Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme Bromelain trong quả dứa (khóm)

ề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện Trần Thanh Trúc Nguyễn Thị Thu Thủy Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007 Chủ tịch hội đồng Nguyễn Văn Mười Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i LỜI CẢM TẠ
Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến: Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp; Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá trình thực hiện đề tài; Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập. Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khóa học vừa qua. Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 Sinh viên thực hiện Lê Kim Thanh Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i TÓM TẮT Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi của các thành phần và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý. Bên cạnh đó, sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những biến đổi không mong muốn như trên. Một trong những nguyên nhân gây ra điều này đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme protease_bromelain quả. Đề tại này được đặt ra với mục đích là tìm ra quy luật hoạt động của hệ enzyme bromelain quả từ dịch chiết quả dứa ở các điều kiện xử lý pH = 4,6 – 9,5 và nhiệt độ từ 10 – 75 0C. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ quả dứa được sử dụng cho nghiên cứu enzyme bromelain tốt nhất từ ngày bảo quản thứ tư trở đi; và bảo quản dịch chiết chứa enzyme tốt nhất là ở điều kiện lạnh đông. Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả trong dịch chiết. Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 20 0C ở môi trường pH thấp, 30 – 40 0C ở môi trường pH kiềm (pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60 0C ở môi trường pH trung tính (pH = 6,8 -7,1). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii MỤC LỤC TÓM TẮT ........................................................................................................... trang i MỤC LỤC ................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN........................................................................................................ 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................... 2 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA................................................................................. 2 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA........................................................... 3 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa ................................................................... 3 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain ............................................................................. 4 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain .............................................. 5 i. Cấu tạo............................................................................................................. 5 ii. Hoạt tính enzyme bromelain............................................................................. 6 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain ................................ 7 i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ ....................................................................... 7 ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH............................................................................... 8 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME ............................................................. 9 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản..................................................................... 9 2.3.2 Động học phản ứng enzyme.............................................................................. 10 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN................................................................. 11 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN........................... 12 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii 3.1.1 Nguyên liệu...................................................................................................... 15 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 15 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm .......................................................................................... 15 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 16 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu .......................................... 16 3.2.2 Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................... 20 4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc tính enzyme ................................................................................................................ 20 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein ........................................................ 22 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 26 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 26 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 27 PHỤ LỤC .................................................................................................................... v Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến.................................................................................. 2 Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus).................................................................................... 3 Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain ..................................... 6 Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine ......................................................................... 6 Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pHmôi trường lên hoạt tính enzyme........................... 8 Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) ............................................................ 16 Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%........................................................................ 16 Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 21 Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản ................. 22 Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa.................................................................................. 23 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau............................................................................................................................. 24 Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở pH thấp ................................................................................................................................ 25 Hình 13. Đường chuẩn tyrosine............................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein ................................................................. 12 Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 20 Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain quả .................................................................................... xii Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Khoảng 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa ra một khuyến cáo rằng “với một quả dứa mỗi ngày, bạn sẽ không cần gặp bác sĩ” (Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên đã được khoa học thực tiễn xác minh là phù hợp với dược tính đặc biệt của quả dứa. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài Ananas có khả năng dược lý cao là do trong thành phần của quả có hệ enzyme bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa. Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae. Enzyme này đã mang đến cho giống dứa Ananas sự nổi tiếng về khả năng dược lý trong việc chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa và giảm đau, giảm sưng do viêm nhiễm. Về mặt thực phẩm, dứa là một loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và rất được ưa chuộng. Về mặt khoa học, dứa là một nguồn thực vật chứa loại enzyme đặc biệt có dược tính cao. Trong chế biến thực phẩm từ quả dứa, vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến sự biến đổi về thành phần, giá trị dinh dưỡng và hệ enzyme trong quả dứa. Với vai trò không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả dứa cũng cần được quan tâm đúng mức. Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi về hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả, cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc tác của chúng. Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain quả” cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm từ quả dứa. Từ vấn đề đặt ra trên, việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của hệ enzyme bromelain trong quả dứa là cần thiết, nhằm tạo tiền đề và cơ sở cho việc nghiên cứu lâu dài về hệ enzyme này. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên cùng một loại cơ chất. Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2 Ruộng dứa Dứa Queen CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Ông đã đem chúng về Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả họ citrus (Anon, 1993). Dứa có tên khoa học là Ananas comosus. Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae. Một số giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ).. (Collin et al., 1931). Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và một số nước cận nhiệt đới như đảo Hawaii, Đài Loan.. Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng Dứa Cayenne Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3 Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha. Dứa là một loại quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao. Dứa được sử dụng trong chế biến thực phẩm và rất được ưa chuộng. Thành phần hóa học của quả dứa bao gồm nước (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine nhóm B, vitamine C và các khoáng chất Fe, Na, K, P, Mg.. Ngoài ra trong quả dứa còn có một hệ các acid hữu cơ đa dạng, tạo nên vị chua, thơm hấp dẫn cho quả như acid citric (28 – 66% tổng lượng acid trong quả) (Gortner, 1963), acid ascorbic (từ 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% tổng lượng acid trong quả (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic..Hàm lượng acid trong quả thay đổi theo độ chín của dứa và chúng được phản ánh bởi thông số pH. Khi trái chín chuyển sang màu vàng, độ pH giảm xuống từ 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982). 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa. Giống như ở các loại thực vật khác, hệ enzyme trong cây dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với các đặc tính khác nhau, trong đó, nhóm enzyme protease chiếm đa số. Protease trong dứa gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme bromelain; ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) - Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965). - Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong dịch thân và quả dứa. Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al., 1972). - Từ cây dứa loài Ananas, người ta đã tìm thấy được có tối thiểu 4 loại cysteine protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ thân dứa là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4 comosain. Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả. - Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al., 1968). - Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.; Caffini N.O.; López L.M.I, 2003). Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng với số lượng rất thấp. 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain (bromeline) Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ XIX. Năm 1892, nhà khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme có khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas Comosus (pineapple). Ông đã gọi nó là “bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromeline” hay “bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được tìm thấy từ những cây giống cây dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae. (Nguồn: truy cập ngày: 15/12/2006) Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài Ananas. Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa và quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được gọi là “enzyme dứa”. Tùy theo nguồn gốc, bromelain được phân làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân dứa) và bromelain quả (trích từ dịch quả dứa) Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất ra enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu hoạch trái. Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33) - Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2. Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5 - Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide. - Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như bromelain thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985). 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain i. Cấu tạo - Mã số enzyme  Bromelain thân: E.C.3.4.22.32  Bromelain quả : E.C.3.4.22.33 (Nguồn: truy cập ngày: 21/12/2006) - Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain - Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease - Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp) Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine. Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH (sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 6 đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine. Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys – Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Hoạt tính enzyme bromelain Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzoyl-L- Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-Arginine Methyl Esther…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme – cơ chất. Chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn bromelain trong quả xanh và quả chín. R R (- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )n + H - OH Enzyme bromelain n = k + i R ( - NH – CH – COOH )i + R ( H2N – CH – CO - )k Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 7 - Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 50C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)… Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCU hoặc GDU. 1 GDU tương đương với 1,5 MCU ( Nguồn: truy cập ngày: 12/12/2006) 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, hoạt tính của enzyme bromelain cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:  Nhân tố môi trường gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại..;  Nhân tố bên trong gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme. Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa.. Bromelain là một enzyme có nguồn gốc thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý là được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt là sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH của môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng. i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (Lê Ngọc Tú, 2004). Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 – 600C. Nhiệt độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 8 pH tối thích Độ hoạt động của enzyme pH pHtối thích Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy - Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính. - Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn  Ở 5oC, pH = 4 – 10, enzyme bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ;  Ở 55oC, pH = 6,1 ,enzyme bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. - Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. . Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH môi trường lên hoạt tính enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc thậm chí mất hẳn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 9 Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, chúng có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH = 5 – 8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc cysteine. Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm – SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004). Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt. 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy ra nhanh chóng. Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 10 enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ đó sinh ra các sản phẩm m._.