................................................. 66 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá chất lượng bột màu anthocyanin từ hoa đậu biếc ......... 74 ix LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề bài Chất màu thực phẩm là một phụ gia thực phẩm (PGTP) quan trọng, được sử dụng không chỉ trong chế biến thực phẩm mà cả trong công nghiệp mỹ phẩm (kem trang điểm, thuốc nhuộm tóc, ), dược phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác. Nhu cầu về chất màu thực phẩm rất lớn và không ngừng tăng lên trong những năm gần đây [33]. Nước ta do chưa sản xuất được chất màu thực phẩm nên tất cả đều phải nhập từ nước ngoài. Một số trường hợp, sử dụng chất màu không đủ tiêu chuẩn gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người dùng. Vì thế, nghiên cứu cây nhuộm màu thực phẩm và các chất màu từ chúng có ý nghĩa quan trọng đối với kinh tế xã hội của đất nước. Anthocyanins, thuộc nhóm flavonoid, là sắc tố trong không bào thực vật tan trong nước chịu trách nhiệm về màu đỏ sáng, tím hoặc màu xanh của hoa, vỏ, hạt, quả và lá. Nguồn cung cấp anthocyanin chính trong quả ăn được là nho, anh đào, mận, mâm xôi, dâu tây, táo, đào, việt quất... Nhóm rau có chứa sắc tố anthocyanin là cà tím, bắp cải tím, tía tô, hoa đậu biếc... Cường độ và độ bền màu anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần cấu trúc, nồng độ chất màu, pH, nhiệt độ, ánh sáng, sự hiện diện của các chất màu khác, ion kim loại, enzyme, oxy, vitamin C và đường, [14], [20]. Bên cạnh các tính năng màu sắc của chúng, anthocyanins có gần đây đã thu hút sự quan tâm nhiều hơn do chúng còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí cho sức khỏe như khả năng chống oxy hóa, chống dị ứng, chống các tia phóng xạ, chống viêm, chống vi khuẩn, chống đông huyết tạo các bệnh mạch vành và có tác dụng bảo vệ tim mạch và thuốc giãn mạch vành [25], [19]. Anthocyanins không có độc tính và không có bất kỳ giới hạn tối đa cho các ứng dụng trong thực phẩm. Chúng được ứng dụng rộng rãi trong các hoạt động sản xuất công nghiệp. Chất màu anthocyanin có thể được nghiên cứu dựa vào ảnh hưởng có lợi của chúng đối với sức khỏe con người [21] và các ứng dụng của chúng như sự lựa chọn tiềm năng để thay thế màu sắc tự nhiên trong thực phẩm [26]. Do vậy, nghiên cứu sử dụng anthocyanin làm chất màu thực phẩm là việc làm cần thiết, có ý nghĩa nhằm khai thác, phát triển hơn nữa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên. 1 Từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu quy trình tách chiết chất màu tự nhiên từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatean) và ứng dụng trong chế biến một số thực phẩm”. 2. Mục đích nghiên cứu Đề tài được thực hiện với mục đích khảo sát các điều kiện chiết tách chất màu tự nhiên anthocyanin từ hoa đậu biếc, từ đó xây dựng được quy trình chiết tách hiệu quả chất màu từ loại nguyên liệu này. Đồng thời định tính một số chất có trong sản phẩm và ứng dụng nhuộm màu cho một số loại thực phẩm. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Với mục tiêu tìm ra chất màu thực phẩm từ thiên nhiên, an toàn, tốt cho sức khỏe, dễ sử dụng từ hoa đậu biếc. Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm:  Xây dựng quy trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc;  Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu và độ bền màu của anthocyanin;  Khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin;  Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin;  Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin;  Định tính sản phẩm cao và bột màu thu được;  Nghiên cứu tính kháng khuẩn và ứng dụng chất màu tự nhiên anthocyanin vào một số thực phẩm. 4. Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp thu thập thông tin về số liệu  Thu thập thông tin từ sách, báo và các đề tài nghiên cứu khoa học đã có;  Thu thập, tìm kiếm dữ liệu từ Internet;  Tham khảo ý kiến của các chuyên gia.  Phương pháp phân tích Tiến hành trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc, sau đó xác định hàm lượng anthocyanin từ dịch chiết bằng phương pháp pH vi sai.  Phương pháp xử lý số liệu  Sử dụng phương pháp thống kê để xử lý số liệu; 2  Sử dụng phương pháp cơ sở dữ liệu (phần mềm Excel) kết hợp với thống kê để xác định các yếu tố ảnh hưởng;  Sử dụng một số phần mềm tin học khác phục vụ cho việc phân tích và xử lý số liệu. 5. Kết quả đạt được của đề tài Đề tài tiến hành khảo sát được một số yếu tố tối ưu trong quá trình trích ly chất màu tự nhiên anthocyanin từ hoa đậu biếc. Tiến hành trích ly với tỉ nguyên liệu: dung môi (hoa đậu biếc: etanol) là 1:10, tại nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h. Khảo sát ứng dụng của bột hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm và tính kháng khuẩn của bột đối với vi khuẩn lactic và nấm men:  Bột khi ứng dụng vào thực phẩm có màu xanh biếc rất bắt mắt.  Bột không có tính kháng khuẩn nên sử dụng được trong thực phẩm có chứa vi khuẩn lactic và nấm men. 6. Cấu trúc của đồ án Đồ án gồm có 3 chương:  Chương 1. Tổng quan tài liệu  Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu  Chương 3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hoa đậu biếc 1.1.1. Tên khoa học và mô tả [31] Hình 1.1. Cây hoa đậu biếc Hình 1.2. Hoa đậu biếc Cây hoa đậu biếc còn gọi đậu hoa tím hay bông biếc, tên khoa học Clitoria ternatean, thuộc họ đậu. Đậu biếc là một cây họ đậu lâu năm, loại thảo, leo, thân và cành mảnh có lông.  Lá: hình bầu dục, nhọn ở đầu màu xanh đậm, có gân nổi rõ, giống lá cỏ lạc cảnh, đặc biệt lá xanh quanh năm.  Hoa: có màu tím, màu trắng, với hình dáng lạ mắt dạng trứng ngược. Hoa này mọc thành chùm hay riêng lẻ rất sai hoa.  Quả: dài từ 4 đến 13 cm, giống như đậu ván, khi non có màu xanh khi già thì quả có màu nâu đốm từ 6 đến 10 hạt. Chi Đậu biếc (danh pháp: Clitoria) thuộc họ Fabaceae và tiểu họ Papgroupaceae. Có nguồn gốc từ châu Á nhiệt đới và sau đó được phân phối rộng rãi ở Nam và Trung Mỹ, Đông và Tây Ấn, Trung Quốc và Ấn Độ. Cây hoa đậu biếc thuộc loại cây thân leo khỏe mạnh, dễ trồng và chăm sóc, chịu được nắng nóng và hạn rất tốt, sợ rét, ít sâu bệnh. Nhiệt độ ưa thích của đậu biếc là từ 20-32oC. 4 1.1.2. Phân bố [34] Clitoria ternatea là một trong những cây trồng địa phương có dược tính, có nguồn gốc từ châu Á nhiệt đới và sau đó được phân phối rộng rãi ở Nam và Trung Mỹ, Đông và Tây Ấn, Trung Quốc và Ấn Độ. Đất trồng đậu biếc là các loại đất tơi xốp, nhiều mùn, giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Ở nước ta, cây Đậu biếc có nhiều ở Quảng Ninh, Ninh Bình, Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Bình Thuận và khu vực đồng bằng sông Cửu Long. 1.1.3. Công dụng [35] Hoa thường được sử dụng để nhuộm bánh gạo ở Malaysia và được ăn như rau ở Ấn Độ và Philippines Trong y học cổ truyền, cây được sử dụng trong điều trị vàng da, đau nửa đầu, viêm họng, nhiễm trùng mắt, bệnh ngoài da, hen suyễn, sưng khớp, đau tai, sốt, nhiễm trùng đường tiết niệu, táo bón, rắn cắn, nhức đầu, khó tiêu, bệnh phong và rối loạn hệ thần kinh trung ương. Các chất chiết xuất khác nhau của nó có tác dụng dược lý được báo cáo như nootropic, anxiolytic, thuốc chống co giật, thuốc an thần, chống viêm, chống tiểu đường, chống oxy hóa, chống căng thẳng, điều hòa miễn dịch, chống nhiễm trùng, chống oxy hóa và tăng cường trí nhớ. Công dụng các thành phần của cây hoa đậu biếc được thể hiện rõ qua bảng 1.1 dưới đây. Bảng 1.1. Chức năng các thành phần của cây hoa đậu biếc Thành phần Chức năng Tài liệu tham khảo Hoa Làm màu thực phẩm. [16] Rễ Giải lo âu, thuốc chống [16] trầm cảm, thuốc chống co giật. Thân Điều trị bệnh tình dục [15] chẳng hạn như: vô sinh và bệnh lậu. 5 Trích xuất của hoa đậu Ổn định nhiệt [21] biếc 1.1.4. Thành phần hóa học của hoa đậu biếc [36] Hoa đậu biếc chứa một este và một chất nhựa glycosid. Nó chứa anthoacyanin, blue proanthocyanidin là một chất chống oxy hóa mạnh. Terahara và cộng sự [27] đã phân lập sáu anthocyanins chính từ hoa đậu biếc C. ternatea với cấu trúc đặc trưng là malonylationdelphinidin, thu được chuỗi cạnh 3’5 với D- glucose xen kẽ và bốn axit p-coumaric với một phân tử axit malonic. Delphinidin glucoside là anthocyanin chính tạo ra màu xanh lam đặc biệt của loại hoa này. Các thành phần hóa học chính được tìm thấy ở Clitoria ternatea là các triterpenoids pentacyclic như taraxerol và taraxerone. Trong rễ có sự hiện diện của ternatins, ancaloit, flavonoid, saponin, tannin, carbohydrate, protein, nhựa, tinh bột, taraxerol và taraxerone [28]. Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây hoa đậu biếc (24) STT Tên của hợp chất Cấu trúc 1 Kaempferol 2 Quereetin 3 Myriceti 4 Taxaxerol 6 5 Tannic acid 6 3-monogluciside 7 β-sitosterol 8 Delphinidin-3,5- diglucoside 9 Malvidin -3-β- glucoside 10 p-hydroxycinnamic acid 11 Ethy-α –D galactopyranoside 7 12 Anthoxanthin glucoside 1.2. Tổng quan về chất màu thực phẩm [11] 1.2.1. Tầm quan trọng của chất màu trong chế biến thực phẩm Màu sắc là một trong những chỉ tiêu cảm quan quan trọng đầu tiên đối với mỗi sản phẩm thực phẩm. Quan trọng hơn hết là màu sắc ảnh hưởng tới chất lượng, mùi vị, độ ngọt của thực phẩm. Nếu giữa màu sắc và mùi vị không có sự tương ứng, phù hợp lẫn nhau thì người tiêu dùng sẽ không cảm nhận được chính xác được mùi vị và chất lượng của thực phẩm. Thực vậy, trong một nghiên cứu của nhà thực phẩm học Johnson với đề tài “Bảo vệ thực phẩm” năm 1983 đã chứng minh rằng vị ngọt của nước giải khát trái dâu sẽ tăng lên 2-12% nếu ta tăng hàm lượng của chất màu của loại nước giải khát này. Do vậy, việc sử dụng các chất màu trong chế biến thực phẩm là điều rất cần thiết. 1.2.2. Vai trò chất màu thực phẩm Chất màu thực phẩm mặc dù không có ý nghĩa nhiều về mặt dinh dưỡng, nhưng có những chức năng quan trọng sau đây:  Đảm bảo sự đồng nhất về màu sắc thực phẩm từ lô sản phẩm này đến lô sản phẩm khác.  Tăng cường màu sắc tự nhiên vốn có của thực phẩm để thu hút người tiêu dùng.  Làm cho người tiêu dùng chú ý đến mùi vị tự nhiên của thực phẩm do giữa màu sắc và mùi vị thường có quan hệ... và tiết kiệm dung môi. Nguyên tắc của nó tương tự như phương pháp chiết Soxhlet cổ điển, ngoại trừ việc quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất cao (nhưng vẫn dưới điểm tới hạn của dung môi sử dụng). Trong phương pháp ASE, nguyên liệu cần chiết được xay nhỏ, làm khô (thường là đông khô), rồi nhồi vào một ống chiết (extraction cell). Ống chiết này được đặt trong lò duy trì ở nhiệt độ thích hợp (có thể điều chỉnh từ 40 – 200oC). Dung môi được bơm vào ống chiết và giữ ở áp suất 10 -20 MPa trong vài phút (static time), sau đó dịch chiết được đẩy vào một bình hứng bằng một thể tích dung môi mới (flush volume). Quá trình được lặp lại vài lần (cycles). Cuối cùng, toàn bộ dịch chiết được đẩy ra bằng một dòng khí trơ (N2). Hình 1.10. Sơ đồ thiết bị chiết SFE Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị chiết ASE 27 1.5. Tình hình nghiên cứu, khai thác và sử dụng anthocyanin tự nhiên Một số đề tài, công trình nghiên cứu về anthocyanin trong thời gian gần đây:  Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Huỳnh (2013). Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, Trường Đại học Đà Nẵng. Kết quả cho thấy một số nguyên liệu có hàm lượng anthocyanin tương đối cao như: quả dâu ta 1,188 %; bắp cải tím 0,909%; lá tía tô 0,397%; trà đỏ 0,335%, vỏ nho 0,564%, vỏ cà tím 0,441%.  Kiều Thị Nhi, Nguyễn Tuấn Kiệt, Hoàng Thị Ngọc Nhơn (2017). Nghiên cứu quy trình chiết tách anthocyanin hiệu quả từ hành tím, hành lá, tỏi tía, cần tây, cần ta, Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm 12 (1) (2017) 100-107, Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM. Kết quả thu nhận anthocyanin từ hành tím đạt giá trị cao nhất trong nhóm nguyên liệu đã khảo sát.  Nguyễn Thị Trang (2011). Nghiên cứu chiết xuất chất màu anthocyanin từ cây Cẩm, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. Kết quả xác định được một số thành phần hóa học cơ bản của lá Cẩm như sau: Hàm lượng nước 78.32%, anthocyanin tổng số 39272 ( mg/kg khô), hiệu suất chiết anthocyanin từ lá Cẩm bằng phương pháp ngâm chiết ở 100oC và phương pháp siêu âm ở 80oC gần như nhau và khá cao (93-96%).  Nguyễn Thị Hiền và các cộng sự (2013). Nghiên cứu chiết tách anthocyanin từ Hibiscus Sabdariffa - ứng dụng để sản xuất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Kết quả nghiên cứu sản xuất được giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm có ngưỡng tối thiểu tốt hơn và độ nhạy tương tự như giấy nghệ. 1.5.1. Tình hình trên thế giới Trên thế giới chất màu anthocyanin thường được thu nhận từ dịch chiết của quả nho, vỏ nho, bắp cải đỏ, củ cải đỏ, Hỗn hợp anthocyanin sử dụng rộng rãi nhất trong thực phẩm là anthocyanin từ vỏ nho (E163 (i)) và anthocyanin chiết xuất từ quả nho đen (E163 (iii)). Hiện nay, bắp cải đỏ (Brassica oleracea L.) cũng được xem là nguồn anthocyanin tự nhiên có giá trị do có khả năng trồng với diện tích lớn, có thể thu hoạch quanh năm, tạo ra màu hồng sáng ở pH thấp và màu hồng/tím hoa 28 cà ở pH trung tính, không có mùi lạ, bền với nhiệt và ánh sáng hơn so với các anthocyanin chiết từ các nguồn tự nhiên khác như vỏ nho, quả nho đen, Trong thực tế anthocyanin chủ yếu được chiết xuất dưới dạng thô để sử dụng trong thực phẩm do việc tinh chế anthocyanin khá khó khăn. Sản phẩm anthocyanin thương mại có thể ở dưới dạng dịch chiết cô đặc hay ở dạng bột khô (bằng cách trộn dịch chiết anthocyanin cô đặc với chất mang thích hợp rồi sấy phun). Hình 1.12. Một số dạng sản phẩm anthocyanin thương mại Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái và tác dụng trong nông nghiệp, cũng như y học của cây hoa đậu biếc. Theo tác giả Niral Kumar Singh cùng các cộng sự, thì cây hoa đậu biếc có rất nhiều dược tính tốt: khả năng chống oxy hoá, chống ung thư, phòng bệnh tiểu đường [23]. Nghiên cứu của tác giả Kamkean N., Wilkinson J. M. cũng chỉ ra rằng trong dịch chiết của hoa đậu biếc có chứa chất chống oxy hoá và có thể ứng dụng trong sản xuất dược mỹ phẩm [18]. Tại Thái Lan dịch chiết từ hoa đậu biếc đã được ứng dụng sản xuất gel bôi mắt chống nếp nhăn. 1.5.2. Tình hình trong nước Ở nước ta, điều kiện khí hậu không thuận lợi lắm cho việc phát triển các vùng nguyên liệu truyền thống để sản xuất chất màu anthocyanin như các nước vùng ôn đới. Gần đây, chúng ta cũng đã di thực và thương mại hóa một số loài thực vật giàu anthocyanin như nho đỏ, nho đen, bắp cải tím, Tuy nhiên, với sản lượng 29 còn hạn chế, các nguyên liệu này chủ yếu chỉ dùng làm thực phẩm tươi hay đồ uống (rượu vang, nước ép quả nho, ). Các anthocyanin chiết từ hoa đậu biếc tạo nên màu xanh rất đẹp (trong môi trường trung tính), dễ tan trong nước nên thuận tiện cho việc sử dụng làm chất màu thực phẩm. Do vậy, hoa đậu biếc đã được sử dụng lâu đời trong dân gian để tạo màu tím rất đẹp cho thực phẩm (trà hoa đậu biếc, xôi hoa đậu biếc, ). Ngoài ra, hoa đậu biếc khá dễ trồng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiều địa phương trong nước lại không đòi hỏi kỹ thuật canh tác phức tạp và chi phí đầu tư. Có thể nói, hoa đậu biếc là một trong các nguồn anthocyanin tự nhiên đầy triển vọng, cần được khai thác sử dụng ở nước ta. Tuy nhiên, việc nghiên cứu sản xuất chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc khảo sát khả năng sử dụng dung môi chiết có nhiệt độ sôi thấp hơn để chiết anthocyanin từ hoa đậu biếc là điều rất cần thiết để có thể đi đến sản xuất công nghiệp và ứng dụng chất màu này trong thực tế. Đề tài này sẽ nghiên cứu và so sánh hiệu quả chiết chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc trồng ở Việt Nam bằng phương pháp ngâm chiết và phương pháp soxlet sử dụng các dung môi nước và etanol. Từ đó, chọn lựa quy trình thích hợp cho việc chiết anthocyanin từ nguồn nguyên liệu này. 30 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Nghiên Cứu Khoa Học bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Công nghệ kỹ thuật – Nông nghiệp công nghệ cao, trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. Thời gian thực hiện 12 tháng. 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu a) Nguyên liệu và cách chuẩn bị Nguyên liệu hoa đậu biếc có nguồn gốc thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Hoa mua về được rửa nhẹ nhàng cho sạch bụi, để ráo. Chuẩn bị nguyên liệu tươi: rửa nhẹ, để ráo. Chuẩn bị nguyên liệu khô: Hoa tươi sau khi làm sạch được đem đi sấy đến độ ẩm 5-6% ở nhiệt độ 55oC, cắt nhỏ 2-3mm. b) Hóa chất sử dụng Etanol 70o Maltodextrin 4-6% NaOH 10% HCl 10% c) Dụng cụ - thiết bị Máy sấy Bể điều nhiệt Máy do pH Máy quan phổ UV – Vis (Spectronic 200) Tủ lạnh Thiết bị cô quay chân không Cân phân tích 2.2. Bố trí thí nghiệm 2.2.1. Quy trình đề xuất để chiết tách chất màu từ hoa đậu biếc 31 Nguyên liệu Xử lý Ngâm trong dung môi Ngâm chiết Lọc Cô đuổi dung môi Bổ sung maltodextrin Sấy phun Đóng gói, bảo quản Hình 2.1. Quy trình chiết tách màu anthocyanin từ hoa đậu biếc  Thuyết minh quy trình  Xử lý: Hoa đậu biếc sau khi thu mua được loại bỏ hoa dập, úng, đem rửa qua nước, để ráo, sau đó đem sấy ở nhiệt độ 55oC đến độ ẩm 5-6%.  Chiết: Tiến hành chiết chất màu anthocyanin bằng dung môi, sử dụng phương pháp chiết thích hợp. 32  Lọc: loại bỏ bã chiết và các tạp chất không tan để thu lấy dịch chiết.  Cô đuổi dung môi: Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi dưới áp suất thấp, nhiệt độ không quá 60oC nhằm hạn chế sự phân hủy chất màu anthocyanin bởi nhiệt và ánh sáng.  Bổ sung maltodextrin: Sau khi dịch chiết anthocyanin được cô đặc đến nồng độ chất khô xác định, tiến hành bổ sung maltodextrin với tỷ lệ thích hợp cho việc sấy phun.  Sấy phun: hỗn hợp anthocyanin-maltodextrin được đem đi sấy phun ở điều kiện: nhiệt độ 140 - 160oC, tốc độ vòi phun 350ml/giờ, gió 0.40m3/phút, áp suất 15 - 16×10kPa, nồng độ chất khô từ 15% trở lên hoặc ít nhất 5% maltodextrin trong dung dịch đem sấy phun để thu bột màu anthocyanin.  Đóng gói – Bảo quản: Sản phẩm bột màu anthocyanin từ hoa đậu biếc được đem đóng gói trong bao bì kín, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát và tránh ánh sáng trực tiếp. 2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng trích ly chất màu từ hoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin của các hệ dung môi khác nhau, từ đó tìm ra hệ dung môi có khả năng trích ly tối ưu nhất. Do bột màu sản xuất ra được ứng dụng vào chế biến thực phẩm, đồng thời giúp người sản xuất đơn giản hóa quá trình sản xuất nên đề tài nghiên cứu hướng đến khảo sát những dung môi thường được dùng phổ biến, an toàn và dễ dàng xử lý trong quá trình sản xuất. Khảo sát dung môi:  Nước  Cồn với nồng độ 70o b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc  Chuẩn bị dung môi như trên c) Tiến hành thí nghiệm 33 Hoa đậu biếc o Etanol 70 Nước Ngâm chiết ở điều kiện thường và điều kiện nhiệt độ 60oC Lọc So sánh màu Dung môi thích hợp Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm chọn dung môi thích hợp Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.2, với nhân tố thay đổi là hệ dung môi và 3 lần lặp lại. Tổng số thí nghiệm là 6. Dịch màu sau khi trích ly được để vào các ống nghiệm và quan sát màu qua các khoảng thời gian 6h, 12h,18h. Trên cơ sở này biết được loại dung môi nào giúp bền màu và lựa chọn dung môi thích hợp trong quá trình chiết. d) Chỉ tiêu theo dõi Màu của anthocyanin trong mỗi dịch chiết qua các mốc thời gian khác nhau. 2.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly anthocyanin a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cồn đến khả năng trích ly anthocyanin, từ đó tìm ra nồng độ dung môi có khả năng trích ly tối ưu nhất. Khảo sát nhân tố nồng độ ethanol trích ly với nồng độ tăng dần từ 40o đến 70o (mỗi giá trị nồng độ khảo sát hơn kém nhau 10o). 34 b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc  Chuẩn bị các nồng độ dung môi c) Tiến hành thí nghiệm Hoa đậu biếc Thêm etanol với nồng độ thay đổi 40o 50o 60o 70o 80o Ngâm chiết (bể điều nhiệt, 60oC) Lọc Nồng độ etanol thích hợp Dịch chi ế t Đo độ hấp thụ Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm chọn nồng độ dung môi thích hợp Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.3, với 1 nhân tố thay đổi là nồng độ dung môi và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm là 15. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết. 35 d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 2.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến màu của anthocyanin từ hoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự đổi màu của anthocyanin trong các môi trường pH khác nhau. Từ đó xác định được khoảng pH bền màu anthocyanin. b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc  Chuẩn bị HCl 10% và NaOH 10% để hiệu chỉnh pH. c) Tiến hành thí nghiệm Hoa đậu biếc pH thích hợp Chiết So sánh màu bằng (nhiệt độ phòng, dung mắt môi thích hợp) Quan sát màu, để Lọc qua đêm Hiệu chỉnh pH Dịch chiết (pH = 1-14) Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.4, với 1 nhân tố thay đổi là dãy pH (pH từ 1-14). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số thí nghiệm là 15. Quan sát cảm quan bằng mắt, để qua đêm xem màu của anthocyanin bị biến đổi theo dãy pH như thế nào, từ đó chọn pH tối ưu nhất có thể làm bền màu anthocyanin. 36 d) Chỉ tiêu theo dõi Màu của anthocyanin với pH tương ứng. 2.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khả năng trích ly a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc theo các tỉ lệ của nguyên liệu/ dung môi (hoa đậu biếc/ etanol), từ đó tìm ra tỷ lệ dung môi có khả năng trích ly tối ưu nhất. Bảng 2.1. Tỷ lệ nguyên liệu/etanol Stt mHoa(g) VEtanol(ml) Tỷ lệ 1 10 50 1:5 2 10 80 1:8 3 10 100 1:10 4 10 120 1:12 5 10 150 1:15 6 10 200 1:20 7 10 250 1:25 b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc  Chuẩn bị dung môi theo tỷ lệ như bảng 2.1 c) Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.5, với nhân tố thay đổi là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm 21. Dịch màu sau khi trích ly được tiến hành đo quang phổ hấp thụ nhằm xác định nồng độ của dịch màu trong dịch chiết. 37 Hoa đậu biếc Thêm dung môi chiết thích hợp Thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:05 1:08 1:10 1:12 1:15 1:20 1:25 Ngâm chiết (1h, 60oC) Lọc Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp Dịch chiết So sánh hiệu quả Đo độ hấp thụ chiết Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 2.2.6. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc, từ đó tìm ra nhiệt độ cho khả năng trích ly cao nhất. 38 Khảo sát nhân tố nhiệt độ trích ly, với nhiệt độ tăng dần từ 40oC đến 80oC (mỗi giá trị nhiệt độ khảo sát hơn kém nhau 10oC). b) Chuẩn bị thí nghiệm  Thí nghiệm 6 được tiến hành dựa trên điều kiện tối ưu của các thí nghiệm trên.  Được tiến hành trong bể điều nhiệt với các giá trị nhiệt độ tương ứng. c) Tiến hành thí nghiệm Hoa đậu biếc Chiết (dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, phương pháp chiết thích hợp) Nhiệt độ chiết thích hợp Nhiệt độ chiết So sánh hiệu suất chiết o o o o o 40 C 50 C 60 C 70 C 80 C Đo độ hấp thụ Lọc Dịch chiết Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ chiết thích hợp Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.6, thí nghiệm tiến hành với 1 nhân tố thay đổi là nhiệt độ. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng nhiệt độ tương ứng. Tổng số thí nghiệm là 15 thí nghiệm. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết. 39 d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 2.2.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin, từ đó tìm ra thời gian cho khả năng trích ly cao nhất. Khảo sát nhân tố thời gian của quá trình trích ly với khoảng thời gian khảo sát từ 1 giờ đến 5 giờ (mỗi giá trị thời gian khảo sát hơn kém nhau 1 giờ). b) Chuẩn bị thí nghiệm Thí nghiệm 7 được tiến hành dựa trên cơ sở các điều kiện tối ưu của 6 thí nghiệm trên. c) Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.7, với 1 nhân tố thay đổi là thời gian trích ly. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng thời gian tương ứng, tổng số thí nghiệm là 15 thí nghiệm. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết. 40 Hoa đậu biếc Chiết (dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, phương pháp chiết và nhiệt độ thích hợp) Thời gian chiết 1h 2h 3h 4h 5h Thời gian chiết thích hợp Lọc So sánh hiệu suất chiết Dịch chiết Đo độ hấp thụ Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết thích hợp d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 2.2.8. Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trích ly anthocyanin a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát khả năng trích ly anthocyanin theo hai phương pháp: ngâm chiết và shoxhlet. Từ đó chọn ra phương pháp chiết tối ưu nhất. b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị nguyên liệu, dung môi 41 c) Tiến hành thí nghiệm Hoa đậu biếc Ngâm chiết (bể điều Shoxhlet nhiệt, 60oC) Lọc Phương pháp chiết thích hợp Dịch chiết So sánh hiệu suất Đo độ hấp thụ chiết Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết thích hợp Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.8, với nhân tố thay đổi là phương pháp chiết và lặp lại 3 lần. Tổng số thí nghiệm là 6. Dịch màu sau khi trích ly được đo độ hấp thụ để chọn loại nguyên liệu phù hợp. d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 2.2.9. Khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin. b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu hoa đậu biếc.  Thí nghiệm này được thực hiện dựa vào điều kiện thời gian tối ưu ở thí nghiệm trên. 42 c) Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí và tiến hành như hình 2.9, với 1 nhân tố thay đổi là số lần chiết. Điều kiện chiết: - Lần 1: nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thời gian chiết theo giá trị xác định ở các thí nghiệm trên - Lần 2, lần 3: Sau chiết lần 1, lọc lấy dịch sau đó cho dung môi vào phần bã chiết tiếp. Điều kiện nhiệt độ theo giá trị xác định ở thí nghiệm trên, thời gian và lượng dung môi giảm một nửa. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tổng số thí nghiệm là 12. Tiến hành xác định nồng độ dịch chất màu sau khi chiết để chọn số lần chiết tối ưu nhất. Hoa đậu biếc Chiết (các điều kiện chiết tối ưu) Số lần chiết thích hợp Số lần chiết So sánh hiệu suất chiết 1 lần 2 lần 3 lần Đo độ hấp thụ Lọc Dịch chiết tổng Hình 2.9. Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết thích hợp d) Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng chất màu anthocyanin trong mỗi dịch chiết. 43 2.2.10. Khảo sát sự ảnh hưởng hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột hoa đậu biếc sau khi sấy phun a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát các yếu tố khi sấy phun để chọn điều kiện tối ưu nhất cho ra lượng bột chất lượng nhất. b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu cao của dịch chiết.  Maltodextrin để làm chất mang khi sấy phun. c) Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành sau khi xác định được các điều kiện chiết tối ưu. Trong đó có 3 yếu tố cần khảo sát là khối lượng cao, tỉ lệ phần trăm maltodextrin và lượng nước pha loãng cao. Giữ nguyên khối lượng cao, lượng nước pha loãng và thay đổi lượng maltodextrin xem màu của bột sau khi sấy thay đổi như thế nào. Sấy phun 3 mẫu, mỗi mẫu lấy 13ml cao ở dạng sệt cho vào 500ml nước. Lượng maltodextrin thay đổi lần lượt của mỗi mẫu là 20g, 25g, 30g. tương ứng với 4%, 5%, 6% của dung dịch sấy phun. d) Chỉ số theo dõi  Độ ẩm của bột.  Màu và độ mịn của bột. 2.2.11. Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun của hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát màu của 1 số loại thực phẩm sau khi phối trộn bột hoa đậu biếc vào. Từ đó chọn tỉ lệ phối trộn thích hợp. b) Chuẩn bị thí nghiệm Chuẩn bị một số loại thực phẩm như: rau câu, xôi, chè trôi nước, 44 c) Tiến hành theo dõi Phối trộn bột vào khi nấu theo nhiều tỉ lệ khác nhau. Số gam của bột vẫn giữ nguyên, thay đổi số gam nguyên liệu của món ăn. Sau đó chọn tỉ lệ phối trộn cho ra màu đẹp nhất và có lợi nhất. d) Chỉ tiêu theo dõi Màu của thực phẩm đã được ứng dụng bột hoa đậu biếc. Số lượng của thực phẩm được ứng dụng với số gam bột tương ứng. 2.2.12. Khảo sát sự ảnh hưởng của bột và cao hoa đậu biếc đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm a) Mục đích thí nghiệm Khảo sát sự ảnh hưởng của bột hoa đậu biếc đến một số vi sinh vật thường được dùng bổ sung vào thực phẩm như Saccharomyces cerevisiae, Lactobacilus, từ đó khuyến cáo đến người dùng khi sử dụng bột màu cho một số loại thực phẩm có chứa vi sinh vật đó. b) Chuẩn bị thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu bột và cao.  Chuẩn bị 1 số loại vi sinh vật như: lactic, nấm men và môi trường nuôi cấy. c) Tiến hành thí nghiệm Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng của đĩa thạch, sau khi chúng phát triển mạnh cho vào môi trường TSB trong ống nghiệm. Khoảng 12-14h, sau đó khi ống nghiệm đục đem ly tâm lấy phần đục rồi pha loãng với nước cất vô trùng đến độ đục thích hợp. Sau đó, cấy trang lên đĩa thạch với môi trường dinh dưỡng thích hợp của từng vi sinh vật. Gắn giấy kháng khuẩn sau khi đã nhúng vào cao và dung dịch bột hoa đậu biếc với các nồng độ pha loãng. Đọc kết quả sau 12- 14 giờ. d) Chỉ tiêu theo dõi Vòng kháng khuẩn của vi sinh vật. 45 2.3. Phương pháp nghiên cứu Trong quá trình nghiên cứu em đã sử dụng các phương pháp: 2.3.1. Phương pháp xử lý và bảo quản nguyên liệu Hoa đậu biếc tươi sau khi thu mua được đem ngay về phòng thí nghiệm, rửa nhẹ cho sạch, để ráo. Sau đó đem sấy ở nhiệt độ 55oC đến độ ẩm 5-6%, cắt nhỏ 2-3mm và bảo quản trong túi kín để dùng cho các thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp định tính thành phần cao  Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid  Thuốc thử Liebermann – Burchard:  Anhidrid acetic 1 ml  H2SO4 đậm đặc  Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính. Thực nghiệm: Lấy 1 ml dịch alcol cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ đến hết 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.  Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid  Thuốc thử Wagner:  I2 1,27g  KI 2 g  H2O vừa đủ 100 ml  Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.  Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid  Thuốc thử Flavnoid:  Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính. 46 Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch alcol, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử theo thành ống nghiệm, để yên, quan sát.  Khảo sát sự hiện diện của saponin Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:  Thuốc thử:  HCl 0,1N  NaOH 0,1N  Ống 1: 5 ml HCl 0,1 N (pH = 1) và 3 giọt dung dịch acol chứa mẫu thử.  Ống 2: 5 ml NaOH 0,1 N (pH = 13) và 3 giọt dung dịch alcol chứa zqsmẫu thử.  Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả hai ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát chiều cao cột bọt trong cả hai ống nghiệm.  Nếu cột bọt trong cả hai ống nghiệm cao bằng nhau và cột bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpenoid.  Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid. 2.3.3. Phương pháp xác định tính kháng khuẩn Các bước tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn/kháng nấm của màu: a) Cách pha loãng  Chiết ở điều kiện tối ưu (chiết khối lượng nhiều để dùng).  Cô quay chân không để thu cao (cô quay đến dạng sệt để có thể lấy ra được) – cho vào cốc/ đĩa đem đi sấy ở nhiệt độ 60-70oC.  Cao chiết: pha loãng bằng dung dịch DMSO 5%. 1g cao chiết + 10 ml DMSO = nồng độ 0,1 g/ml = 100 mg/ml  Nồng độ dùng thử nghiệm để xác định vòng kháng khuẩn: 100mg/ml, 200 mg/ml, 300mg/ml, 400mg/ml, 500mg/ml (tùy loại cao), cần khảo sát nhiều để lựa chọn. b) Chuẩn bị môi trường  Môi trường Hansen lỏng và đặc cho nấm men. 47  Môi trường lỏng và đặc cho lactic.  Môi trường MP (môi trường dinh dưỡng – cao thịt peptone – rắn và lỏng).  Môi trường TSB, môi trường MHA.  Tất cả dụng cụ dùng cần phải khử trùng bằng autoclave hoặc dùng tủ sấy 1600C , 2 giờ.  Đĩa giấy đường kính 6 mm. c) Xác định vòng kháng khuẩn/kháng nấm  Bước 1. Tăng sinh VSV từ ống gốc sang môi trường lỏng MP (môi trường dinh dưỡng cao thịt peptone). Thời gian 12-24 giờ, điều kiện nhiệt độ 370C nếu là vi khuẩn. Còn nếu là nấm men thì trong môi trường Hansen lỏng. Cách tiến hành: hút 1 ml hoặc chọn 1 vài khuẩn lạc khỏe.  Bước 2. Cấy trên môi trường thạch MP hoặc MHA đối với vi khuẩn, còn với nâm men trên môi trường Hansen đặc.  Bước 3. Chọn 2-3 khuẩn lạc đẹp cấy vào môi trường lỏng TSB. Thời gian 12-24h. Còn nấm men chọn vài khuẩn lạc cho vào nước cất đã khử trùng rồi so với ống đục sau đó cấy trang lên môi trường Hansen – cho đĩa như bước 5) (hoặc có thể thử các bước 4,5 giống vi khuẩn để xem có lên không)  Bước 4. Ly tâm ống VSV của môi trường TSB sau nuôi cấy 24h, bỏ phần nước ở trên, sau đó cho nước cất đã khử trùng vào. So sánh với ống nghiệm này với ống độ đục McFarland đã chuẩn bị.  Bước 5. Nếu xác định vòng kháng khuẩn thì hút 100 l cấy trang lên môi trường thạch MHA, để khô, cho đĩa giấy 6mm và nhỏ 10 l dung dịch cao theo nồng độ pha loãng khác nhau. Kháng dương dùng kháng sinh tetracylin hoặc ampicillin hoặc penicillin (đối chứng + với vi khuẩn gram -) nồng độ 10 g/ml, đối với nấm men dùng nystanin. Đối chứng âm là dung dịch DMSO  Bước 6. Sau 12-24 giờ đo kết quả vòng kháng khuẩn = D- d (D – đường kính vòng lớn, d – đường kính đĩa giấy). 2.3.4. Phương pháp phân tích cảm quan [5] Phân tích cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan của hoa đậu biếc như màu 48 sắc, hình dạng, mùi và cấu trúc. Phương pháp dựa trên phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp sản phẩm TCVN 3215-79. Đánh giá cảm quan bột màu hoa đậu biếc ngoài mục đích phân tích sản phẩm theo các tính chất cảm quan vốn có còn bao hàm cả nội dung thị hiếu đối với các tính chất hoặc đối với chính sản phẩm. Kết quả của một phép thử cảm quan lên sản phẩm bột màu đối với một chỉ tiêu nào đó thường được lượng hóa bằng điểm hay bằng lời đều là kết quả đánh giá chỉ tiêu đó khi đã phân tích sản phẩm để hiểu hết bản chất của từng chỉ tiêu.  Hội đồng đánh giá cảm quan gồm 5 thành viên: 1. Nguyễn Thị Ngọc Hiền 2. Trương Thị Mỹ Loan 3. Huỳnh Thị Châu Trâm 4. Đoàn Thị Tường Oanh 5. Nguyễn Thị Trang Thi Tất cả thành viên hội đồng đều là sinh viên lớp DH15TP, ngành Công nghệ thực phẩm, đã trải qua môn học về đánh giá cảm quan thực phẩm nên có kiến thức cơ bản, đáp ứng điều kiện cần thiết để trở thành cảm quan viên.  Cách tiến hành đánh giá: Chia nhỏ các mẫu sản phẩm ra đĩa, sao cho các đĩa đều nhau. Mã hóa mẫu. sau đó, ghi mã số ký hiệu để nhận biết từng mẫu rồi chuyển cho từng thành viên của hội đồng đánh giá cảm quan. Các cảm quan viên tiến hành đánh giá cảm quan của mẫu theo từng chỉ tiêu quy định trong bảng 2.2 rồi cho điểm vào phiếu kết quả. - Về cấu trúc: tiến hành đánh giá về độ tơi, độ mịn. Các cảm quan viên tiến hành quan sát bằng mắt và dùng tay ấn để đánh giá độ tơi của sản phẩm. - Về màu sắc: các cảm quan viên tiến hành quan sát bằng mắt đề đánh giá màu sắc sản phẩm. 49 - Về mùi vị: dùng các giác quan như vị giác, khứu giác, cảm nhận và đánh giá mùi vị sản phẩm. Trong quá trình đánh giá cảm quan của nhiều mẫu sản phẩm, các cảm quan viên phải được thanh vị bằng nước sau mỗi lần đánh giá mẫu. Bảng 2. 2. Điểm chất lượng sản phẩm bột màu từ hoa đậu biếc Hệ số Điểm số Các chỉ tiêu trọng Mô tả chất lượng lượng 0 Bột màu ướt, vón cục to và nhiều, không tơi 1 Bột vón cục nhiều, không tơi, hơi ướt 2 Bột vón cục vừa, không tơi Trạng thái 1,2 3 Bột vón cục ít, không tơi 4 Bột không bị vón cục, không tơi 5 Bột không vón cục, tơi 0 Đắng do cháy khi sấy phun nhiệt độ cao 1 Ngăm ngăm đắng do cháy 2 Không có vị rõ ràng Vị 0.8 3 Vị ngọt đậm 4 Vị hơi ngọt 5 Vị ngọt thanh 0 Màu tím đậm 1 Màu tím vừa 2 Màu tím nhạt Màu sắc 0.8 3 Màu tím xanh 4 Màu xanh đậm 5 Màu xanh dương 0 Mùi khét 1 Mùi lạ 2 Không có mùi rõ ràng 3 Mùi của maltodextrin Mùi 1.2 Mùi hơi thơm maltodextrin, có mùi hoa 4 đậu biếc 5 Mùi đặc trưng của hoa đậu biếc 50 2.3.5. Phương pháp cô quay chân không Mục đích nhằm cô đuổi dung môi, thu cao chiết để thuận tiện cho việc bảo quản mẫu và sấy phun. Bay hơi chân không giữ vai trò chủ đạo bởi vì trong một hệ kín, áp suất giảm dẫn tới làm giảm nhiệt độ sôi của các thành phần trong nó. Các thành phần trong mẫu dung dịch được cô quay bay hơi để loại bỏ dung môi mong muốn từ mẫu dịch chiết, nó được ứng dụng trong quá trình tách chiết môt hợp chất tự nhiên hay đơn giản chỉ trong một bước của tổng hợp hợp chất hữu cơ. Dung môi hòa tan có thể được loại bỏ nếu nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ cho phép. Nhiệt độ cho phép phụ thuộc vào độ sôi của hợp chất, chất tan và dung môi. 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp vi sai [1], [3], [4], [6], [8], [10] Hàm lượng anthocyanin được xác định theo phương pháp pH vi sau và được tính quy theo cyaniding-3-glucoside, vì đây là sang phổ biến của anthocyanin trong tự nhiên. Phương pháp pH vi sai dựa vào sự chuyển đổi thành các cấu trúc khác nhau theo pH của các sắc tố anthocyanin và thể hiện rõ qua các phổ hấp thu khác nhau tương ứng. Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4.5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Tất cả phép cácpheps đo độ hấp thu bằng máy đo quang phổ đựợc thực hiện ở bước song 520 nm (là bước song cực đại của anthocyanin đo được) và 700 nm.  Sử dụng hóa chất và thiết bị:  Hóa chất: dung dịch đệm KCl, 0.025M, pH = 1 và dung dịch đệm NaCH3COO.3H2O, 0.4M, pH= 4.5.  Thiết bị: máy đo ph, máy đo quang phổ khả kiến, cuvet thủy tinh, bình định mức 25ml, pipet chia vạch và có các dung tích thích hợp.  Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly theo cyanidin-3-glucoside. 퐴.푀푊.퐷퐹.103 a (mg/l) = dd 휀.푙 Trong đó: 51 add: Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích ly (mg/l) A = (Amax – A700nm)pH 1.0 - (Amax – A700nm)pH 4.5 MW = 449.2 g/mol: KLPT cyanidin-3-glucoside DF: Độ pha loãng l: Bề dày cuvet (cm)  = 26900: Hệ số hấp thụ phân tử (l.mol-1.cm-1) 2.3.7. Phương pháp xác định hiệu xuất chiết Dịch chiết ...tsuất Hiệu 21 20.5 1:05 1:08 1:10 1:12 1:15 1:20 1:25 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin Qua kết quả bảng 3.2 và hình 3.12 ta thấy, hiệu suất chiết giảm dần từ tỉ lệ 1:05 (23.45%) xuống còn 21.74% ở tỉ lệ 1:25. Nhưng ở hai tỉ lệ 1:05 và 1:08 dung môi ít không đủ ngập hết nguyên liệu và chênh lệch hiệu suất của hai tỉ lệ này với tỉ lệ 1:10 không quá lớn 0.14% (1:08 ÷ 1:10) và 0.2% (1:05 ÷ 1:10). 58 Vì vậy, chọn tỉ lệ 1:10 để trích ly anthocyanin trong suốt quá trình nghiên cứu. 3.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc Sau dung môi, nhiệt độ là yếu tố tiếp theo cần được quan tâm trong quá trình trích ly. Khi nhiệt độ tăng sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán. Do đó, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình vận chuyển các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi [9]. Tuy nhiên, chất màu anthocyanin dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ cao vì vậy cần phải khảo sát nhiệt độ trích ly phù hợp để thu được hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết cao nhất. Bảng 3.3. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly ở các nhiệt độ khác nhau 30 24.19 25 20.22 20 18.16 17.80 17.05 15 10 Hiệu suất chiết (%) chiết suất Hiệu 5 0 40 50 60 70 80 o Nhiệt độ ( C) Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết anthocyanin 59 Hiệu suất chiết anthocyanin chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiệt độ. Thực vậy, các kết quả nghiên cứu ở bảng 3.3 và hình 3.13 cho thấy:  Nhiệt độ chiết tăng từ 40 ÷ 50oC thì hàm lượng anthocyanin thu được tăng, hiệu suất chiết tăng từ 18.16 ÷ 20.22%.  Nhiệt độ chiết tăng từ 50 ÷ 60oC, hàm lượng anthocyanin thu được sau trích ly tăng nhanh và đạt cao nhất, hiệu suất chiết tăng từ 20.22 ÷ 24.19%. Đây là khoảng nhiệt độ thu được anthocyanin hiệu quả nhất.  Nhiệt độ tăng từ 60 ÷ 80oC, hàm lượng anthocyanin thu được sau trích ly giảm nhanh. Hiệu suất chiết bắt đầu giảm từ 24.19% (60oC) xuống còn 17.80% (70oC), tiếp tục giảm xuống còn 17.05% (80oC).  Việc thay đổi hàm lượng anthocyanin do thay đổi nhiệt độ chiết có thể được giải thích như sau: Khi nhiệt độ tăng thì khả năng hoạt hóa của các phân tử tăng dẫn đến quá trình khuếch tán anthocyanin từ hoa đậu biếc tăng nên hàm lượng anthocyanin thu được sau trích ly tăng. Sau đó nhiệt độ tiếp tục tăng, hàm lượng anthocyanin thu được đạt cao nhất. Do anthocyanin dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ cao nên khi ta tăng nhiệt độ (>60oC) thì bắt đầu có sự phân hủy anthocyanin và khi nhiệt độ lên cao (80oC) thì quá trình phân hủy anthocyanin diễn ra mạnh mẽ, dẫn đến giảm hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết sau trích ly. Vì vậy, chọn nhiệt độ trích ly là 60oC, là nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc. 3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc Quá trình trích ly anthocyanin cũng phụ thuộc vào thời gian trích ly. Nếu thời gian quá ngắn, không đủ để dung môi hòa tan hết anthocyanin trong nguyên liệu. Ngược lại, thời gian quá dài ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm cần trích ly, do dung môi có thể hòa tan các chất khác trong nguyên liệu, mặc khác nếu kéo dài thời gian trích ly có thể làm giảm lượng anthocyanin trích ly được do anthocyanin có thể bị phân hủy do tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài. Sau các khoảng thời gian trích ly khác nhau ta thu được kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.14. 60 Bảng 3.4. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với các khác khoảng thời gian khác nhau 23 22.67 22.5 22 21.46 21.5 21.33 21.04 21 20.5 19.96 20 Hiệu suất chiết (%) chiếtsuất Hiệu 19.5 19 18.5 1 2 3 4 5 Thời gian (h) Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết anthocyanin Dựa vào kết quả thống kê ở bảng 3.4 và đồ thị ở hình 3.14 ta thấy rằng:  Thời gian tăng từ 1 ÷ 2h thì hàm lượng anthocyanin thu được tăng, hiệu suất tăng từ 21.33 ÷ 22.67%.  Thời gian tăng từ 2 ÷ 5h, hàm lượng anthocyanin thu được sau trích ly bắt đầu giảm. Hiệu suất chiết giảm từ 22.67% (2h) xuống còn 21.46% (3h), 21.04% (4h), 19.96% (5h). Như vậy, 2h là khoảng thời gian thích hợp để thu được hàm lượng anthocyanin cao, mặc khác có thể rút ngắn được thời gian trích ly. 61 3.1.7. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc Phương pháp chiết thích hợp sẽ thu được lượng anthocyanin nhanh và hiệu quả. Trong thí nghiệm này em chiết bằng 2 phương pháp đó là phương pháp soxhlet và phương pháp ngâm chiết ở 60oC bằng bể điều nhiệt. Điều kiện chiết cụ thể cho hai phương pháp chiết như sau: 10g nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi cồn là 1:10, thời gian chiết 2 giờ, nhiệt độ dung môi 60oC. Kết quả nghiên cứu thu được ở bảng 3.5 và hình 3.15. Bảng 3.5. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly bằng hai phương pháp khác nhau 30 26.67 25 20 15 9.96 10 5 Hiệu suất chiết (%) chiếtsuất Hiệu 0 chiết shoxhlet chiết ngâm Phương pháp chiết Hình 3.15. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin Dựa vào kết quả thống kê ở bảng 3.5 và đồ thị ở hình 3.15 ta thấy, phương pháp chiết anthocyanin bằng bể điều nhiệt cho hiệu suất cao hơn rất nhiều so với phương pháp chiết bằng shoxhlet. 62 Khi chiết bằng phương pháp shoxhlet thì yêu cầu nhiệt độ chiết phải cao và thời gian chiết phải đảm bảo đủ lâu mới trích ly được anthocyanin hiệu quả. Ngoài ra việc chiết bằng phương pháp soxhlet thường áp dụng với nguyên liệu có kích thước nhỏ, thường nguyên liệu ở dạng bột hoặc dạng kích thước nhỏ, trong khi ở thí nghiệm này chúng tôi chiết trong thời gian ngắn 2h và nguyên liệu ở dạng cắt nhỏ nên hiệu suất chiết bằng phương pháp soxhlet không cao. Còn khi chiết ngâm bằng bể điều nhiệt thì nguyên liệu tiếp xúc trực tiếp với dung môi nên khả năng khuếch tán chất màu tốt hơn. Do đó, chiết bằng bể điều nhiệt là phương pháp chiết hiệu quả hơn so với chiết bằng phương pháp soxlet và cũng thuận tiện khi áp dụng vào thực tiễn sản xuất. 3.1.8. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc Kết quả nghiên cứu xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết anthocynin được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.16. Bảng 3.6. Kết quả thống kê hàm lượng anthocyanin sau khi trích ly với số lần chiết khác nhau 25 23.31 20 14.98 15 9.8 10 Hiệu suất chiếtsuất Hiệu 5 0 1 2 3 Số lần chiết Hình 3.16. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin 63 Qua kết quả trên ta thấy rằng, chiết lần 1 có hiệu suất cao (23.31%). Sau đó hiệu suất giảm nhanh khi chiết lần 2 (14.98%) và lần 3 (9.8%). Nguyên nhân là sau lần chiết thứ nhất lượng chất màu trong nguyên liệu đã được chiết triệt để nên hiệu suất cao, ở hai lần chiết sau lượng chất màu còn lại không đáng kể nên hiệu suất thấp. Tuy nhiên ở lần chiết thứ 2 hiệu suất đạt được không quá thấp (14,98%), nhưng hàm lượng anthocyanin rất thấp. Tuy nhiên, để tận dụng triệt để nguyên liệu, tránh láng phí có thể chọn chiết 2 lần (chiết lần 1 + chiết lần 2) cho quy trình chiết chất màu từ hoa đậu biếc. 3.1.9. Ảnh hưởng của hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột màu hoa đậu biếc Lượng maltodextrin của từng mẫu sấy phun khác nhau sẽ cho ra màu và khối lượng của bột trong từng mẫu khác nhau. Hình 3.17. Màu của từng loại bột với khối lượng maltodextrin tương ứng Sau khi sấy phun độ ẩm của 3 mẫu từ 4 ÷ 5%, độn mịn tương đối giống nhau nhưng màu thì khác nhau rõ rệt. Dựa vào kết quả trên ta thấy:  Mẫu thứ nhất chứa 20g maltodextrin có màu xanh đậm nhất, nhưng lượng bột ít (10.9g).  Mẫu thứ hai chứa 25g maltodextrin có màu xanh nhạt hơn mẫu thứ nhất và đậm hơn mẫu thứ ba, khối lượng bột sau khi sấy là (13.8g). 64  Mẫu thứ ba chứa 30g maltodextrin có màu xanh nhạt, tuy khối lượng bột nhiều (14.5g) nhưng quá trình sấy lâu hơn hai mẫu trên. Do vậy, chọn điều kiện sấy là 25g (5%) maltodextrin là thích hợp và đạt hiệu quả kinh tế. 3.2. Định tính anthocyanin Kết quả khảo sát sự hiện diện của một số hợp chất có trong hoa đậu biếc. Khảo sát trên hai mẫu: mẫu bột màu và mẫu dung dịch ngay sau khi chiết ở điều kiện tối ưu. Hình 3.18. Định tính mẫu bột Hình 3.19. Định tính dung màu dịch chiết Trong đó:  a: Định tính carbonhydrate, dung dịch xuất hiện màu hồng bền => phản ứng dương tính.  b, c: Định tính saponin, không có bọt xuất hiện trong ống nghiệm => không có sự hiện diện của saponin.  d: Định tính flavonoid, dung dịch xuất hiện màu xanh đen => phản ứng dương tính.  e: Định tính alkaloid, dung dịch xuất hiện kết tủa màu nâu => có sự hiện diện của alkaloid. 65  f: Định tính steroid-triterpenoid, dung dịch xuất hiện màu hồng => phản ứng dương tính.  g: Mẫu đối chứng. Từ kết quả của hình 3.18 và hình 3.19, ta kết luận được sự hiện diện của các hợp chất có trong hoa đậu biếc ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Bảng định tính mẫu hoa đậu biếc Steroid- Saponin Flavonoid Alkaloid Carbonhydrate triterpenoid Mẫu bột + - + + + màu Mẫu dung dịch + - + + + chiết 3.3. Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun của hoa đậu biếc vào một số loại thực phẩm  Kết quả khảo sát loại bột phù hợp giúp màu sản phẩm đẹp và đem lại hiệu quả kinh tế cao. Hình 3.20. Ứng dụng của mẫu bột Hình 3.21. Ứng dụng của mẫu bột chứa 20g maltodextrin chứa 25g maltodextrin 66 Hình 3.22. Ứng dụng của mẫu bột chứa 30g maltodextrin Dựa vào kết quả từ hình 3.20 ÷ 3.22 ta thấy rằng, sản phẩm chứa 20g và 25g maltodextrin có màu xanh tươi, bắt mắt hơn mẫu chứa 30g maltodextrin. Sản phẩm chứa 20g và 25g có màu gần giống nhau. Do đó, chọn mẫu bột chứa 25g maltodextrin giúp tăng tăng hiệu quả kinh tế.  Kết quả khảo sát tỷ lệ bột khi ứng dụng vào một số loại thực phẩm  Ứng dụng làm rau câu: Cố định lượng nước và lượng bột màu, thay đổi số gam bột rau câu với tỷ lệ: 100ml nước, 0,3g bột màu, số gam bột rau câu thay đổi trong 3 mẫu lần lượt là 2g, 4g và 6g. Hình 3.23. Sản phẩm chứa 2g bột Hình 3.24. Sản phẩm chứa 4g bột rau câu rau câu 67 Hình 3.25. Sản phẩm chứa 6g bột rau câu Từ kết quả trên ta thấy rằng, sản phẩm chứa 6g bột rau câu có màu rất nhạt, không đạt giá trị cảm quan. Sản phẩm chứa 4g bột rau câu có màu xanh vừa phải, gây ấn tượng với người nhìn. Còn sản phẩm chứa 2g bột rau câu có màu rất đậm, hiệu suất kinh tế không cao. Do đó, chọn tỉ lệ 4g bột rau câu, 100ml nước với 0,3g bột màu là thích hợp.  Ứng dụng vào xôi: Cố định lượng bột màu, thay đổi số gam nếp theo tỷ lệ: 0,5g bột màu, số gam nếp thay đổi trong 3 mẫu lần lượt là: 40g, 50g và 60g. Cân bột màu, cho vào 1 ít nước để hòa tan bột màu, sau đó cho vào nếp đã được ngâm, trộn đều để khoản 15 phút để màu thấm vào nếp. Hấp chín được sản phẩm ở hình 3.26 – 3.28. Hình 3.26. Sản phẩm chứa 40g nếp Hình 3.27. Sản phẩm chứa 50g nếp 68 Hình 3.28. Sản phẩm chứa 60g nếp Dựa vào kết quả trên ta thấy, sản phẩm chứa 40g và 50g nếp có màu xanh đậm. Sản phẩm chứa 60g nếp có màu xanh vừa phải. Do đó, chọn tỉ lệ 0,5g bột màu với 60g nếp là thích hợp, màu đẹp có giá trị cảm quan tốt.  Ứng dụng vào bánh bò: Cố định lượng bột màu, thay đổi số gam bột bánh bò đã pha sẵn theo tỷ lệ: 0,15g bột màu, bột bánh bao thay đổi trong hai mẫu lần lượt là 40g và 50g. Hình 3.29. Sản phẩm chứa 40g bột Hình 3.30. Sản phẩm chứa 50g bột bánh bò bánh bò Dựa vào kết quả của hình 3.29 và hình 3.30 ta thấy rằng, độ nở của hai sản phẩm là giống nhau. Nhưng sản phẩm chứa 40g bột bánh bò có màu đậm, đạt giá trị cảm quan hơn. Do vậy, chọn tỷ lệ 0,15g bột màu trong 40g bột bánh bò pha sẵn là thích hợp. 69  Ứng dụng vào bánh bao: Cố định lượng bột bánh bao, thay đổi lượng bột màu theo tỷ lệ: 50g bột bánh bao, lượng bột màu thay đổi trong 3 mẫu lần lượt là: 0,8g, 1g, 1,2g. Hình 3.31. Bánh bao sau khi tạo hình Hình 3.32. Bánh bao chứa 0,8g bột Hình 3.33. Bánh bao chứa 1g bột màu màu Hình 3.34. Bánh bao chứa 1,2g bột màu 70 Từ kết quả trên cho thấy, khi ứng dụng bột hoa đậu biếc vào bánh bao vẫn giữ được màu xanh. Trong đó mẫu bánh bao chứa 1g bột màu có màu xanh vừa phải nên chọn tỷ lệ 1g bột màu với 50g bột bánh bao là thích hợp.  Khi ứng dụng bột hoa đậu biếc vào bánh bò và bánh bao, bánh vẫn nở. Điều đó chứng tỏ bột màu hoa đậu biếc có thể ứng dụng vào các sản phẩm có chứa men vi sinh. 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của bột và cao boa đậu biếc đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm  Thực hiện hai nghiên cứu:  Nghiên cứu ảnh hưởng của bột màu trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy của nấm men và vi khuẩn Lactic.  Nghiên cứu khả năng kháng nấm/kháng khuẩn của bột màu. Hình 3.35. Môi trường lỏng vi khuẩn Hình 3.36. Môi trường hansen của Lactic nấm men Từ kết quả của hình 3.35 và 3.36 ta thấy rằng, lactic làm đục ống ngiệm và nấm men vẫn phát triển mạnh mẽ khi có bột màu trong môi trường dinh dưỡng của chúng. 71 Hình 3.37. Khả năng kháng nấm men Hình 3.38. Khả năng kháng nấm men của bột màu của cao chiết Hình 3.39. Khả năng kháng lactic của Hình 3.40. Khả năng kháng lactic của bột màu cao chiết Trong đó:  1: Nồng độ pha loãng 1600mg/ml của bột màu hay cao chiết.  2: Nồng độ pha loãng 800mg/ml của bột màu hay cao chiết.  3: Nồng độ pha loãng 400mg/ml của bột màu hay cao chiết.  4: Nồng độ pha loãng 200mg/ml của bột màu hay cao chiết.  5: Kháng sinh tetracylin.  6: Kháng sinh ampicillin.  7: Mẫu DMSO đối chứng. 72 Dựa vào kết quả từ hình 3.37 ÷ 3.40 ta thấy, nấm men và lactic vẫn phát triển mạnh, không có vòng kháng khuẩn trong đĩa thạch. Do đó, bột màu không kháng nấm men và vi khuẩn Lactic. Nên bột sử dụng được trong sản phẩm chứa hai vi sinh vật đó. 3.5. Quy trình hoàn thiện cho trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc Hoa đậu biếc Xử lý Ngâm chiết Thu bã Lọc lần 1 Thu dịch chiết Cô đuổi dung môi Dịch chiết anthocyanin thô cô đặc Bổ sung 5% maltodextrin Sấy phun Bột màu Đóng gói, bảo quản anthocyanin Hình 3.41. Quy trình hoàn thiện trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc 73 3.6. Kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm Sau khi khảo sát tất cả các thí nghiệm và chọn được thông số thích hợp em thực hiện quy trình đề xuất và đánh giá chất lượng sản phẩm. Hiệu xuất thu được sau khi chiết theo quy trình hoàn thiện đạt được là 10% (tính theo khối lượng cao). Việc tiến hành đánh giá xếp loại chất lượng sản phẩm bột màu bằng phương pháp cảm quan theo TCVN3215-79. Kết quả được trình bày như sau: Bảng 3.8. Kết quả đánh giá chất lượng bột màu anthocyanin từ hoa đậu biếc Điểm của các thành viên Tổng Điểm Hệ số Điểm Chỉ tiêu số trung quan có chất lượng A B C D E điểm bình trọng trọng lượng Màu sắc 4 3 4 4 3 18 3.6 1.2 4.32 Mùi 3 4 4 3 3 17 3.4 0.8 2.72 Vị 3 4 3 3 4 17 3.4 0.8 2.72 Trạng thái (độ mịn, 5 4 4 5 4 22 4.4 1.2 5.28 tơi, khô) Tổng 4.0 15.04 Dựa vào kết quả ở bảng 3.8 ta có, điểm chung 15.04=15 và căn cứ vào điểm trung bình chưa có trọng lượng của các chỉ tiêu (cột 8 – điểm trung bình) và tiến hành đối chiếu so sánh với mục 4.8 của TCVN 3215 – 79 ta có mẫu bột hoa đậu biếc đạt loại trung bình về các chỉ tiêu cảm quan. 74 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau quá trình khảo sát trích ly để thu nhận bột màu anthocyanin với hàm lượng cao từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatean), chúng tôi thu được các kết quả sau:  Điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly là:  Dung môi được sử dụng: etanol  Nồng độ dung môi: etanol 70o  Phương pháp trích ly: ngâm chiết  Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/10  Nhiệt độ trích ly: 60oC  Thời gian trích ly: 2h  Số lần trích ly: 2 lần  Điều kiện thích hợp cho quá trình sấy phun là:  Bổ sung 5% maltodextrin  Nhiệt độ đầu vào: 160oC  Nhiệt độ đầu ra: 70oC  Tốc độ vòi phun: 350ml/giờ  Gió: 0.40m3/phút  Áp suất: 15 - 16×10kPa  Độ ẩm bột màu: 4 - 5%  Anthocyanin được ứng dụng để tạo màu xanh biếc cho một số thực phẩm như: rau câu, xôi, bánh bao, bánh bò. Và có thể sử dụng anthocyanin trong thực phẩm chứa vi khuẩn Lactic và men vi sinh.  Anthocyanin của hoa đậu biếc không ảnh hưởng đến một số loại vi sinh vật dùng trong chế biến thực phẩm. 4.2. Kiến nghị Quá trình nghiên cứu này được thực hiện trong quy mô phòng thí nghiệm với kiến thức và thời gian còn hạn chế. Do đó, chúng tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau: 75  Nghiên cứu sâu hơn quá trình chiết tách anthocyanin từ hoa đậu biếc từ đó tìm ra phương pháp bảo quản phù hợp.  Nghiên cứu các chỉ tiêu để đưa anthocyanin vào danh mục chất màu thực phẩm theo chỉ tiêu Việt Nam.  Đánh giá hoạt tính sinh học của anthocyanin từ hoa đậu biếc.  Định danh một số hợp chất khác trong hoa đậu biếc để đánh giá khả năng dược liệu của hoa này.  Nghiên cứu phân lập hợp chất anthocyanin bằng phương pháp sắc ký cột để xác định các thành phần các chất có trong hợp chất màu anthocyanin.  Nghiên cứu về độc tính của anthocyanin. 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt [1] Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Huỳnh (2013). Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, Trường Đại học Đà Nẵng. [2] Huỳnh Thị Thanh (2011). Anthocyanin và những nguyên liệu chứa anthocyanin, Đồ án môn học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. [3] Kiều Thị Nhi, Nguyễn Tuấn Kiệt, Hoàng Thị Ngọc Nhơn (2017). Nghiên cứu quy trình chiết tách anthocyanin hiệu quả từ hành tím, hành lá, tỏi tía, cần tây, cần ta, Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm 12 (1) (2017) 100-107, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM. [4] Lê Thị Mùi (2004). Thí nghiệm phân tích định lượng, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng. [5] Lê Thị Mùi (2009). Kiểm nghiệm và phân tích thực phẩm, Trường Đại học Đà Nẵng. [6] Nguyễn Đình Triệu (2001). Bài tập và thực hành các phương pháp phổ, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. [7] Nguyễn Thị Trang (2011). Nghiên cứu chiết xuất chất màu anthocyanin từ cây Cẩm, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. [8] Nguyễn Tấn Lực (2014). Nghiên cứu sự ảnh hưởng pH đến màu, độ bền màu và ứng dụng của anthocyanin từ bắp cải tím, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. [9] Nguyễn Thị Tố Nga (2001). Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của các quá trình chiết, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM. [10] Nguyễn Thị Tuyết Trâm, Nguyễn Thị Chí Linh (2017). Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số rau quả bằng phương pháp pH vi sai, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Lạc Hồng. Tiếng anh [11] Anna Bakowska-Barczak (2005). Acylated Anthocyanins as Stable, Natural Food Colorants – A Review, Pol. J. Food Nutr. Sci., Vol. 14/55, No 2, pp. 107-116. [12] Andersen R.A (2005). Algal culturing techniques. Elsevier/Academic Press, Burlington, Mass, pp. 226. 77 [13] Delgado-Vargas, F., A.R. Jimenez, and O. Paredes-Lopez (2000). Natural pigments: Carotrnoids, anthocyanins, and betalains-characteristics, biosynthesis, processing, and stability, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 40:173-289. [14] Francis (1989). Food colourants: Anthocyanins. Cr. Rev. Food Sci. Nutri. 28:273-314. [15] Fantz PR (1991). Ethnobotany of Clitoria (Leguminosae). Economic Botany (New York Botanical Garden Press) 45: 511–520. [16] Jain N, Ohal CC, Shroff SK, Bhutada RH, Somani RS, Kasture VS and Kasture SB (2003). Clitoria ternatea and the CNS. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 75: 529. [17] Kannan, V. (2011), Extraction of Bioactive Compounds from Whole Red Cabbage and Beetroot using Pulsed Electric Fields and Evaluation of their Functionality, Master Thesis, Dept. Food Sci. and Tech., University of Nebraska- Lincoln. [18] Kamkean N., Wilkinson J. M. (2009). The antioxidant activity of Clitoria ternatea flower petal extracts and eye gel. Wiley online Library, phytotherapy research. [19] Manach, C., Wiliamson, G., Morand, C. et al (2005). Bioavaibility and bioeffcacy of polyphenols in humans. l . Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr,81,230S-242S. [20] Mazza, G. and Minitiati, E. (1993). Introduction: Anthocyanin in Fruits, Vegetables and Grains. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp: 1-28. [21] Motohashi S and Nakayama T (2008). Clinical applications of natural killer T cell-based immuno-therapy for cancer. Cancer Sci 99:638-645. [22] Nguyen KTG, Zhang S, Nguyen NT, Nguyen P Q, Chiu M S, Hardjojo A andTam JP (2011). Discovery and Characterization of Novel Cyclotides Originated from Chimeric Precursors Consisting of Albumin-1 Chain and Cyclotide Domains in the Fabaceae Family. Journal of Biological Chemistry, 286: 24275–24287. [23] Niraj Kumar Singh, Jeetendra Kumar Gupta, Kamal Shah, et al (2017). A review on Clitoria ternatea (Linn.): Chemistry and pharmacology. OMICS Group eBooks, 2017. 78 [24] Pendbhaje NS, Sudheendra G, Pthan SM and Musmade DS (2011). Ethanopharmacology, pharmacognosy and phytochemical profile of Clitorea ternatea Linn: An overview. Pharmacology online, 3: 166-175. [25] Puupponen-Pimiä, R.; Aura, A.M.; Oksmancaldentey, K.M.; Myllärinen, P.; Saarela, M.; Mattila-Sanholm, T.; Poutanen, K. (2001). Development of functional ingredients for gut health. Trends Food Sci. Technol., Amsterdam, v.13, pp.3-11. [26] Shipp, J., Abdel-Aa, E. M. (2010). Food Applications and Physiological Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients, The Open Food Science Journal, Vol. 4, pp. 7-22. [27] Terahara N, Oda M, Matsui T, Osajima Y, Saito N, Toki K, et al. Five new anthocyanins ternatins A3, B4, B3, B2 and D2 from Clitoriaternatea flowers. J Nat Prod 1996; 59: 139-144. 
 [28] Trease, GE và Evans, WC (1983). Pharmacopoeia textbook, 12th version, Tindall và Co., London, pp. 343-383. Internet [29] [30] [31]https://caycanhhanoi.vn/cay-canh/cay-hoa-dau-biec-dau-hoa-tim-bong biec?v=e14da64a5617 [32] [33] pham-tu-kinh-nghiem-su-dung-thuc-vat-cua-dong-bao-dan-toc-thieu-so-576/ [34]https://www.researchgate.net/publication/263714827_Clitoria_ternatea_L_Old_ and_new_aspects [34]https://www.researchgate.net/publication/312498930_Phytochemistry_and_pha rmacological_activities_of_Clitoria_ternatea 79 PHỤ LỤC 1. Kết quả xử lý ANOVA cho các thí nghiệm a) Khảo sát nồng độ dung môi Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi nồng độ dung môi: ANOVA Table for Hieu suat chiet by Nong do dm Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 17.5774 4 4.39436 38773.74 0.0000 groups Within 0.00113333 10 0.00011333 groups 3 Total (Corr.) 17.5786 14 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa các nồng độ dung môi: Multiple Range Tests for Hieu suat chiet by Nong do dm Method: 95.0 percent LSD Nong do Count Mean Homogeneous dm Groups 80 3 17.77 X 40 3 20.29 X 50 3 20.3 X 60 3 20.373 X 3 70 3 20.786 X 7 Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for Hieu suat chiet Nong do Count Average Standard dm deviation 40 3 20.29 0.01 50 3 20.3 0.01 60 3 20.3733 0.0057735 70 3 20.7867 0.0152753 80 3 17.77 0.01 Total 15 19.904 1.12054 80 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các nồng độ dung môi khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Nồng độ dung 40o 50o 60o 70o 80o môi Hiệu 20.29b±0.01 20.30b±0.01 20.37c±0.005 20.79d±0.015 17.77a±0.01 suất (%) b) Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: ANOVA Table for B.Hieu suat chiet by Ti le nguyen lieu:dung moi Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 7.17083 6 1.19514 8365.97 0.0000 groups Within 0.002 14 0.00014285 groups 7 Total (Corr.) 7.17283 20 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Multiple Range Tests for B.Hieu suat chiet by Ti le nguyen lieu:dung moi Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups 1:25 3 21.71 X 1:20 3 22.4433 X 1:15 3 22.5133 X 1:12 3 22.93 X 1:10 3 23.25 X 1:08 3 23.3933 X 1:05 3 23.45 X 81 Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for B.Hieu suat chiet Ti le nguyen Count Average Standard lieu:dung moi deviation 1:05 3 23.45 0.02 1:08 3 23.3933 0.0057735 1:10 3 23.25 0.01 1:12 3 22.93 0.0173205 1:15 3 22.5133 0.0057735 1:20 3 22.4433 0.0057735 1:25 3 21.71 0.01 Total 21 22.8129 0.598867 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các nồng độ dung môi khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Tỷ lệ nguyên liệu/dung 1:05 `1:08 1:10 1:12 1:15 1:20 1:25 môi (g/ml) Hiệu 23.45g± 23.39f± 23.25e± 22.93d± 22.51c± 22.44b± 21.71a± suất 0.02 0.006 0.01 0.017 0.006 0.006 0.01 chiết (%) c) Khảo sát nhiệt độ Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi nhiệt độ chiết: ANOVA Table for C.Hieu suat chiet by Nhiet do Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 99.6158 4 24.9039 124519.70 0.0000 groups Within 0.002 10 0.0002 groups Total (Corr.) 99.6178 14 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa các giá trị nhiệt độ chiết khác nhau: 82 Multiple Range Tests for C.Hieu suat chiet by Nhiet do Method: 95.0 percent LSD Nhiet Count Mean Homogeneous do Groups 80 3 17.053 X 3 70 3 17.803 X 3 40 3 18.16 X 50 3 20.22 X 60 3 24.193 X 3 Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for C.Hieu suat chiet Nhiet Count Averag Standard do e deviation 40 3 18.16 0.02 50 3 20.22 0.01 60 3 24.1933 0.0057735 70 3 17.8033 0.0208167 80 3 17.0533 0.0057735 Total 15 19.486 2.6675 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các giá trị nhiệt độ khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Nhiệt độ 40 50 60 70 80 (oC) Hiệu suất 18.16c±0.02 20.22d±0.01 24.19e±0.006 17.8b±0.02 17.05a±0.006 chiết (%) d) Khảo sát thời gian chiết Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi thời gian chiết: ANOVA Table for C.Hieu suat chiet by Thoi gian Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between 11.2406 4 2.81016 3372.19 0.0000 83 groups Within 0.00833333 10 0.000833333 groups Total (Corr.) 11.249 14 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa các giá trị thời gian chiết khác nhau: Multiple Range Tests for C.Hieu suat chiet by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD Thoi Count Mean Homogeneous gian Groups 5h 3 19.966 X 7 4h 3 21.043 X 3 1h 3 21.33 X 3h 3 21.46 X 2h 3 22.67 X Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for C.Hieu suat chiet Thoi Count Average Standard gian deviation 1h 3 21.33 0.0264575 2h 3 22.67 0.01 3h 3 21.46 0.0264575 4h 3 21.0433 0.0208167 5h 3 19.9667 0.0472582 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các giá trị thời gian khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Thời 1 2 3 4 5 gian (h) Hiệu suất 21.33c±0.026 22.67d±0.01 21.46e±0.026 21.04b±0.02 19.96a±0.047 chiết (%) e) Khảo sát phương pháp chiết Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi phương pháp chiết 84 ANOVA Table for untitled.Hieu suat chiet by phuong phap chiet Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 418.836 1 418.836 1675344.60 0.0000 groups Within 0.001 4 0.00025 groups Total (Corr.) 418.837 5 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa các phương pháp chiết: Multiple Range Tests for untitled.Hieu suat chiet by phuong phap chiet Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Chiet 3 9.96 X shoxhlet Chiet 3 26.67 X ngam Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for untitled.Hieu suat chiet Phuong phap Count Averag Standard chiet e deviation Chiet ngam 3 26.67 0.02 Chiet shoxhlet 3 9.96 0.01 Total 6 18.315 9.15245 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa các phương pháp chiết khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Phương pháp chiết Chiết shoxhlet Chiết ngâm Hiệu suất (%) 26.67b±0.02 9.96a±0.01 f) Khảo sát số lần chiết Kết quả phân tích anova thu được khi thay đổi số lần chiết: ANOVA Table for Hieu suat chiet by So lan chiet Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 278.617 2 139.308 659881.95 0.0000 groups 85 Within 0.00126667 6 0.00021111 groups 1 Total (Corr.) 278.618 8 So sánh sự khác biệt hiệu suất chiết giữa số lần chiết: Multiple Range Tests for Hieu suat chiet by So lan chiet Method: 95.0 percent LSD So lan Count Mean Homogeneous chiet Groups 3 3 9.80333 X 2 3 14.98 X 1 3 23.31 X Trung bình hiệu suất và độ lệch chuẩn: Summary Statistics for Hieu suat chiet So lan Count Average Standard chiet deviation 1 3 23.31 0.0173205 2 3 14.98 0.01 3 3 9.80333 0.0152753 Total 9 16.0311 5.90146 Dựa vào kết quả khi tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value <0,05 điều đó có nghĩa là có sự khác biệt giữa số lần chiết khác nhau ở mức ý nghĩa 95% và được thể hiện ở bảng sau: Số lần chiết 1 2 3 Hiệu suất chiết 23.31c±0.017 14.98b±0.01 9.80a±0.015 (%) 2. Một số thiết bị sử dụng khi làm đề tài 86 87