Bài giảng Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh

virut, vi khuẩn, vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh đã và đang được lựa chọn.1.Đặt vấn đề:Thuốc trừ sâu vi sinh chủ yếu được sản xuất ra từ các chủng vi sinh vật (VSV) như virus, vi khuẩn, vi nấm được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc lên men công nghiệp nhằm tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ được các loài sâu bệnh hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Các vi sinh vật được sử dụng để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học là vi khuẩn, virus và vi nấm. Cụ thể có: Chế phẩm vi khuẩn trừ sâuChế phẩm virus trừ sâuChế phẩm nấm trừ sâu2.Những giải pháp được lựa chọn để sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.2.1. Chế phẩm vi khuẩn trừ sâuVi khuẩn được sử dụng để sản xuất chế phẩm trừ sâu là những vi khuẫn có tinh thể protein độc ở giai đoạn bào tử. Những tinh thể này rất độc đối với một số loài sâu bọ nhưng lại không độc với nhiều loài khác.Tinh thể protein độc có hình quả trám hoặc hình lập phương . Sau khi nuốt phải bào tử có tinh thể protein độc , cơ thể sâu bọ bị tê lệt và bị chết sau 2 đến 4 ngàyLoài vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu nhất là Baccillus thuringiensis. Từ loài vi khuẩn này người ta sản xuất ra thuốc trừ sâu Bt. Baccillus thuringiensis trực khuẩn gram dương, dạng hình que, hình thoi hoặc ở dạng chuỗi nhiều phân tử.Hình thành bào tử và tinh thể độc tố.Tính độc hay tính diệt sâu của vi khuẩn BT phụ thuộc vào các độc tố do vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển.Ở loài vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus  còn gặp tinh thể độc  (parasoral body) hình quả trám, có bản chất protein và chứa những độc tố có thể giết hại trên 100 loài sâu hại (tinh thể độc chỉ giải phóng độc tố trong môi trường kiềm do đó các vi khuẩn này hoàn toàn vô hại với người, gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản- có hại đối với tằm). Bacillus sphaericus Bacillus thuringiensis 8Tinh thể protein tiền độc tố nằm trong bào tử BtBT sinh ra 4 loại độc tố:Ngoại độc tố α (α-exotoxin)Ngoại độc tố β (β-exotoxin)Ngoại độc tố γ (γ-exotoxin)Nội độc tố δ (δ-endotoxin)Trong 4 loại này nội độc tố được chú ý nhất và nó quyết định hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn.Quy trình sản xuất chế phẩm BtGiống GốcSản xuất giống cấp IChuẩn bị môi trườngKhử trùng môi trườngGây giống sản xuấtỦ vả theo dõi quá trình lên men52 – 54h, pH = 7, 30OCThu hoạch và tạo dạng chế phẩm_Nghiền lọc bổ sung phụ gia_Sấy khô_đóng gói bảo quảnĐặc điểmYếu tố gây chết: tinh thể δNhờ bộ men của côn trùngPhá hủy ruột giữaTác động đường ruộtTổng hợpNhiễm trùng đường tiêu hóa Cơ chế tác động của BTCơ chế diệt côn trùng Chuyển gene BT vào thực vậtThực vật được chuyển gen BT Bông vải Các loại rau Thuốc lá Bắp Chế phẩm BTTHUỐC TRỪ SÂU Vi-BT 32000WP Được sản xuất bằng lên men chìm hoặc lên men bề mặt.Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringienisDùng những hạt cơ chất rắn đóng vai trò là nguồn chất dinh dưỡng hoặc chỉ là chất mang vô cơ.Vd: cám lúa mỳ, bột ngô, bánh hạt bông loại dầuLên men bề mặtChọn môi trường dinh dưỡng tối ưu phù hợp với từng chủng BT.Quan tâm các thông số: nhiệt độ, pH, độ oxi hòa tan, tốc độ thông khíLên men chìmMột số loại sâu mà BT có thể phòng trừ1.Thuốc trừ sâu Xentari 35 WDG (Sản phẩm của Công ty Valent BioSciences – Hoa Kỳ)- Hoạt chất của thuốc là vi khuẩn Bacillus thuringiensis, subsp. aizaiwai - Thuốc an toàn đối với người sử dụng, môi trường và quần thể thiên địch, không độc với cá và ong, độc với tằm.- Thời gian cách ly: 5 ngày- Thuốc có tính chọn lọc cao, diệt trừ rất hữu hiệu hơn 60 loài sâu hại thuộc bộ cánh phấn (Lepidoptera) như sâu tơ, sâu xanh da láng, sâu ăn tạp, sâu đo, sâu loang, sâu hồng, sâu đục bông, sâu đục trái, trên rau cải, cà chua, dưa leo, đậu, hành tỏi, thuốc lá, bông vải, nho .- Liều lương sử dụng: pha 15-20 g/bình 8 lít. Phun cho thuốc phủ đều trên bề mặt của các bộ phận của cây rau cần được bảo vệ.- Phun thuốc sớm khi sâu còn ở tuổi nhỏ. Nên phun vào chiều mát khi sâu hoạt động mạnh.- Không pha chung với thuốc có tính kiềm, thuốc có gốc đồng, phân hóa học, thuốc trừ bệnh kháng sinh.- Không sử dụng thuốc trên cây dâu tằm, tránh phun thuốc gần nơi nuôi tằm 2.2 Chế phẩm virus trừ sâuHiện nay người ta đã phát hiện hơn 250 bệnh virus ở 200 loài sâu bọ. Ở giai đoạn sâu non, sâu bọ dễ bị nhiễm virus nhất . Khi mắc bệnh , cơ thể sâu bọ bị mềm nhũn do các cơ bị tan rã . Màu sắc và độ căng của cơ thể bị biến đổi Để sản xuất ra chế phẩm virus trừ sâu, người ta gây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên sâu non (Vật chủ). Nghiền nát sâu non đã bị nhiễm virus và pha với nước theo tỉ lệ nhất định, lọc lấy nước dịch thu virus đậm đặc. Từ dịch này sản xuất ra chế phẩm thuốc trừ sâu N.P.VDùng để trừ sâu róm thông, sâu đo, sâu xanh..Nuôi sâu giốngNuôi sâu hàng loạtNhiễm bệnh virus cho sâuPha chế thực phẩm :-Thu thập sâu bệnh.-Nghiền, Lọc-Li Tâm-Thêm chất Phụ gia Sấy khôKiểm tra chất lượngChế biến thức ăn nhân tạoĐóng góiQuy trình công nghệ SX chế phẩm vius trừ sâuMột số họ virus diệt côn trùng24Họ virusHình thái hạt virusKích thước hạt (nm)Kích thước thể vùi (µm)BaculoviridaeHình queNPV 40-60 x 200-400GV 30-60 x 260-3600,3-15Reoviridae (CPV)Đa diện đối xứng55-590,3-0,5Entromopoxviridae (EPV)Hình trứng165-300 x 150-4700,2-10Iridoviridae (IV)Đối xứng125-3001-24AscoviridaeHình que130 x 400-BirnaviridaeĐối xứng60-CaliciviridaeHình cốc38-NodaviridaeĐối xứng29-ParviviridaeCân đối18-26-PicornaviridaeCầu22-39-Polydnaviridaetròn150 x 350-RhapdoviridaeĐạn hoặc que50-59 x 130-380-TetraviridaeĐối xứng35-39-Trong các nhóm thì Baculovirus và CPV là 2 nhóm có khả năng diệt sâu rất cao. Vì vậy nhiều nước trên thế giới đã tập trung nghiên cứu để sản xuất ra thuốc trừ sâu virus. Một đặc điểm quan trọng của virus là tác nhân gây bệnh mang tính chuyên tính có phổ kí chủ riêng ví dụ virus sâu xanh chỉ có thể lây bệnh cho sâu xanh, virus sâu tơ chỉ lây bệnh cho sâu tơ, do đó tên virus gắn liền với tên kí chủ.NPV (Nuclear polyhedrosis virus - virus đa diện nhân): chứa nhiều hạt virus (virion) trong mỗi thể vùi đa diện nhân (polyhedral inclusion body). SNPV (single nuclear polyhedrovirus): chỉ có 1 nucleocapsid trong mỗi hạt virus MNPV (multiple nuclear polyhedrovirus): nhiều nucleocapsid trong mỗi hạt virus.GV (granulovirus - virus hạt): chỉ có 1 virion trong mỗi thể vùi dạng hạt. Mỗi virion chỉ chứa 1 nucleocapsid. Các loại Baculovirus27nucleocapsidVirionThể vùiMNPVSNPVGVCơ chế tác động2829Biểu hiện của sâu bị bệnh30VD virus sâu xanh hại bông: Trong 2-3 ngày đầu là thời kỳ ủ bệnh. Sâu non không có biểu hiện gì rõ rệt và không thay đổi về sức ăn. Sau 5-7 ngày thấy các đốt thân sâu sưng phồng lên, căng phồng và mọng nước. Cơ thể sâu chuyển sang mầu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ. Trước khi chết sâu thường leo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, chúc đầu xuống dưới. Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết → hiện tượng sâu chết treo Dịch trắng tiếp tục chảy ra không có mùi hôi.Nuôi sâu ký chủ - Thu sâu giống - Trữ nhộng – Ghép cặp bướm – Thu trứng – Nuôi tập thể (Tuổi 1 - tuổi 2) – Nuôi cá thể (Tuổi 3 - tuổi 4) – Lây nhiễm NPV Ha – Thu sâu chết do NPV - Nghiền lọc sâu bệnh �- Ly tâm để thu dịch Virus ( Kiểm tra chất lượng Virus tb/ml) - Hỗn hợp tạo thuốc virus (thử sinh học lại trên sâu) – Hoàn thiện sản phẩmQuy trình sản xuất thuốc trừ sâu virus sâu xanh NPV32Một số chế phẩm baculovirus thương mạiTên sản phẩmNhóm baculovirusSpod-X(Thermo Trilogy)Spodoptera exigua Nucleopolyhedro Virus (SeNPV)GemStar (ThermoTrilogy),Elcar (Novartis)Helicoverpa zea Nucleopolyhedro Virus (HzNPV)Cyd-X, (Thermo Trilogy)Madex (Andermatt Biocontrol, Thụy Sỹ), Granusal (Behring AG, Werke, Đức), Caprovirusine (NPP, Pháp)Cydia pomonella Granulo Virus(CpGV)Mamestrin (National Plant Protection, Pháp)Mamestra brassicaeNucleopolyhedro Virus (MbNPV)VPN (Agricola El Sol, Brazil)Anticarsia gemmatalis Nucleopolyhedro Virus (AgNPV)Gusano (Thermo Trilogy)Autographa californica Nucleopolyhedro Virus (AcNPV)Spodopterin (National Plant Protection, Pháp)Spodoptera littoralis Nucleopolyhedro Virus (SINPV)33 2.3 Chế phẩm nấm trừ sâuCó rất nhiều nhóm nấm gây bệnh cho sâu. Trong số này có hai nhóm: nấm túi và nấm phấn trắng dc ứng dụng rộng rãi trong phòng trừ dịch hại cây trồng.Nấm túi ký sinh trên nhiều loại sâu bọ và rệp khác nhau. Sau khi bị nhiễm nấm cơ thể sâu bị trương lên. Nấm càng phát triển thì các hệ cơ quan của sâu bọ càng bị ép vào thành cơ thể. Sâu bọ yếu dần rồi chếtGiống thuần(BeauveriaBassiana)Môi trườngNhân sinh Khối(camNgô)Rải mỏng đểHình thànhBào tử trongTình trạng Thoáng khíThu sinhKhối nấm_sấy đóng gói_bảo quản_sử dụngNấm bột Nomuraea Rileyi (để sản xuất ra chế phẩm sinh học nấm bột trừ sâu hại rau) Nấm Beauveria, còn gọi là nấm cương  tằm - hoạt động theo cơ chế: Khi được phun vào rừng có sâu nấm Beauveria bào tử dạng tiềm sinh sẽ phát tán bám vào và ký sinh trên thân sâu, phát triển thành dạng sợi chọc thủng thân sâu làm cho sâu tê liệt rồi chếtNấm Beauveria Gồm 2 bước:Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu và tạo môi trường thứ cấpBước 2: Nhân sinh khối nấm trên môi trường thứ cấpQuy trình sản xuất nhanh ometar (nấm xanh) ở nông hộ để phòng trừ sâu hại cho cây trồng và rầy nâu hại lúa Ống nước nhựa có đường kính 2,5 cm cưa thành từng đoạn khoảng 2 - 2,5 cm. Bịch nylon chịu nhiệt kích thước 22 x 32 cm. Bông không thấm để làm nút bông, dây thungiấy báo; tấm gạo loại nhỏ và rẻ tiền.Bước 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu: Kỹ thuật làm môi trường thứ cấp: Cho tấm gạo vào bịch nylon chịu nhiệt , 300g cho 150 - 180ml nước sạch vào mỗi bịch tùy theo độ dẻo của tấm. Dùng đoạn ống nước 2,5 cm tạo miệng bịch nylon để có thể cấy nấm vào.bông không thấm làm nút bông. Lấy giấy bịt kín đầu nút bông lại.Lắc đều , cho vào nồi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 100 độ C (nước sôi) trong thời gian 2 giờ.Sau khi hấp tiệt trùng môi trường thứ cấp đưa ra phòng sạch, để nguội, Tháo lớp giấy bịtBóp cho môi trường tơi ra trước khi cho vào tủ cấy.Các ống giống phải thuần, không bị nhiễm tạp và bào tử phải được dễ dàng bong ra.Bước 2: Nhân sinh khối nấm trên môi trường thứ cấpTiến hành- Tủ cấy được khử trùng bằng đèn cực tím (bật đèn cực tím trong thời gian khoảng 1,5 - 2 giờ) và vệ sinh bằng cồn cho các bịch môi trường thô và các ống nấm giống vào. Tháo nút bông lấy không khí sạch trong tủ cấy vào bịch càng nhiều càng tốt cho một lượng bào tử nấm xanh thích hợp vào(một ống giống cấy được khoảng 8-15 bịch môi trường thô). Đậy nút bông lại, đảo đều bằng cách lắc bịch nấm, rồi lấy bịch môi trường thô đã cấy ra khỏi tủ cấy. Dùng giấy báo bịt kín đầu bông Ghi ngày cấy lên bịch xếp các bịch nấm đã cấy lên kệ cao, để nơi khô ráo thoáng mát cho nấm phát triển.Sau khi cấy 3-4 ngày phải đảo nấm Cần đảo kỹ, đều, tránh vón cục và hạn chế tối đa việc mất không khí. Sau đó cứ 3 ngày thì tiến hành đảo nấm một lần cho tới khi có thể sử dụng được (khoảng 15 ngàyNhược điểmƯu điểmƯu điểm và nhược điểm của việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinhGiáo trình Công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và sử lý ô nhiễm môi trường.Phạm Hữu Thương, Bài dự thi “công nghệ sinh học trên internet”.ài liệu tham khảoChân thành cảm ơn Thầy và các bạn đã theo dõi!!The End