Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến sự thay đổi cấu trúc của khóm

nh Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang i Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ ĐẾN SỰ THAY ĐỔI CẤU TRÚC CỦA KHÓM” do Phạm Ngọc Tạo thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. GVHD GVPB Trần Thanh Trúc Lý Nguyễn Bình Cần thơ, ngày tháng năm 2007 Chủ tịch hội đồng Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang i LỜI CÁM ƠN Qua ba tháng nghiên cứu đề tài luận văn tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đến hôm nay đã hoàn thành quá trình nghiên cứu và thu được những kết quả như mong muốn. Tất cả những thành quả có được như ngày hôm nay chính là nhờ sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thanh Trúc, giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm luận văn và giúp em hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm và tất cả các bạn học cùng lớp đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các cô trong thư viện Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình tìm tài liệu tham khảo. Xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 5 năm trên giảng đường Đại học. Kính chúc quí thầy cô và các bạn luôn thành công trong công việc và trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày … tháng … năm 2007 Sinh viên Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang ii TÓM TẮT Nghiên cứu ảnh hưởng của các quá trình tiền xử lý đến sự cải thiện cấu trúc của khóm đã được tiến hành ở những khía cạnh khác nhau nhằm hạn chế việc sản phẩm bị quá mềm hay quá dai trong quá trình chế biến. Ở đây trong phạm vi của đề tài chúng tôi chỉ nghiên cứu tác động của việc bổ sung enzyme PME cà chua đến sự cải thiện cấu trúc của khóm. Theo đó, enzyme PME được trích ly từ cà chua có khả năng tác động đến việc phân cắt mạch pectin nhằm tạo điều kiện cho việc hình thành calci-pectate. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng PME cà chua sử dụng (với 4 mức độ 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%) trong môi trường nước cất và dung dịch đệm có pH 8,0 cho thấy: hàm lượng PME cà chua bổ sung là 2% trong môi trường dung dịch đệm cho độ cứng lớn nhất khi kết hợp với chế độ tiền xử lý ở nhiệt độ 45oC. Đồng thời, khả năng tác động của enzyme PME đạt hiệu quả tốt nhất (1,3 lần) khi khóm sau giai đoạn tiền xử lý được tồn trữ ở nhiệt độ từ 4 – 6oC sau 2 giờ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN............................................................................................................... i TÓM TẮT..................................................................................................................... ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH SÁCH HÌNH..................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... vi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU..................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN ................................................................................................ 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3 2.1 THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA VÁCH TẾ BÀO THỰC VẬT.................... 3 2.2 ĐẶC TÍNH CỦA THÀNH TẾ BÀO .............................................................. 4 2.3 PECTIN METHYLESTERASE (PME).......................................................... 5 2.3.1 Giới thiệu chung ..................................................................................... 5 2.3.2 Pectin methylesterase thực vật ................................................................ 6 2.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA PME CÀ CHUA TRONG VIỆC CẢI THIỆN CẤU TRÚC................................................ 7 2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme ............................................................. 7 2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................................... 8 2.4.3 Ảnh hưởng CaCl2 đến sự thay đổi độ cứng của rau quả........................... 9 2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU ....................................................... 10 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 12 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ..................................................................... 12 3.1.1 Thời gian, địa điểm ................................................................................ 12 3.1.2 Dụng cụ - Hóa chất ................................................................................ 12 3.1.3 Nguyên liệu............................................................................................ 12 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH ........................................ 13 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................................... 13 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang iv 3.2.2 Phương pháp đo độ cứng của khóm ....................................................... 13 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM................................................................................... 14 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng PME đến khả năng cải thiện cấu trúc trong môi trường khác nhau ....................................................... 14 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự thay đổi độ cứng theo nhiệt độ của khóm khi có bổ sung PME .............................................................................................. 17 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian tồn trữ sau khi tiền xử lý đến khả năng tác động của PME trong việc cải thiện độ cứng của khóm ............... 18 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................. 20 4.1 TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC BỔ SUNG ENZYME PME ĐẾN KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CẤU TRÚC CỦA KHÓM ..................................................................... 20 4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME PME CÀ CHUA........................................................................................ 23 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỒN TRỮ LẠNH ĐẾN SỰ THAY ĐỔI ĐỘ CỨNG CỦA KHÓM ........................................................................................... 24 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................... 27 5.1 KẾT LUẬN.................................................................................................... 27 5.2 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 28 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... vii Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang v DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Vách tế bào thực vật ......................................................................................... 4 Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin ...................................................................................... 4 Hình 3: Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân của PME đối với pectin............................. 6 Hình 4: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl................................... 7 Hình 5: Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất......................................... 8 Hình 6: Sự tạo thành calci-pectate trên tế bào thực vật .................................................. 9 Hình 7: Sự thay đổi độ cứng của dâu tây khi bổ sung PME ........................................... 10 Hình 8: Mẫu nguyên liệu khóm ..................................................................................... 13 Hình 9: Thiết bị đo Rheotex và dao cắt.......................................................................... 14 Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ PME đến khả năng cải thiện cấu trúc của khóm trong môi trường khác nhau ............................................................. 16 Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát độ cứng của khóm (lực cắt) ở các nhiệt độ tiền xử lý khác nhau .................................................................................................................. 18 Hình 12: Mẫu khóm đã bổ sung PME thực vật trong môi trường nước hay dung dịch đệm ............................................................................................................................... 21 Hình 13: Mối quan hệ giữa độ cứng và hàm lượng enzyme khi xử lý khóm trong các môi trường khác nhau.................................................................................................... 22 Hình 14: Mối quan hệ giữa độ cứng và nhiệt độ khi xử lý khóm trong môi trường đệm 24 Hình 15: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ cứng của khóm theo thời gian tồn trữ lạnh (sau quá trình tác động của PME cà chua và CaCl2) ...................................................... 26 Hình 16: Quy trình trích ly PME từ cà chua .................................................................. vii Hình 17: PME cà chua sau khi trích ly .......................................................................... viii Hình 18: Cà chua dùng cho trích ly enzyme .................................................................. viii Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme PME và môi trường sử dụng đến khả năng cải thiện độ cứng (g lực) của khóm ....................................................................... 21 Bảng 2: Ảnh hưởng nhiệt độ tiền xử lý đến sự thay đổi độ cứng của khóm ................... 23 Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian tồn trữ lạnh (ngày) đến độ cứng và giá trị cảm quan của khóm....................................................................................................................... 25 Bảng 4: Sự thay đổi độ cứng của khóm theo thời gian tồn trữ lạnh (sau quá trình tác động với PME cà chua và CaCl2) .................................................................................. 25 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TỔNG QUAN Khóm (Ananas comosus) là một trong những trái cây nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, được trồng phổ biến ở Việt Nam. Khóm được sử dụng chủ yếu để ăn tươi hoặc dùng chế biến các dạng thành phẩm hay bán thành phẩm. Các sản phẩm từ khóm cũng rất đa dạng, nhiều chủng loại như: khóm đóng hộp, khóm lạnh đông (đây là dạng bán thành phẩm), đồ hộp khóm nước đường, các sản phẩm nước trái cây, hay các loại mứt đông khóm (jam, jelly làm từ khóm). Tuy nhiên, việc xử lý nhiệt nhằm tiêu diệt các vi sinh vật, kéo dài thời gian bảo quản trong chế biến các sản phẩm trái cây là nguyên nhân làm thay đổi giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm cuối, đặc biệt là sự biến đổi cấu trúc. Hiện nay, trong quá trình chế biến các sản phẩm đồ hộp khóm, do yêu cầu đảm bảo giữ được cấu trúc của sản phẩm cuối, nguyên liệu khóm ở độ chín 2 (độ chín 2 hàng mắt) thường được chọn. Ở độ chín này, khóm không có vị ngọt cao và màu sắc nhạt. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra biện pháp cải thiện cấu trúc khóm nhằm có thể sử dụng khóm ở độ chín cao hơn là một vấn đề cần thiết. Cấu trúc của khóm cũng như các loại rau củ khác phụ thuộc vào độ chín của nguyên liệu mà chủ yếu là sự thay đổi tính chất của pectin (Leshem et al., 1986). Tuy nhiên, cấu trúc của màng tế bào thực vật có thể được cải thiện bằng việc hình thành phức hợp calci-pectate từ sự kết hợp giữa pectin với ion Ca++ nhờ vào quá trình ngâm nguyên liệu vào dung dịch chứa ion Ca++ hay bổ sung trực tiếp muối Ca vào dung dịch phối chế (Smout et al., 2004; Vu et al., 2004). Để trợ giúp cho quá trình tạo thành phức hợp này, thành phần pectin của màng tế bào cần được thủy phân dưới tác động của enzyme PME, tạo thành pectin có độ methoxyl hóa thấp, giúp việc hình thành calci- pectate thuận lợi hơn. Quá trình này đã tiến hành trên nhiều loại rau quả bằng cách kích hoạt enzyme pectin methylesterase (PME) có sẵn trong nguyên liệu hay bổ sung từ bên ngoài (vi sinh vật hoặc thực vật) và thu được nhiều kết quả khả quan (Luna- Guzmán et al., 2000; Duvutter, 2005; Vu et al., 2006). Các nghiên cứu cải thiện cấu trúc khóm cũng đã được tiến hành bằng cách tiền xử lý nhiệt kết hợp ngâm khóm trong dung dịch CaCl2 (Trần Thanh Trúc, 2006). Tuy nhiên, khả năng cải thiện cấu trúc theo đường hướng kích hoạt enzyme PME nội bào chưa đạt hiệu quả cao. Chính vì thế, việc nghiên cứu bổ sung PME từ bên ngoài nhằm đẩy nhanh tốc độ hình thành acid pectinic, gia tăng sự hình thành phức hợp calci-pectate, cải thiện độ cứng của sản phẩm là điều cần thiết. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 2 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Bước đầu khảo sát ứng dụng enzyme pectin methylesterase cà chua vào việc cải thiện cấu trúc khóm trong quá trình chế biến. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 THÀNH PHẦN CẤU TẠO CỦA VÁCH TẾ BÀO THỰC VẬT Các nghiên cứu về cải thiện độ cứng của rau củ đều có liên quan đến thành phần cấu tạo và tính chất của vách tế bào thực vật. Vách tế bào là đặc điểm của tế bào thực vật để phân biệt với tế bào động vật, vách bảo vệ tế bào, giữ hình dạng, tránh sự mất nước cũng như chống sự xâm nhập của vi sinh vật (hình 1). Vách ở phía ngoài của màng có thể dày từ 0,1 đến vài µm. Thành phần hóa học của vách thay đổi từ loài này sang loài khác và từ tế bào này sang tế bào khác trong cùng một cây, nhưng cấu trúc cơ bản không thay đổi. Thành phần cấu tạo chính là các phân tử cellulose có dạng sợi được kết dính với nhau bằng chất nền gồm các đường đa khác và protein. Các phân tử cellulose cấu trúc thành các sợi cellulose xếp song song nhau tạo ra các tấm, các sợi trong các tấm khác nhau thường tạo ra các góc từ 60 ÷ 90o. Đặc điểm sắp xếp này làm vách tế bào rắn chắc. Các sợi cellulose có chiều rộng khoảng 20 nm, giữa các sợi có những khoảng trống có thể cho nước, khí và các ion di chuyển tự do qua mạng lưới này, tính thấm chọn lọc của tế bào là do màng sinh chất quy định. Ở những cây còn non tế bào có vách mỏng gọi là vách sơ cấp (primarry wall), vách này có tính đàn hồi và cho phép tế bào gia tăng kích thước. Giữa hai vách sơ cấp của các tế bào liền kề nhau là phiến giữa hay lớp chung (middle lamella), là một lớp mỏng giàu chất bột đường đa gọi là pectin, thường hiện diện dưới dạng calci-pectate. Khi chất pectin bị hóa nhày, các tế bào không còn gắn chặt vào nhau nữa nên khi trái chín trở nên mềm đi. Khi tế bào trưởng thành và ngừng tăng trưởng, một số tế bào tạo thêm lớp cứng hơn gọi là vách thứ cấp (secondary wall) nằm giữa vách sơ cấp và màng tế bào. Vách thứ cấp thường dày có nhiều lớp được cấu tạo bằng các sợi cellulose xếp theo nhiều thường khác nhau, nên vách tế bào trở nên rắn chắc hơn. Ngoài cellulose vách thứ cấp còn có thể tẩm thêm nhiều chất khác như mộc tố (lignine). Khi vách thứ cấp được thành lập hoàn toàn, tế bào có thể chết đi, khi đó chúng chỉ còn làm nhiệm vụ nâng đỡ hay dẫn truyền. Trên vách của tế bào thực vật có những lỗ nhỏ giúp các chất thông thương với nhau, các lỗ này được gọi là cầu liên bào (plasmodesmata), ở vị trí này tế bào chất của hai tế bào liền kề liên tục nhau (Bùi Tấn Anh, 2002). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 4 Hình 1: Cấu tạo của vách tế bào thực vật Nguồn: www.ippa.info/what_is_pectin.htm 2.2 ĐẶC TÍNH CỦA THÀNH TẾ BÀO Thành tế bào chủ yếu là pectin ngoài ra còn những thành phần khác như cellulose và hemicellulose. Do đó, đặc tính tạo cấu trúc của tế bào phụ thuộc vào đặc tính của pectin. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: pectin hoà tan và protopectin. Pectin là một polymer được hình thành nhờ những đơn vị acid polygalacturonic gắn kết nhau bởi các liên kết α-1,4 glycoside. Trong pectin tự nhiên có khoảng 2/3 nhóm acid được ester hóa bằng methanol. Pectin có độ ester hóa cao thì có khả năng tạo gel bền trong dung dịch đường có nồng độ cao hơn 65%, chẳng hạn như các sản phẩm jam, jelly. Khi bị thủy phân thì nhóm methoxyl của pectin bị giảm do đó hình thành gel với ion Ca++ ở nồng độ đường thấp hơn. Khi thủy phân hoàn toàn nhóm methyl ester của pectin sẽ tạo thành acid pectic – trong cấu tạo có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị của acid polygalacturonic. Pectin từng được xem là bao gồm cả carbohydrate khác như: arabans, galactans, …các thành phần này được xem như là các thành phần tạp chất không mong muốn. Tuy Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 5 nhiên, hiện nay các nghiên cứu đã cho thấy các loại đường như L - rhamnose, L-arabinose, D - galactose và vết của một số loại đường khác là thành phần cấu tạo không thể thiếu của phân tử pectin (Cready và Gee, 1960, được trích dẫn bởi Gerald Reed, 1966). Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp. Trong thành phần chính pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca++, Mg++, các gốc acid phosphoric, acid acetic và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid hoặc dưới tác dụng của enzyme protopectinase hay khi đun nóng thì giải phóng pectin hoà tan. Trong bào tương, pectin nằm ở dạng hòa tan. Trong màng tế bào và gian bào, chúng nằm ở dạng không hòa tan gọi là protopectin. Protopectin ở màng gian bào có chứa lượng kim loại khá cao và một lượng nhóm methyl đủ để làm protopectin bền vững. Còn protopectin ở màng tế bào chứa một lượng kim loại không nhiều, có độ methoxyl hóa cao. Vì thế, tế bào thực vật có khả năng trương nở tốt (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.3 PECTIN METHYLESTERASE (PME) 2.3.1 Giới thiệu chung PME (EC 3.1.1.11) là enzyme rất dễ tìm trong tự nhiên như trong thực vật, vi khuẩn, nấm mốc (Rexova-Benkova và Markovic, 1976; Versteeg, 1979). Trong các tế bào vi sinh vật, PME nằm trên thành tế bào trong quá trình hình thành tế bào, cùng với các enzyme phá hủy thành tế bào khác như cellulases, polygalacturonase, pectin và pectate lyases, protease (Goldberg, 1984). Chính vì thế, PME được xem là enzyme đầu tiên tác dụng lên pectin. Trong tế bào thực vật, sự hoạt động của PME liên kết chủ yếu với sự thay đổi vách tế bào. Khi tế bào thực vật phát triển hoàn thiện, các thành phần tế bào được phân chia, hoạt động của PME tập trung chủ yếu ở từng bộ phận tế bào đã được phân chia này. Tùy thuộc vào nguồn gốc của enzyme mà khả năng hoạt động của PME có thể đạt được giá trị tối ưu trong các điều kiện khác nhau. Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trường chứa ion và chịu tác động lớn bởi pH. Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ưu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 đến 9 (Bordenave, 1996). Hai loại PME thường được sử dụng là PME cà chua và PME vi sinh vật - chủ yếu từ nấm mốc Aspergillus aculeatus PME. Giá trị pH tối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là phù hợp cho Aspergillus PME (Duvetter, 2006). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 6 Phản ứng thủy phân pectin được thực hiện bằng PME ở đơn vị galacturonic chứa ester bên cạnh nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova-Benkova và Markovic, 1976) (hình 3) và kết quả là hình thành methanol, proton và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn. Điều này dẫn đến sự thay đổi thuộc tính tạo keo của pectin nên làm tăng độ nhớt của rau quả và làm giảm pH. Hình 3 : Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân của PME đối với pectin Nguồn: Duvetter, 2006 2.3.2 Pectin methylesterase thực vật Bên cạnh PME vi sinh vật, enzyme PME còn được tìm thấy ở hầu hết các loại trái cây như cà chua, chuối, táo, kiwi, cam,…. Enzyme PME thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PME thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp như Ca++ có khuynh hướng làm tăng độ hoạt động của enzyme. Các ion Ca++ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ lần lượt là 0,005M và 0,05M (Bordenave, 1996). Ở thực vật chứa ít nhất là hai dạng enzyme: PME1 và PME2. Cả hai đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Các PME thực vật có khả năng chịu nhiệt tốt hơn những enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc. PME của cà chua sẽ bị mất 50% hoạt tính sau thời gian gia nhiệt 1 giờ ở nhiệt độ 70oC trong dung dịch NaCl 0,1M tại giá trị pH = 6. Đối với các PME thực vật có pH tối ưu cao (pH khoảng 8,0) sẽ dễ mất mát hoạt tính trong quá trình xử lý. Enzyme có thể bị mất hoạt tính đến 50% sau 5 phút khi đun ở 67oC. Các PME acid và kiềm có thể khử gốc methyl của cơ chất pectin theo cùng một kiểu. PME kiềm làm hình thành các pectin được ester hóa và pectin này có thể tạo gel mạnh với ion Ca++. PME acid tạo ra pectin bị este hóa có khả năng tạo gel yếu với ion Ca++. Các PME ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối galacturonic acid không bị ester hóa rất mẫn cảm với calci (hình 4). Các cấu trúc khác nhau của chuỗi galacturonan chẳng hạn như các monomer acetyl hóa, các nhóm ester bị chuyển đổi thành amid hay bị khử đến rượu bậc một, hay sự tồn tại của các vùng có nhiều mạch nhánh có khả năng ức chế hoạt động của PME. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 7 Hình 4: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl Thủy phân ở vị trí gần nhóm carboxyl tự do PME nấm mốc: pH tối thích 4,5; thủy phân vị trí bất kỳ PME thực vật: pH tối thích >7; thủy phân ở những vị trí đã được định trước PME có tính đặc hiệu cao đối với nhóm methylester của acid polygalacturonic. Các ester khác chỉ bị tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của acid polymanuronic thì không hề bị tấn công. Tốc độ loại ester trên mạch pectin phụ thuộc vào độ dài của mạch trimethyl trigalacturonate không bị tấn công. Các PME của nấm khác với PME của thực vật theo cơ cấu đa mạch, các nhóm methoxyl bị lấy đi một cách ngẫu nhiên (Lý Nguyễn Bình, 2004). 2.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA PME CÀ CHUA TRONG VIỆC CẢI THIỆN CẤU TRÚC 2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme tức là nồng độ enzyme càng lớn thì vận tốc phản ứng càng lớn. V = k [E] Trong đó: V: vận tốc phản ứng k: hằng số tốc độ (hằng số vận tốc) [E]: nồng độ enzyme Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 8 Hình 5: Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004 2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Giống như các phản ứng xúc tác bởi enzyme khác, tốc độ loại methoxyl của pectin nhờ vào tác động của PME được gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein nên nó không bền với tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme đều mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC (Phạm Thu Cúc, 2002). Khi tăng nhiệt lên 10oC thì vận tốc tăng lên từ 1,4÷2 lần, nhưng khi tăng nhiệt độ đến một mức độ nào đó thì cũng đồng thời có tác dụng ngược lại làm giảm vận tốc phản ứng do hậu quả của việc biến tính enzyme bởi nhiệt gây nên. Nhiệt độ ứng với độ hoạt động cao nhất của enzyme được gọi là nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ tối thích của các enzyme khác nhau thì khác nhau. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme thay đổi trong khoảng 45 – 55oC, một số enzyme khác có khoảng nhiệt độ hoạt động cao hơn, dao động từ 50 – 70oC (Basah và Ramaswamy, 1998), phụ thuộc vào nguồn enzyme. Những đặc tính của mô tế bào thực vật còn sống phụ thuộc vào sự sắp xếp cấu trúc và thành phần hóa học của tế bào và khoảng gian bào chứa pectin. Quá trình gia nhiệt có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của tế bào, pectin bị phá vỡ và những đặc tính vật lý của tế bào cũng thay đổi theo. Trong suốt quá trình chế biến nhiệt rau, quả cũng sẽ bị mềm do sự phân cắt tế bào (Van Buren, 1979). Khi xử lý rau quả ở nhiệt độ trung bình (60oC, 30 phút) cấu trúc của rau, quả bị ảnh hưởng mạnh (Fuchigami et al., 1995). Tuy nhiên, enzyme PME có ảnh hưởng đến cấu trúc rau, quả ở nhiệt độ 60-70oC và sự ảnh hưởng này theo hướng có lợi. Basah và Ramaswamy (1998) khi nghiên cứu về sự hoạt động của enzyme PME và khả năng cải thiện độ cứng cũng cho thấy có sự hoạt động của enzyme PME ở nhiệt độ khoảng 50 ÷ 70oC. Trong quá trình xử lý nhiệt ở áp suất cao có thể làm tăng hoạt tính của enzyme PME. Hoạt tính của PME thực vật có thể được gia tăng bởi tác động của áp suất và đạt được cường độ hoạt động tối ưu ở áp suất thay v Vmax 0 S Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 9 đổi trong khoảng 200 – 500 MPa và nhiệt độ từ 50 – 57oC (Castro et al., 2006; Sila et al., 2007; Verlent et al., 2004). Thêm vào đó, khi tế bào thực vật chịu tác động của áp suất lớn hơn 350 MPa thì cũng không ảnh hưởng đến cấu trúc của rau, quả (Knorr, 1995). Stute et al., (1996) nhận xét quá trình xử lý ở áp suất cao không làm mềm rau, quả trong suốt quá trình chế biến và cấu trúc của nó cũng giống như chưa xử lý rau, quả bằng áp suất. Del Valle et al., (1998) đã nghiên cứu ở các quá trình tiền xử lý (xử lý nhiệt kết hợp với ngâm muối Calci) có ảnh hưởng đến cấu trúc của rau, quả. Những nghiên cứu của các tác giả cho thấy kết hợp việc ngâm CaCl2 và xử lý ở áp suất cao 300 MPa, 60oC trong 15 phút có thể giảm được sự mềm của rau, quả. Ngoài ra, một số tác giả khác cũng có những ý kiến tương tự trên như Fuchigami et al., (1995) và Vu et al., (2004)… 2.4.3 Ảnh hưởng CaCl2 đến sự thay đổi độ cứng của rau quả Muối Calci thường được sử dụng trong công nghiệp như một tác nhân tạo sự rắn chắc cho rau, quả. Cấu trúc của nhiều loại rau, quả sẽ được cải thiện khi ngâm trong dung dịch muối calci (Luna-Guzmán et al., 1999 và 2000). Kết quả quá trình ngâm calci là tạo sự ổn định cho hệ thống màng tế bào và hình thành calci-pectate, làm phiến giữa và vách tế bào trở nên cứng hơn (Lee et al., 1979; Jackman và Stanley, 1995). Mặt khác, muối calci có thể tác động lên mô tế bào góp phần làm tăng tính nguyên vẹn của tế bào và kết quả là giữ vững hay tăng lực cứng của tế bào (Luna-Guzmán et al., 2000) (Hình 6). Hình 6: Sự tạo thành calci-pectate trên tế bào thực vật Nguồn:Lý Nguyễn Bình, 2004 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Trang 10 Main et al.,(1986) nhận thấy việc sử dụng muối Calci lactate sẽ cải thiện được cấu trúc của quả dâu tây đóng hộp. Kết quả này cũng được nghiên cứu bởi tác giả French et al., (1989) trên quả mơ đóng hộp trong trường hợp sử dụng muối calci chlorua (CaCl2). Các nghiên cứu của Abbot et al., (1989) hay Lurie và Klein (1992) đã cho thấy, độ giòn của táo được duy trì và cải thiện nhờ việc ngâm táo sau thu hoạch trong dung dịch CaCl2 1%. Đặc biệt, nghiên cứu của Luna-Guzmán et al., (1999) cũng cho thấy độ giòn của dưa (Cucumis melo L. var. reticulatus) gia tăng 300% so với điều kiện bình thường khi được ngâm trong dung dịch CaCl2 2,5% với thời gian 1 phút. Độ cứng của cà rốt cũng được cải thiện khi ngâm nguyên liệu 1 giờ trong dung dịch CaCl2 0,5% (Sila et al., 2003; Vu et al., 2004). 2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU Vai trò của enzyme pectinase trong việc cải thiện độ cứng của rau quả đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà nghiên cứu. Hoff và Bartolome (1972) đã xác nhận ảnh hưởng tích cực của việc tiền xử lý nhiệt đến việc cải thiện cấu trúc rau quả nhờ vào sự hoạt động của enzyme PME ở nhiệt độ khoảng 45 – 65oC. Bên cạnh tiến trình cải thiện cấu trúc nhờ kích hoạt PME có sẵn trong nguyên liệu, đối với một số loại rau quả có chứa hàm lượng PME thấp, việc cải thiện cấu trúc dựa trên phản ứng của Ca2+ và pectin có độ methoxyl thấp tạo calcipectate sẽ được tiến hành nhờ v._.