Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học - Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc la mã (matricaria chamomilla)

án bộ tham gia chính: KS. Nguyễn Văn Toàn Nội dung chính: - Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã; - Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa cúc La Mã; - Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được. Kết quả đạt được: - Đã xác định được thông số tối ưu cho quá trình trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã; - Đã xác định định tính thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã và định lượng thành phần dược liệu chính trong hoa cúc La mã; - Đã khảo sát hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu trích ly được. - Đã hướng dẫn luận văn tốt nghiệp 03 sinh viên. Thời gian nghiên cứu: 10 tháng từ tháng 01/2020-10/2020 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI TS. Đặng Thu Thủy i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................4 1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã...................................................................................4 1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã................................................................4 1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã....................................................................................8 1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã...9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................11 2.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................11 2.2. Bố trí thí nghiệm.....................................................................................................11 2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................11 2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh.......................................................................................................................11 2.3.2 Chiết tách thành phần dược liệu bằng phương pháp chưng ninh.......13 2.3.3. Chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt...............................................14 2.3.4. Chiết cao cồn bằng phương pháp Soxhlet.................................................14 2.3.5 Chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn: Soxhlet và chưng ninh.......................................................................................................................15 2.3.6. Phương pháp chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa từ cao cồn.......16 2.3.7. Phương pháp định tính các thành phần của dược liệu................................17 2.3.8. Định lượng thành phần dược liêu (flavonoid) tổng trong cao etyl acetat...18 2.3.9. Xác định thành phần dược liệu (flavonoid) bằng sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ................................................................................................................18 2.3.10. Thử hoạt tính sinh học thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã.19 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................21 3.1. Nghiên cứu chiết tách cao cồn................................................................................21 3.1.1. Nghiên cứu tối ứu hoa hiệu suất tách chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh............................................................................................................21 3.1.2. So sánh hiệu suất chiết cao etanol bằng phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet..24 3.1.3. So sánh hiệu suất chiết tách cao etanol bằng phương pháp chưng ninh và ii Soxhlet-chưng ninh..25 3.2. So sánh hiệu suất chiết tách cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa25 3.3. Định tính thành phần dược liệu trong cao chiết thu được từ hoa cúc La Mã26 3.3.1 Định tính thành phần dược liệu trong cao ete dầu hỏa26 3.3.2. Định tính thành phần trong cao etyl acetate...27 3.4. Kết quả xác định hàm lượng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của thành phần dược liệu (flavonoid) từ hoa cúc La Mã...27 3.4.1. Định lượng thành phần flavonoid trong cao etyl acetat..27 3.4.2. Thành phần các hợp chất flavonoid28 3.4.3. Hoạt tính sinh học của flavonoid29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................31 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................32 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã. Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm. Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh. Hình 2.3. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh. Hình 2.4. Sơ đồ khảo sát chiết cao cồn bằng phương pháp ngấm kiệt. Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát tách chiết hợp chất trong hoa cúc La Mã bằng phương pháp Soxhlet. Hình 2.6. Sơ đồ khảo sát chiết tách thành phần dược liệu qua hai giai đoạn Soxhlet và chưng ninh. Hình 2.7. Sơ đồ chiết cao etyl acetat và ete dầu hỏa. Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang. Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi lên mật độ quang. Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian lên mật độ quang. Hình 3.5. Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin. iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã. Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid. Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine. Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung môi. Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nhiệt độ. Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỷ lệ dược liệu/dung môi. Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian. Bảng 3.5. Hiệu suất chiết cao cồn theo 3 phương pháp chưng ninh, ngấm kiệt, Soxhlet. Bảng 3.6. Hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh và Soxhlet-chưng ninh. Bảng 3.7. Hiệu suất chiết cao etyl acetat và cao ete dầu hỏa. Bảng 3.8. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao ete. Bảng 3.9. Kết quả định tính thành phần dược liệu trong cao etyl acetate. Bảng 3.10. Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu là catechin. Bảng 3.11. Hiệu suất flanovoid toàn phần. Bảng 3.12. Công thức cấu tạo và định danh một số chất. Bảng 3.13. Khả năng kháng khuẩn của flanonoid với vi khuẩn. v vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chamomile (Cúc La Mã) hay ở nước ta còn gọi là Cúc Hoạ Mi là một trong những loài thực vật thuộc họ Hoa Cúc có nguồn gốc từ Nam và Đông Âu. Loại thảo dược này cũng được trồng ở Đức, Hungary, Pháp, Nga, Croatia, và Brazil. Chamomile được biết đến ở Ấn Độ trong thời kỳ Mughal, bây giờ nó được trồng ở Punjab, Uttar Pradesh, Maharashtra, Jammu và Kashmir. Các loài thực vật có thể được tìm thấy ở Bắc Phi, châu Á, Bắc và Nam Mỹ, Australia, và New Zealand. Hungary là nơi trồng chính của loại thực vật này. Tại Hungary, Chamomile cũng mọc nhiều ở vùng đất nghèo và nó là một nguồn thu nhập cho người dân nghèo của khu vực này. Hoa được xuất khẩu sang Đức với số lượng lớn để chưng cất tinh dầu. Tại Ấn Độ, cây đã được trồng ở Lucknow khoảng 200 năm trước, và được đưa đến Punjab khoảng 300 năm trước trong thời kỳ Mughal [6]. Các tác dụng chữa bệnh của Chamomile được loài người phát hiện ra cách đây hàng ngàn năm từ thời La Mã cổ đại, và cũng đã được ghi nhận trong y văn của Hippocrate. Người Hy lạp và La Mã cổ đại đã biết dùng Chamomile để chữa bệnh bằng cách: giã nhỏ đắp hoặc chườm lên các vết thương, vết loét ngoài da giúp phòng nhiễm khuẩn, giảm đau, nhanh liền sẹo; hoặc hãm hay sắc lấy nước uống chữa viêm loét miệng, sưng lợi , đau răng, đau bụng (do tiêu hoá, do kinh nguyệt, ), đau đầu, mất ngủ, căng thẳng, Hoa cúc La Mã từ lâu đã được người Ai Cập cổ xem là một phương thuốc trị bách bệnh. Trà của loại dược thảo quý này đã được sử dụng hàng trăm năm qua với nhiều lợi ích tuyệt vời đối với sức khỏe. Nó có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán phong thấp, giáng hỏa,được dùng làm thuốc chữa nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, tăng huyết áp (có thể dùng xoa bóp lên thái dương, vùng trán, gáy, hay cho thêm vào nước uống hàng ngày) [18]. Trong y học khoa học hiện đại, hoa cúc được hãm hoặc đun sôi lấy nước, và tinh dầu. Hoa cúc La Mã được sử dụng trong thuốc điều điều trị nội và ngoại khoa. Nước hãm từ hoa cúc có tác dụng chống viêm, cầm máu, sát trùng, làm se, giảm đau, an thần, chống co thắt, ra mồ hôi, điều tiết tác động của mật. Số lượng của các hợp chất phenolic được tìm thấy trong hoa cúc được chứng minh hiệu quả lâm sàng trong điều trị sưng phổi, có tác dụng bảo vệ màng tế bào mạch máu. Các chế phẩm hoa cúc được sử dụng trong điều trị nội khoa như đổ mồ hôi, rối loạn co thắt kinh nguyệt, đau bụng, đầy hơi, tiêu chảy, viêm dạ dày, viêm đại tràng; điều trị ngoại khoa như - nước súc miệng, họng và cổ họng. Thuốc sắc từ hoa cúc cũng được sử dụng để rửa vết thương mưng mủ và mắt. Chamazulene trong hoa cúc được sử dụng để điều trị bệnh hen suyễn, thấp khớp, viêm dạ dày dị ứng và viêm đại tràng, eczema, bỏng bởi X-quang. Chamazulene thúc đẩy quá trình tái tạo da, làm giảm các phản ứng dị ứng [18]. Tinh dầu hoa cúc được sử dụng trong hương trị liệu cho chứng mất ngủ, đau nửa đầu, viêm da, cũng như bỏng và eczema. Tinh dầu cũng hoa cúc được khuyến 1 khích sử dụng để điều trị cho bệnh hen suyễn, viêm phế quản, ho, cảm cúm, viêm bàng quang. Mùi tinh dầu hoa cúc có đặc điểm như sau: hơi đắng, ấm và nặng mùi. Mùi tinh dầu hoa cúc có tác dụng an thần. Mùi tinh dầu còn có tác dụng làm giảm đau đầu, cơ bắp, cải thiện hoạt động của não với tinh thần mệt mỏi, làm giảm kích ứng và làm dịu những cơn bộc phát. Trong lĩnh vực hương trị liệu, tinh dầu hoa cúc được khuyên dùng pha loãng trong nước dùng cho bệnh đau trong ruột; pha trong trà khác khi bị co giật; pha trong nước với mật ong khi bị kích thích thần kinh. Khi trầm cảm nhà hương trị liệu chuyên nghiệp Joan Redford khuyến cáo rằng, nên sử dụng dầu hoa cúc trong xông hơi hoặc nhỏ vào trong bồn tắm. Hoa cúc sấy khô được bỏ chiếc gối thảo dược thơm, thúc đẩy thư giãn cơ bắp. Tinh dầu hoa cúc có thể giúp ngăn ngừa các phản ứng dị ứng sau khi bị côn trùng cắn, hay làm giảm vết bầm tím. Dưỡng thể với tinh dầu hoa cúc được sử dụng đối với vết bỏng, bong gân, và da bị cháy nắng. Nếu bị kích ứng da ở trẻ sơ sinh có thể áp dụng mát xa, hoặc tắm với tinh dầu hoa cúc [18]. Chiết xuất hoa cúc đối với da có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, làm dịu, giảm đau, giữ ẩm, tái tạo, làm dịu và chữa lành. Chính vì thế nó là một phần của các sản phẩm mỹ phẩm cho da nhạy cảm. Cúc La Mã - một trong những dược liệu được tiêu thụ nhiều nhất trong y học. Vào năm 1986, cúc La Mã là nguyên liệu được khuyên dùng làm thuốc tại 26 quốc gia. Tổng sản lượng hoa cúc khô trên toàn thế giới năm 2007 lên đến 65000 tấn. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Tuy nhiên hiện nay nguồn tài nguyên cây thuốc không còn nguyên vẹn nữa. Hiện nay, theo thống kê mới nhất của Viện Dược liệu (2007), có 144 loài cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng cần được bảo tồn. Trong số đó có rất nhiều loài cây thuốc quí như Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis), Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), các loài Hoàng liên (Berberis spp.), Bách hợp (Lilium brownii), Biến hóa núi cao (Asarum balansae), Thanh mộc hương (Aristolochia tuberosa), Ba kích (Morinda officinalis), Đảng sâm (Codonopsis javanica) Chính vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên “mới” có hoạt tính sinh học cao, có khả năng nhân rộng ở quy mô công nghiệp để làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Hoa cúc La Mã được du nhập vào Việt Nam ở thời gian gần đây chủ yếu qua đường tiểu ngạch và được bán rải rác ở những hiệu thuốc, cửa hàng mỹ phẩm. Sản phẩm chính của hoa cúc được một số nhà phân phối cung cấp là tinh dầu và trà hoa cúc với giá cao. Ngoài ra cúc La Mã mọc ở rất nhiều nơi ở Việt Nam, đặc biệt là ở những vùng khí hậu mát mẻ như Tây Nguyên và Đà Lạt. Tuy nhiên việc sự dụng loại dược liệu này còn rất nhiều e ngại trong tâm lý người tiêu dùng do chưa có một nghiên cứu chính thức một cách khoa học và có hệ thống được công bố trong nước về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loại hoa này. Chính vì vậy việc “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã 2 Matricaria chamomile” để phổ biến rộng rãi loại dược liệu này trong nước là cấp thiết. Để đạt được mục tiêu trên, nghiên cứu cần thực hiện những nội dung như sau: - Thu thập, nghiên cứu tài liệu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hoa cúc La Mã, cũng như tình hình sử dụng loại dược liệu này trên thế giới và trong nước; - Nghiên cứu phương pháp chiết tách thành phần dược liệu trong hoa cúc La Mã; - Xác định định tính và định lượng nhóm hợp chất hoạt động sinh học của hoa cúc La Mã; - Khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất trích ly được. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm của hoa cúc La Mã Hoa cúc La Mã (Matricaria chamomile hay còn gọi là Roman Chamomile) là cây thảo dược lâu năm với rễ chùm, phát triển theo chiều ngang, số lượng rễ lớn do vậy khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh. Thân mọc đứng gần mặt đất và phân nhánh, lá kép dài và hẹp với các đoạn hình dải nhọn như gai, cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 10-30 mm,với một vòng đơn các cánh hoa hình lưỡi trắng và ở giữa rất nhiều hoa con hình ống màu vàng xếp trên mặt đế hoa phồng lên tạo dạng nón sau khi hoa nở [4], [5]. Đặc điểm hình thái của hoa cúc La Mã được thể hiện ở hình 1.1. Hình 1.1. Cây hoa Cúc La Mã 1.2. Thành phần dược liệu của hoa cúc La Mã Theo kết quả nghiên cứu trước đây( [6], [7], [8], [15]) thì thành phần các hợp chất có trong hoa cúc La Mã rất đa dạng. Tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng và phát triển mà tỷ lệ các hợp chất trong hoa cúc La Mã ở mỗi vùng miền khác nhau. Qua các nghiên cứu cho thấy phần lớn các hợp chất có trong hoa cúc La Mã chủ yếu bao gồm các tinh dầu dễ bay hơi, các flanovoid, coumarin, các polyphenol khác, đường,. a) Tinh dầu dễ bay hơi Về thành phần tinh dầu dễ bay hơi, hoa cúc La Mã có chứa khoảng 0,6-2,4 % tinh dầu dễ bay hơi. Thành phần hợp chất của tinh dầu khá phức tạp và cho đến nay có hơn 140 hợp chất đã được xác định chủ yếu là các dẫn chất của monoterpen, 4 sesquiterpen, các chất có nhân thơm, dẫn chất có chứa N, S. Các thành phần chính của hợp chất có trong tinh dầu dễ bay hơi của hoa cúc La Mã là: 25,85-36 % iso-butyl angelate; 10,9-23,7 % iso-amyl iso-butyrate; 11,7-19,9 % iso-amyl tigliate; 12 % propyl tigliate; 5,3-17,9 % iso-amyl angelate và 3,7-5,3 % iso- butyl iso-butyrate.Hơn nữa, tinh dầu có chứa đến 4% monoterpene: như α- và β-pinen, β-myrcene, limonene, γ-terpinene, p-xymen, camphene, (-) - pinocarvone và (-) - trans-pinocarveol; và 1,54 % dẫn xuất của sesquiterepene bao gồm:β-selinene, α- và β- cubene, α- và β-caryophyllene, chamazulene, farnesene, cadinen, bisabolane [16]. Một nghiên cứu khác nữa cho thấy trong tinh dầu hoa Cúc La Mã chứa các sesquiterpene chính là Chamazulene (19,9 %), α-Bisabolol (20,9 %), A và B Bisabolol-oxide (tương ứng là 21,6 % và 1,2 %), β-farnesen (3,1 %), α- và β- caryophyllene, caryophyllene-oxide và spathulenol, một số monoterpene như β- phellandrene (0,8 %), limonene (0,8 %), β-ocymene (0,4%) và γ-terpinen (0,2 %) [16]. Các thành phần chiếm tỉ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã có công thức cấu tạo như bảng 1.1. Bảng 1.1. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong tinh dầu hoa cúc La Mã. Tên hợp chất Công thức cấu tạo n-butyl angelate n- butyl tigliate 1,8- Cineole β- Myrcene α- Pinene 5 Limonene Α- bisabolol Chamazulene Farnesene Về tính chất, tinh dầu hoa cúc La Mã là chất lỏng trong suốt, nhẹ hơn nước, không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan nhiều trong cồn và các dung môi hữu cơ khác. Tinh dầu hoa cúc La Mã có màu xanh nhạt do các hợp chất azulen. Dưới tác dụng của oxy không khí, một phần tinh dầu chủ yếu là hợp chất không no bị oxy hóa và cho mùi nhựa [16]. b) Flavonoids Về thành phần các hợp chất flanvonoid có trong hoa cúc La Mã chiếm khoảng 0,5%, chủ yếu ở dạng glycosid: bao gồm flavone apigenin và luteolin, các quercetin và flavonol glycosides họapigenin-7-apiosylglucoside, luteolin-7-glucoside và quercetin- 3-mtin [2]. Các thành phần flavonoid chiếm tỷ lệ cao trong hoa cúc La Mã được thể hiện trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong flavonoid. Tên các hợp chất Công thức cấu tạo Apigenin 6 Luteolin Quercetin Về tính chất, các hợp chất flavonoid có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm -OH đã methyl hoá).Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi không phân cực mà tan được trong nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng [2]. c) Coumarin Catechin là thành phần làm cho hoa có màu nâu khi khô. Coumarine Scopolin (7-β-D-glucopyranosyl-scopoletin), umbelliferone, herniarin, scopoletin là các thành phần cũng đã được xác định [17]. Các thành phần hợp chất coumarin chiếm tỉ lệ cao trong hoa cúc La Mã được thể hiện trong bảng 1.3. Bảng 1.3. Các thành phần hợp chất chiếm tỷ lệ cao trong coumarine. Tên các hợp chất Công thức cấu tạo Scopolin Umbelliferone Herniarin 7 Về tính chất, Coumarin là những chất kết tinh không màu, một số lớn dễ thăng hoa có mùi thơm. Ở dạng kết hợp glycosid thì có thể tan trong nước, ở dạng aglycon thì dễ tan trong dung môi kém phân cực. Coumarin có vòng lacton nên bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan trong nướcnếu acid hóa thì sẽ đóng vòng trở lại [4]. d) Các thành phần còn lại trong hoa cúc Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy –OH. Các hợp chất phenol trong tự nhiên như: flavonoid, xanthon, coumarin, quinon, các polyphenol (lignin, tanin, ). Tanin là hợp chất polyphenol, có vị chát, tanin hầu như không tan trong dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, tốt nhất là nước nóng. Glycosid là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp chất này gồm hai thành phần là phần đường và phần không đường. Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme thực vật hoặc dung dịcd acid hoặc kiềm. Phần đường trong glycosid chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccaride, thường là glucose, rhamnose, galactose nói chung các glycoside có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong été dầu hỏa, hexan, benzen nhưng tan được trong cloroform, dietyl ether, tan tốt trong acol và nước. Các acid béo là 1 nhóm hợp chất hữu cơ bao gồm những este của acid béo với các alcol. Chất béo nhẹ hơn nước, tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực như benzen, ete, chloroform, ít tan trong cồn và không tan trong nước. Sáp là este cùa các acid béo có mạch cacbon dài và rượu đơn hoặc đa chức, nằm trên các mô bì của thực vật. Sáp rất trơ hóa học, không tan trong nước nhưng tan trong rượu. 1.3. Tác dụng của hoa cúc La Mã Tại Ai Cập, Hy Lạp và La Mã, thảo dược này được sử dụng như một phương thuốc thảo dược hàng ngàn năm nay.Ở các tài liệu [6], [9], [13],[15], [16], hoa cúc La Mã có tác dụng làm dịu tinh thần, được sử dụng để trấn an giấc ngủ, giảm căng thẳng thần kinh, giúp làm sạch và bảo vệ vết thương khỏi bị nhiễm trùng. Sử dụng như một phương thuốc tự nhiên chữa các mẫn ngứa, kích ứng, giảm sưng do phát ban và các bệnh nhiễm trùng khác. Giảm bớt các vấn đề đau lưng, thấp khớp, đau bụng kinh, chống co thắt đường ruột, điều trị ho, sốt rét, nhiễm giun ký sinhvà các bệnh về tiêu hóa. Cúc La Mã không chỉ là một loại thuốc trong dược điển của 26 quốc gia mà ngoài ra nó còn phục vụ đắc lực cho công cuộc làm đẹp của nữ giới. Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy hoa cúc La Mã chứa các thành phần có tác dụng chữa bệnh điển hình như: - Tác dụng chống co thắt: Đã được quy cho một sốthành phần hoạt tính của hoa cúc, đặc biệt là các flavonoid (anthemidin, apigenin, luteolin), glycosid, coumarin 8 (herniarin và umbelliferone)và các loại dầu dễ bay hơi của nó (có chứa alpha và Bisabolol matricine) [16]. - Tác dụng chống oxy hóa: Chamazulenelà một chất chống oxy hóa mạnh có giá trị trong quá trình chống viêm. Nó đã được chứng minh để ngăn chặn cyclooxygenase enzyme trong quá trình tổng hợp prostaglandin. Tác dụng chống viêm của nó có thể là do sự ức chế hình thành leukotriene B4. Ngoài ra tác dụng chống oxy hóa còn do thành phần apigenin của nó [14]. - Tác dụng chống viêm: Một số thành phần của hoa cúc bao gồm apigenin-7- glucoside, luteoline, hợp chất terpene, herniarine, matricin, chamazulene, (-) alpha- bisabololoxides A và B, và (-) alpha-bisabolol, patuletin, umbelliferone, quercetin, myricetin, rutin, và spiroethers đã được nghiên cứu trong các hoạt tính chống viêm. Trong đó các bisabolol và các flavonoid có tác dụng chống viêm cao nhất so với các thành phần còn lại. [6], [9], [17].Các thử nghiệm đã được tiến hành để kiểm tra với sự phù nề trên chân của loài chuột Sprague-Dowley [13]. - Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt tính kháng khuẩn của hoa cúc đã được các nhà khoa học nghiên cứu trong ống nghiệm và kết quả rất đáng khích lệ. Thành phần coumarin, hernearin có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm trong sự hiện diện của ánh sáng cực tím. Nó cũng đã được chứng minh hiệu quả như một thành phần chống lại nấm Candida albicans. Chống lại một số chủng vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Ức chế sự tăng trưởng của B. anthracis, Micrococcus glutamicus, B. sacchrolyticus, B. thuringiensis, Sarcina lutea, B. stearothermophilus, Lactobacillus plantarum, và Lactobacillus casei [12],[13], [14]. - Tác dụng chống ung thư: Tác dụng chống ung thư của apigenin, một hợp chất flavonoid trong hoa cúc, đã được nghiên cứu trên động vật, apigenin giảm số lượng các ung thư biểu mô tế bào da UVB gây ra ở chuột, apigenin đã được tìm thấy để đàn áp 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate gây xúc tiến khối u ở da chuột và được chứng minh là một thành phần chống nắng hữu ích. Sesquiterpenoids, nobilin, và dẫn xuất của nó đã chứng minh kháng u chống lại các tế bào khối u của con người trong ống nghiệm [18]. - Tác dụng chống Alzheimer:Các flavonoid như quercetin có tác dụng chống Alzheimer thông qua ức chế acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase [2], [9]. - Tác dụng chống viêm loét dạ dày: Bisabolol đã được tìm thấy và nghiên cứu là làm giảm lượng enzyme phân giải protein tiết ra pepsin của dạ dày mà không cần bất kỳ sự thay đổi xảy ra trong lượng axit dạ dày, do đó nó đã được đề nghị để điều trị bệnh đường ruột [13]. 1.4. Phương pháp chiết tách thành phần hoạt tính sinh học từ hoa cúc La Mã 9 Chiết xuất dược liệu là phương pháp sử dụng dung môi lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật. Nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên chứa các tinh chất quý giá. Nguyên liệu thường ở dạng tươi hoặc đã qua sơ chế, hoặc sấy khô. Sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi dung dịch này được gọi là dịch chiết. Chiết xuất dược liệu hướng đến mục đích: tạo ra các chế phẩm toàn phần, tách chiết riêng các hoạt chất tinh khiết; thu nhận chúng dưới dạng tinh khiết nhất để làm thuốc mới hoặc bán tổng hợp ra thuốc mới; làm cho dược liệu có tác dụng mạnh hơn; giảm tác dụng phụ không mong muốn của thảo dược. Chiết xuất là bước đầu tiên để tách các sản phẩm tự nhiên mong muốn khỏi các nguyên liệu thô. Phương pháp chiết bao gồm chiết bằng dung môi, phương pháp chưng cất, ép và thăng hoa theo nguyên tắc chiết. Chiết dung môi là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Việc chiết xuất các sản phẩm tự nhiên tiến triển qua các giai đoạn sau: (1) dung môi thâm nhập vào cấu trúc rắn; (2) chất tan hòa tan trong dung môi; (3) chất tan được khuếch tán ra khỏi chất rắn; (4) các chất hòa tan được thu thập. Bất kỳ yếu tố nào tăng cường độ khuếch tán và độ hòa tan trong các bước trên sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết xuất. Các tính chất của dung môi chiết, kích thước hạt của nguyên liệu thô, khẩu phần dung môi đến chất rắn, nhiệt độ chiết và thời gian chiết sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Phương pháp chiết xuất dược liệu bằng siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của các chất trong môi trường dung môi. Tăng quá trình khuếch tán, được áp dụng trong quy mô lớn. Đầu phát siêu âm được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Phương pháp chiết xuất bằng vi sóng: Có tác dụng khuấy trộn, làm tăng tiếp xúc pha. Làm cho hiệu suất phản ứng được lớn hơn. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi: dịch chiết còn được cô đặc. Thêm vào đó bằng dung môi hữu có không phân cực. Trong khuôn khổ của đề tài cao chiết từ hoa cúc La Mã bằng phương pháp ngấm kiệt, chưng ninh, Sohxlet, và Sohxlet kết hợp chưng ninh. 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Để “Nghiên cứu trích ly thành phần dược liệu từ hoa cúc La Mã Matricaria chamomile” trong khuôn khổ của đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là hoa cúc La Mã khô, sau đó nguyên liệu được nghiền thành bột với độ ẩm 10 %. 2.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm, Khoa Kỹ thuật Công nghệ & Nông nghiệp Công nghệ cao, Trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu, Trung tâm phân tích Trường đại học Khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh và Phòng thí nghiệm Vi khuẩn-Khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur TP.HCM. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở hình 2.1. Hoa cúc Xử lý Chiết cao cồn Chiết cao etyl Chiết cao ete acetate dầu hỏa Định tính thành phần dược liệu Định lượng và xác định thành phần thành phần hóa hoc, hoạt tính sinh học flavonoid trong dược liệu Hình 2.1. Sơ đồ bố trí nội dung thí nghiệm. 2.3. Phương pháp nghiên cứu [1] 2.3.1. Nghiên cứu tối ưu hóa hiệu suất chiết cao cồn bằng phương pháp chưng ninh 11 Quy trình chiết tách theo phương pháp chưng ninh được thực hiện theo sơ đồ ở hình 2.1. Hoa cúc Xử lý Cồn Chưng ninh Lọc Bã Đo quang Hình 2.2. Quy trình chiết tách dược liệu bằng phương pháp chưng ninh. a) Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nồng độ etanol tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nồng độ dung môi tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ với 3 nồng độ cồn (96o, 70o, 50o) trong 3 giờ ở nhiệt độ 60 oC. Tỷ lệ “dung môi : nguyên liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được nhiệt độ tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các nhiệt độ (50 oC, 60 oC, 70 oC, 78 oC) trong 3 giờ với nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tỷ lệ “dung môi/nguyên liệu” (20:1). Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. c) Nghiên cứu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ảnh hưởng tới hiệu suất chiết 12 Mục đích: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được tỷ lệ tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các tỷ lệ dung môi và nguyên liệu (1:10; 1:20; 1:30; 1:40; 1:50) trong 3 giờ ở nhiệt độ tối ưu với nồng độ dung môi tối ưu như đã khảo sát ở trên. Tháo hệ thống sinh hàn sau khi kết thúc thí nghiệm. Dịch chiết được làm lạnh bằng nước đá sau đó đem đi lọc bằng máy lọc hút chân không. Pha loãng mẫu và đo quang ở bước sóng 390 nm. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. d) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất chiết Mục đích: khảo sát ảnh hưởng thời gian lên mật độ quang khi thực hiện chiết bằng phương pháp ngâm ninh, nhằm tìm ra được thời gian tối ưu để tối ưu hóa quy trình tách chiết. Thực nghiệm: Cân 1,5 g hoa cúc cho vào bình cầu 2 cổ có lắp nhiệt kế để đo nhiệt độ. Lắp hệ thống sinh hàn hồi lưu. Thực hiện chưng ninh trên bếp khuấy từ ở các thời gian (1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ) ở nhiệt độ tối ưu vớ