Ảnh hưởng của loại nguyên liệu và phụ gia bổ sung đến chất lượng rượu nếp than

ới tên đề tài “Ảnh hưởng của loại nguyên liệu và phụ gia bổ sung đến chất lượng rượu nếp than” do Trương Vĩnh Hùng thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện Cần Thơ, ngày tháng năm 2008 Chủ tịch hội đồng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Th.S Nhan Minh Trí là giảng viên của Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng – Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để giúp em có thể hoàn thành tốt luận văn tốt ngiệp này. Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng và Trường Đại Học Cần Thơ nói chung đã truyền đạt những kiến thức quý báu giúp cho em ra trường và bước vào đời một cách tự tin để có thể làm việc và phấn đấu đạt kết quả tốt sau này. Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm. Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Thực Phẩm K29 đã giúp đỡ và cùng trao đổi những kiến thức cũng như kinh nghiệm trong suốt thời gian qua. Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2008 Sinh viên thực hiện Trương Vĩnh Hùng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 4 TÓM LƯỢC Đề tài nghiên cứu với mục đích cải thiện chất lượng rượu nếp than so với những phương pháp lên men trước đây. Trên cơ sở tham khảo các tài liệu và các thí nghiệm thăm dò, đề tài đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn nếp thơm vào nếp than đến chất lượng rượu nếp than. Bột nếp thơm nguyên liệu được phối trộn với bột nếp than theo các tỉ lệ 20%, 25% và 30% rồi đem đi đường hóa, sau đó tiến hành lên men với nấm men bánh mì saccharomyces vàng. Trong quá trình lên men tiến hành theo dõi sự biến đổi về hàm lượng đường khử, độ Bx, pH, độ cồn sinh ra và mật số tế bào nấm men của từng mẫu. Rượu thành phẩm được phối trộn phụ gia (acid ascorbic, chất nhũ hóa) với các tỉ lệ 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% và 0,5% rồi đem bảo quản. Sau thời gian bảo quản tiến hành đo độ hấp thụ và đánh giá cảm quan về các chỉ tiêu màu, mùi, vị và trạng thái. Các số liệu được thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS Plus 4.0 để so sánh, đánh giá và chọn kết quả. Kết quả thống kê cho thấy: Giữa các mẫu phối trộn nếp thơm vào nếp than thì không có sự khác biệt về mùi vị và trạng thái do thành phần của nếp thơm cũng gần giống với nếp than, cho nên sau khi đường hóa xong thì hàm lượng đường khử và độ Bx gần giống nhau giữa các mẫu. Chính vì vậy mà kết quả lên men không có sự khác biệt về độ rượu, nhưng màu sắc giữa các mẫu thì có sự khác biệt. Tuy nhiên khi phối trộn nếp thơm vào nếp than thì có thể giảm được chi phí nguyên liệu do giá trị kinh tế của nếp thơm thấp hơn nếp than. Các giá trị cảm quan khác giữa các mẫu không có sự khác biệt nhiều khi bổ sung chất phụ gia (acid ascorbic và chất nhũ hóa). Điều này có thể do thời gian bảo quản không đủ dài để thấy được sự oxi hóa chất màu anthocyanin. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 5 MỤC LỤC Lời cảm tạ ....................................................................................................................... i Tóm lược ........................................................................................................................ ii Mục lục ......................................................................................................................... iii Danh sách bảng .............................................................................................................. v Danh sách hình .............................................................................................................. vi Chương I Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 1 Chương II Lược khảo tài liệu .................................................................................... 2 2.1 Gạo nếp than (Red Sticky Rice) .......................................................................... 2 2.2 Enzyme amylase ................................................................................................. 4 2.2.1 α-amylase (EC 3.2.1.1) ............................................................................. 4 2.2.2 γ-amylase (EC 3.2.1.3 ) ............................................................................ 6 2.3 Nấm men trong lên men rượu............................................................................. 7 2.3.1 Cấu tạo ...................................................................................................... 7 2.3.2 Sinh sản của nấm men .............................................................................. 7 2.3.3 Một số loại nấm men dùng trong sản xuất rượu ....................................... 8 2.3.4 Một số yêu cầu đối với nấm men rượu vang ............................................ 8 2.3.5 Ảnh hưởng của những yếu tố hóa lý lên hoạt động của nấm men vang ... 9 2.4 Cồn tinh khiết ..................................................................................................... 9 2.5 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than ......................................................... 10 2.6 Kỹ thuật lên men rượu nếp than ....................................................................... 10 2.6.1 Quá trình lên men rượu ............................................................................ 10 2.6.2 Quá trình sinh trưởng của nấm men ........................................................ 11 2.6.3 Cơ sở lý luận của quá trình lên men ........................................................ 12 2.6.4 Các quá trình chuyển hóa trong giai đoạn lên men ................................. 16 2.7 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than ............................................................ 17 2.7.1 Quy trình sản xuất .................................................................................... 17 2.7.2 Thuyết minh quy trình ............................................................................. 19 2.8 Chất lượng và các dạng hư hỏng của rượu nếp than ........................................ 20 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 6 2.8.1 Chất lượng rượu nếp than ........................................................................ 20 2.8.2 Các dạng hư hỏng của rượu nếp than khi lên men .................................. 21 Chương III Phương tiện nghiên cứu ........................................................................ 22 3.1 Phương tiện nghiên cứu .................................................................................... 22 3.1.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 22 3.1.2 Hóa chất ................................................................................................... 22 3.1.3 Trang thiết bị trong quá trình thí nghiệm ................................................. 22 3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22 3.2.1 Thí nghiệm 1 ............................................................................................ 22 a Mục đích thí nghiệm ..................................................................................... 22 b Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 23 c Tiến hành thí nghiệm ...................................................................................... 23 d Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................. 23 3.2.2 Thí nghiệm 2 ............................................................................................ 25 a Mục đích thí nghiệm ..................................................................................... 25 b Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 25 c Tiến hành thí nghiệm ..................................................................................... 25 d Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 25 Chương IV Kết quả và thảo luận ............................................................................. 27 4.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than đến % đường khử, pH, độ Bx, độ rượu và mật số tế bào nấm men .................................... 27 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phụ gia bổ sung đến chất lượng rượu vang nếp than ........................................................................................................................ 33 Chương V Kết luận và đề nghị ................................................................................. 35 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 35 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 35 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 36 Phụ lục .......................................................................................................................... 37 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 7 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học của nếp than .................................................................... 4 Bảng 2: Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................................... 5 Bảng 3: Nhiệt độ và pH tối thích của enzyme amylase ................................................. 6 Bảng 4: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia ......................... 10 Bảng 5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than đến % đường khử, pH, độ Bx, % cồn sinh ra và mật số tế bào nấm men .......................... 31 Bảng 6: Kết quả đo mật độ quang rượu thành phẩm ở bốn tỷ lệ phối trộn nếp thơm vào nếp than ........................................................................................................................ 32 Bảng 7: Kết quả cảm quan về 4 chỉ tiêu màu, mùi, vị và trạng thái của các mẫu có tỉ lệ phối trộn giữa nếp thơm và nếp than khác nhau ...................................................... 32 Bảng 8: Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ phụ gia bổ sung đến màu sắc của rượu thành phẩm ............................................................................................................................. 33 Bảng 9: Kết quả cảm quan về 4 chỉ tiêu màu, mùi, vị và trạng thái của các mẫu có tỉ lệ phối trộn phụ gia khác nhau ..................................................................................... 33 Bảng 10: Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm ........................................ 40 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 8 DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Nếp than ............................................................................................................ 2 Hình 2: Cấu tạo hạt nếp than .......................................................................................... 2 Hình 3: Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin .................................................. 3 Hình 4: Cơ chế tác dụng của α-amylase lên amylose .................................................... 5 Hình 5: Cơ chế tác dụng của amylase ............................................................................ 6 Hình 6: Nấm men Saccharomyces ................................................................................. 7 Hình 7: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than với độ Bx và % đường khử ..................................................................................................... 27 Hình 8: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than với pH ........................................................................................................................... 28 Hình 9: Đồ thị biểu diễn mối qua hệ giữa tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than với % cồn sinh ra trong quá trình lên men ......................................................................... 29 Hình 10: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ phối trộn nếp thơm và nếp than với mật số tế bào nấm men trong quá trình lên men .......................................................... 30 Hình 11: Nếp than ........................................................................................................ 41 Hình 12: Bột nếp than .................................................................................................. 41 Hình 13: Bột nếp thơm ................................................................................................. 42 Hình 14: Nấm men Saccharomyces ............................................................................. 42 Hình 15: Môi trường Sabouraud .................................................................................. 43 Hình 16: Máy nghiền búa............................................................................................. 43 Hình 17: Khuẩn lạc nấm men ...................................................................................... 44 Hình 18: Máy đo màu .................................................................................................. 45 Hình 19: Máy đo pH .................................................................................................... 45 Hình 20: Thanh trùng dịch nếp than ............................................................................ 46 Hình 21: Quá trình lọc rượu nếp than .......................................................................... 46 Hình 22: Thành phẩm rượu nếp than ........................................................................... 47 Hình 23: Rượu thành phẩm ở 4 tỷ lệ phối trộn ............................................................ 47 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 9 CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Rượu là một trong những sản phẩm lên men thực phẩm đã được biết đến từ rất sớm. Trong các dịp liên hoan, cưới hỏi, tết,…uống rượu cổ truyền là một phần không thể thiếu, đó là nét văn hóa mang đậm bản sắc riêng của dân tộc ta. Ở Việt Nam, thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng, từ rượu cần của các dân tộc miền núi Tây Nguyên, rượu làng Vân – Bắc Giang, rượu San Lùng – Lào Cai, rượu Xuân Thạnh – Trà Vinh, rượu Gò Đen – Tiền Giang, rượu nếp than của người Kinh,…Trong đó rượu nếp than là một loại rượu khá đặc biệt. Sản phẩm là kết quả của quá trình lên men không chưng cất nguyên liệu nếp than mà thành. Ngoài các rượu được sản xuất chuyên nghiệp với chất lượng cao thì đa số là rượu do dân làm ra, với trình độ công nghệ còn kém và thiết bị sản suất thô sơ nên sản phẩm có thể bị nhiễm vi sinh vật lạ và tạp chất nên rượu có chất lượng không cao về cảm quan và an toàn, có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì nhiễm tạp khuẩn nên hiệu suất thu hồi thấp, hao phí nguyên liệu lớn vì ủ mốc nên tổn hao chất khô, vì thế hiệu quả sản xuất chưa cao. Mặt khác rượu nếp than sau khi được bảo quản một thời gian thì mùi vị và màu sắc của sản phẩm thường bị giảm có thể do nguyên nhân là bị oxy hóa. Do nếp than có giá thành cao và với hy vọng bổ sung nếp thơm sẽ sản xuất được rượu vừa có chất lượng tốt vừa có giá thành hợp lý. Cho nên mục đích của đề tài “ Ảnh hưởng của loại nguyên liệu và phụ gia bổ sung đến chất lượng rượu nếp than” nhằm giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng giữ màu, mùi vị cho sản phẩm rượu nếp than. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này gồm hai mục tiêu: - Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn giữa nếp than và nếp thơm đến hương vị rượu nếp than. - Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phụ gia sử dụng đến khả năng giữ màu sắc và mùi vị rượu thành phẩm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 10 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Gạo nếp than (Red Sticky Rice) Hình 1: Nếp than Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ. Tên khoa học là Oryza Sativa Tamaka. Gạo nếp than gồm bốn loại: - Nếp cẩm Đức Hòa - Nếp đen Khánh Vinh - Nếp than Long Đất - Lúa lứt nếp cẩm Các loại lúa này có năng suất không cao, chỉ đạt khoảng 2,8 – 3,3 tấn/ha. Dân vùng Đồng bằng Nam Bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này, nếp than được chia thành hai loại: - Nếp than đen tuyền - Nếp than hồng đỏ Hình 2: Cấu tạo hạt nếp than www.ricebranoil.infoimage Vỏ trấu Cám Nội nhũ Phôi Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 11 Sắc tố anthocyanin của nếp than rất dễ tan trong nước vì thế sản phẩm cũng mang màu sắc đặc trưng của nguyên liệu. Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose... kết hợp với gốc aglucon có màu (Anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 3. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit. R1 OH OH O+ 3 R2 OH OH A 3 5 7 B Hình 3: Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3. Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường. Thông thường khi pH 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4 ÷ 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH = 7 ÷ 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh. Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ. Những đặc tính quí báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong đời sống hàng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biến thực phẩm. Điều đó hoàn toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác chất màu từ Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 12 thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn cao cho người sử dụng. Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ màu phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ... Tuy khác nhau về màu sắc nhưng các loại nếp than có thành phần hóa học không khác nhau nhiều: Bảng 1: Thành phần hóa học của nếp than Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 Nguồn: PGS.TS Nguyễn Thị Hiền - Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền 2.2 Enzyme amylase Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Enzyme amylase cũng như các enzyme khác đều có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh hóa. 2.2.1 α-amylase (EC 3.2.1.1) α-amylase là một metaloenzyme, là những protid đơn giản có chứa nhóm amin tự do. α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật. Nếu chúng có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị hai. α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. α-amylase chỉ có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside ở bất kì vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó được gọi là enzyme nội phân tử (endoenzyme). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 13 Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide, sau này các mạch này bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến maltose tetrose, maltose triose, maltose. Sau thời gian thủy phân amylase, sản phẩm bao gồm: 87% maltose và 13% glucose. Hình 4: Cơ chế tác dụng của α-amylase lên amylose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glycoside ở chỗ mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có tác động lâu thì sản phẩm cuối cùng cũng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin phân tử thấp và các izomaltose 8%. Bảng 2: Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau Nhiệt độ (0C ) Hoạt tính của α-amylase, % so với hoạt tính ban đầu Nấm sợi Malt Vi khuẩn 65 100 100 100 70 52 100 100 75 3 58 100 80 - 25 92 85 - 1 58 90 - - 52 95 - - 8 Nguồn: Nguyễn Đức Lượng. Công nghệ enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 14 2.2.2 γ-amylase (EC 3.2.1.3 ) γ-amylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme), nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 glucoside lẫn α-1,6 glucoside. Khi thủy phân, γ-amylase thủy phân liên kết α-1,4 glucoside trong polysaccharide, tách lần lượt từng gốc glucose từ đầu không khử. Ngoài thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside và α-1,6 glucoside, γ-amylase còn có khả năng thủy phân liên kết α- 1,2 và α-1,3 glucoside. γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, amylopectin, dextrin, maltose,… đến glucose. Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh bị γ-amylase tấn công với vận tốc khá lớn. Đa số γ-amylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5 - 5,5 và nhiệt độ 500C. Nó bền với tác dụng của acid hữu cơ hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton và không được bảo vệ bởi ion Ca2+. Cơ chế tác dụng của enzyme amylase được minh họa như sau: Hình 5: Cơ chế tác dụng của amylase Trong thực tế có nhiều nguồn để sản xuất amylase, nhưng tùy thuộc vào từng nguồn mà amylase có điều kiện nhiệt độ và pH tối thích khác nhau: Bảng 3: Nhiệt độ và pH tối thích của enzyme amylase Nguồn gốc Nhiệt độ tối thích (0C ) pH tối thích Malt 72 – 75 5,5 – 5,7 Nấm mốc 50 – 60 5,5 – 6,0 Vi khuẩn 60 – 70 6,0 – 7,0 Nguồn: Nguyễn Đức Lượng. Công nghệ enzyme Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 15 2.3 Nấm men trong lên men rượu Quá trình lên men được thực hiện nhờ loài Saccharomyces, loài này có tính kỵ khí không bắt buộc, chúng có khả năng hô hấp và lên men, khả năng lên men của các chủng là rất khác nhau. Hình 6: Nấm men Saccharomyces 2.3.1 Cấu tạo Nấm men có thể ở dạng hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh,….Kích thước của tế bào nấm men có thể thay đổi trong khoảng 1,2 – 5,3µm hay có khi dài hơn nữa. Tế bào nấm men gồm có vỏ, màng, tế bào chất, nhân, một hoặc hai không bào và những giọt mỡ, hạt glycogen và votulin. Trong tế bào chất chứa riboxom. Ở một số nấm men, vỏ tế bào có khả năng kết dính, vì vậy chúng có thể liên kết với nhau. Quá trình này gọi là sự kết lắng và có một ý nghĩa lớn trong nghề nấu bia và làm rượu vang, vì các tế bào kết dính lại với nhau, lắng xuống dưới làm cho dịch lên men trong, loại nấm men này gọi là nấm men chìm. Những nấm men không có khả năng kết lắng được gọi là nấm men nổi. 2.3.2 Sinh sản của nấm men Nấm men có thể sinh sản bằng bào tử. Bào tử khi ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới. Nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Tế bào nấm men mẹ nảy sinh ra thành một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và tách ra. Ở một số nấm men, tế bào con không tách ra mà kết thành một chuỗi, đặc tính này có ở các nấm men tạo màng. Đối với giống Saccharomyces thì giống này sinh sản bằng hình thức nảy chồi, khi gặp điều kiện không thuận lợi thì sinh bào tử. Những loài quan trọng như: - Saccharomyces cerevisiae: dùng trong sản xuất rượu, men bánh mì,.. - Saccharomyces vini: dùng trong sản xuất rượu vang. - Saccharomyces carbergensis: trong sản xuất bia. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 16 Mỗi loài có khả năng lên men các loại đường khác nhau, tạo thành một số lượng lớn rượu khác nhau, điều kiện nảy chồi và sinh bào tử cũng khác nhau. Mỗi loài gồm nhiều chủng. 2.3.3 Một số loại nấm men dùng trong sản xuất rượu * Nấm men dùng trong sản xuất rượu từ tinh bột: - Saccharomyces cerevisiae Rasse II: sinh sản trong môi trường nước đường, loài này có nhiều hạt glycogen, không bào lớn, hình thành bào tử nội sinh ít và chậm, sinh bọt nhiều thích nghi ở nhiệt độ và acid thấp, có sức kháng cồn cao, không lên men được đường lactose, kích thước tế bào khoảng 5 - 7µm. - Saccharomyces cerevisiae Rase XII: có tốc độ phát triển nhanh, không bào nhỏ, ít sinh bọt, tế bào hình trứng hoặc hình tròn, kích thước khoảng 5 - 8µm, lên men được các đường glucose, fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 đường raffinose, không lên men đường lactose, có thể lên men đến 13% rượu. Loại này thuộc nấm men nổi, phân bố đều trong dịch lên men, không tạo thành đám trắng. * Nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang: - Saccharomyces vini: có dạng hình oval, kích thước (3 – 8)x(5 – 12)µm. Sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử, sinh ra enzyme invertase có khả năng khử đường saccharose thành glucose và fructose. Chủng này lên men chỉ đạt được 8 – 10% rượu, Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Tuy nhiên, ở giai đoạn cuối của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces vini thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành rượu và chết rất nhanh. - Saccharomyces uvarum: loại này được tách từ nước nho, về hình thái nó cũng giống như những loài khác, loài này có thể lên men 12 – 130 rượu trong dịch nước nho. - Saccharomyces chevalieri: men này cũng được trích từ nước nho lên men tự nhiên, Saccharomyces chevalieri có thể lên men được 160 rượu. - Saccharomyces oviformis: được tách từ nước nho lên men tự nhiên, có khả năng chịu được đường, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo được 180 rượu, về hình thái thì loài này giống như Saccharomyces vini. Điều khác nhau cơ bản của Saccharomyces oviformis và Saccharomyces vini là không lên men được đường galactose và men nổi trên bề mặt dịch lên men tạo thành màng. 2.3.4 Một số yêu cầu đối với nấm men rượu vang - Khả năng lên men cao. Những chủng này khi ở điều kiện tối ưu cần đạt được 18 – 20% ethanol. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 17 - Chịu được nhiệt độ thấp. Những nấm men của nhóm này cần có khả năng lên men ở nhiệt độ 4 – 100C và tích lũy trong môi trường trong thời gian ngắn, thực tế phải đạt được 8 – 12% ethanol. - Những nấm men đã được sulphit hóa: gồm những chủng có thể bắt đầu và hoàn thành quá trình lên men ở pH rất thấp. - Bền vững với ethanol. - Không được tạo lớp màng chung quanh thành thùng. - Các nấm men heres sau khi lên men, nếu được tiếp xúc với không khí sẽ tạo được váng trên bề mặt của rượu. Khi phát triển trên bề mặt của rượu trong thời gian ngắn sẽ tạo được hương vị đặc trưng của rượu. - Bền vững với nồng độ đường cao. 2.3.5 Ảnh hưởng của những yếu tố hóa lý lên hoạt động của nấm men vang - Ảnh hưởng của oxy: trong điều kiện có nhiều O2 thì hoạt động sinh sản của nấm men mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men. Ngược lại, trong điều kiện thiếu hoặc không có O2, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí, khi đó sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men là ethanol. Tuy nhiên, hai kiểu hô hấp trên đều có mối quan hệ chung với nguồn đường có trong môi trường. - Ảnh hưởng c._.ủa nhiệt độ: Nấm men sẽ chết ở nhiệt độ 60 – 650C sau 5 phút. Nhiệt độ tối ưu cho nấm men vang là 25 – 280C. - Ảnh hưởng của ánh sáng: ánh sáng là yếu tố kìm hãm hoạt động của nấm men vang. Đặc biệt là tia cực tím trong ánh sáng sẽ giết chết tế bào nấm men. Vì vậy, quá trình lên men phụ thuộc thời tiết của từng mùa. - Ảnh hưởng của các acid hữu cơ: nấm men vang có thể bảo vệ được hoạt tính ở 10 – 20g/l acid tự do. Ngoài ra nấm men còn bị ảnh hưởng bởi nồng độ rượu và khí CO2. 2.4 Cồn tinh khiết Trong quá trình lên men gạo nếp than, lượng rượu tạo thành chỉ khoảng 7 - 10%. Nồng độ rượu này thấp, rất dễ bị oxy hóa để tạo ra CO2 và nước. Do đó, sau khi lên men xong phải cho thêm một lượng cồn nhất định vừa để nâng cao hàm lượng cồn trong rượu vừa tránh bị oxy hóa rượu bởi vi khuẩn acetic. Cồn được dùng để làm rượu là loại cồn thực phẩm có độ tinh khiết cao với các chỉ tiêu sau: - Trong suốt, không màu, không mùi lạ. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 18 - pH = 6,5 – 7,0 - Hàm lượng cồn 96,5%V - Không có furfurol - Hàm lượng aldehyde 6 – 10mg/l - Hàm lượng este 30 – 35mg/l - Dầu fusel 30 – 60mg/l Nước: thường sử dụng nước sạch, đun sôi để nguội, trong suốt, không mùi vị lạ, có pH = 6,5 – 7,5. 2.5 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than Tiêu chuẩn của nước trong công nghệ sản suất rượu có yêu cầu chất lượng giống như nước dùng trong sinh hoạt, nghĩa là có độ cứng không quá 7 mg đương lượng/l, trong suốt, không màu, không mùi. Bảng 4: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia Ion Hàm lượng (mg/l ) Ion Hàm lượng (mg/l ) Cl- 0,5 F 3 SO42- 80 Zn 3 As 0,05 Cu 5 Pb 0,1 Fe 0,3 NO3 40 Nguồn: Hoa (2004 ) 2.6 Kỹ thuật lên men rượu nếp than 2.6.1 Quá trình lên men rượu Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, tác nhân của quá trình lên men rượu trong sản xuất là các loại nấm men Saccharomyces. Thực chất của quá trình lên men rượu chính là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Trong quá trình lên men rượu, nguyên liệu là tinh bột cần phải qua quá trình đường hóa bằng hệ enzyme amylase để chuyển tinh bột thành đường glucose, sau đó glucose tiếp tục lên men yếm khí để chuyển hóa thành rượu ethylic C2H5OH, khí CO2 đồng thời giải phóng năng lượng. Phương trình tổng quát về quá trình lên men rượu như sau: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 19 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 674Kcal Ngoài sản phẩm chính là rượu ethylic, trong quá trình lên men còn tạo thành khí CO2, glycerin và một vài loại rượu bậc cao, các acid hữu cơ như: acid succinic,… và sinh khối nấm men tích tụ đồng thời với sự hình thành các sản phẩm. Do đó làm giảm chất lượng tinh khiết của rượu ethylic. Sản phẩm thu được sau quá trình lên men có tỷ lệ như sau: 44,4% rượu ethylic; 46,6% CO2; 3,3% glycerin; khoảng 0,6% acid succinic và 5,1% các sản phẩm khác. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men, người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. • Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường có mặt O2 như quá trình lên men acid acetic, citric,… • Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic,… Trong quá trình lên men người ta chia làm hai thời kỳ chính: • Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2, tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng). • Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thu các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme có sẵn của mình để xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2. 2.6.2 Quá trình sinh trưởng của nấm men Trong dịch lên men tĩnh có thể chia ra làm 5 giai đoạn như sau:  Giai đoạn tiềm phát (1): giai đoạn này tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều.  Giai đoạn logarit (2): đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men. 1 2 3 4 5 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 20  Giai đoạn chậm dần (3): tốc độ sinh trưởng của nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.  Giai đoạn ổn định (4): số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết.  Giai đoạn chết (5): tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng tế bào nấm men giảm dần. 2.6.3 Cơ sở lý luận của quá trình lên men a. Cơ chế của quá trình lên men Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1ml dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men, trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được hình thành. Rượu ethylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào môi trường, CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C, là 0,865 – 0,837 lít CO2/lít nước. Vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường, điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men, khi lên men đều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 21 b. Động học của quá trình lên men Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men, hoặc gián tiếp xác định lượng rượu tạo thành và lượng CO2 thoát ra trong một đơn vị thời gian. Cũng có thể xác định nhanh tốc độ lên men bằng cách đo nồng độ biểu kiến của nồng độ dịch lên men. Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính: ● Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men. Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể. ● Thời kỳ hai: đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 – 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. ● Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm, đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được. Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Trong giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi khoảng 1 độ (Brix,%) tùy loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất. Sự tồn tại của thời kỳ lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch đường hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột. Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường trong dịch lên men là 100% thì 4 - 6% là dạng chất không tan, 75 - 77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin. Trong giai đoạn lên men, sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy vậy, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kỳ lên men dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men. Tuy vậy, tùy theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ glucid của sự đường hóa, phương pháp lên men, nhà sản xuất cũng sẽ tạo ra một quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ. c. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 22 * Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men: Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men. Nếu nồng độ dung dịch đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rượu hình thành nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả quá trình lên men, cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn lên men phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men. Bình thường trong dịch lên men thường có nồng độ chất khô từ 16 – 18%, tương đương với 13 – 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường đối với lên men lactic. * Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và lượng tế bào nấm men: Trong trường hợp có đầy đủ hoặc thừa cơ chất, tốc độ phản ứng enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme. Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Tuy nhiên cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme tăng quá cao, tốc độ phản ứng bị chậm lại. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme theo phương trình tổng quát sau: [ ]EkV *= Trong đó: V: vận tốc phản ứng k: hằng số tốc độ phản ứng [E]: nồng độ enzyme Ngoài ra số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt, hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tăng lên. Nếu lượng men cho vào ít quá thì quá trình lên men diễn ra chậm, sinh khối tế bào nấm men thấp là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. Ngược lại, nếu số lượng tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ chất dinh dưỡng cho tế bào nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết, làm cho sản phẩm có mùi vị lạ, lãng phí đi một lượng men không có ích. * Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố rất lớn ảnh hưởng đến quá trình lên men. Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mình. Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác nếu có điều kiện làm lạnh Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 23 dịch đường tới 20 – 220C sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều este, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 – 450C. Nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết. Tuy nhiên nhiệt độ ngoài ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và phát triển của nấm men, còn gây nên một số phản ứng phụ như: gây nên sự bay hơi làm tổn thất rượu, mất hợp chất gây mùi thơm, hình thành nên các sản phẩm phụ khác khi lên men ở nhiệt độ quá cao. Do đó thường tiến hành lên men ở nhiệt độ thích hợp để tránh hiện tượng tổn thất rượu do bay hơi, giữ được mùi thơm đặc trưng của rượu và tránh được sự phát triển của vi sinh vật ưa nhiệt. * Ảnh hưởng của pH: Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là trong khoảng pH = 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn. Khi pH< 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 – 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn không phát triển. Để hạ pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid này không gây ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của nấm men. * Ảnh hưởng của nồng độ rượu Nồng độ của rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ của rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng phát triển riêng của tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% thì có ảnh hưởng xấu. * Ảnh hưởng của oxy Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu, CO2 và tăng sinh khối. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 24 của O2 nấm men lên men không hoàn toàn vì chúng phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic,..) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia chứa nhiều chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển). Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây truyền sản xuất. Tuy nhiên có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy. * Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng Trong điều kiện sản xuất dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng không thể vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Có thể dùng nhiều hóa chất khác nhau như: formol, Na2SiF6, NaF, CaCl2,.. Các muối kim loại nặng, tia cực tím đều ảnh hưởng đến quá trình hoạt dộng của nấm men. Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, sao cho hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men. Khi sử dụng formol, Na2SiF6 nồng độ không được vượt quá 0,02% so với dịch lên men. Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác dụng của chúng lên nấm men sẽ không giống nhau. Ngoài các chất kể trên, trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furfurol, melanoidin đều ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. 2.6.4 Các quá trình chuyển hóa trong giai đoạn lên men a Biến đổi vi sinh vật Thực chất của quá trình này là quá trình sinh sản và sinh trưởng của vi sinh vật. Quá trình này xảy ra rất nhanh ở giai đoạn đầu lên men, khi cho nấm men vào nguyên liệu. Sự phát triển mạnh của các vi khuẩn giai đoạn này kéo theo sự tạo thành một số acid hữu cơ. Kết quả là pH môi trường giảm xuống tạo điều kiện thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển tuy tốc độ hơi yếu. Việc phân chia các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm mốc, nấm men một cách rõ ràng là điều rất khó khăn. Vì thực chất, sự phát triển của các loài vi sinh vật trong dịch lên men diễn ra đồng thời. Chỉ có điều là sự phát triển đó thường không cùng mức độ. Sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc thì đòi hỏi trong môi trường phải có một lượng oxy nhất định. Chính vì vậy, các loài vi sinh vật này phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Nấm men cũng cần oxy để tăng sinh khối. Tuy nhiên, mức độ đó không cao như nấm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 25 mốc. Mặt khác, nấm men cần đường nên phải có thời gian để nấm mốc tạo ra đường. Do đó, ở các giai đoạn sau nấm men phát triển mạnh hơn nấm mốc và vi khuẩn. b Các quá trình sinh hóa * Quá trình chuyển hóa đường và các thành phần khác thành các acid hữu cơ cơ bản: + Quá trình tạo acid acetic + Quá trình tạo acid lactic Quá trình tạo acid lactic mạnh hơn, cả hai quá trình này xảy ra với cường độ không mạnh vì giai đoạn đầu lượng đường tạo thành trong khối lên men chưa cao. * Quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường: Do sự phát triển của nấm men Endomycopsis, tinh bột được chuyển thành đường. Các loại nấm mốc và nấm men này trong quá trình phát triển tạo ra rất nhiều enzyme amylase, glucoamylase. Các enzyme này hoạt động rất thuận lợi trong giai đoạn đầu được kéo dài trong các giai đoạn sau. Điểm quan trọng cần đề cập đến là các enzyme này chịu sự điều khiển bởi sản phẩm cuối cùng là glucose. Bình thường thì glucose sẽ ức chế phản ứng thủy phân tinh bột, nhưng các loài nấm mốc Mucor rouxi, Rhizopus delmar, các loài nấm men Endomycosis vừa có khả năng tổng hợp amylase, glucoamylase, vừa có khả năng chuyển đường thành rượu, mặt khác các loài nấm men Saccharomyces cùng rất tích cực chuyển hóa, glucose tạo thành bao nhiêu ngay lập tức sẽ chuyển hóa thành rượu, một phần phục vụ cho sinh trưởng của chính các loài vi sinh vật đó. Do đó, trong khối lên men này thường không xảy ra cơ chế kìm hãm ngược lại bởi glucose. c Quá trình chuyển hóa đường thành rượu Quá trình này được thực hiện bởi Saccharomyces. Song song với quá trình này là các quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác. Điều đặc biệt lưu ý là tất cả các quá trình chuyển hóa được xảy ra xen kẽ nhau, hỗ trợ nhau và tạo nên một quá trình chung hài hòa, để cuối cùng tạo ra sản phẩm không chỉ có nước, rượu mà còn là một hỗn hợp sản phẩm bao gồm nhiều thành phần khác nhau chính vì thế rượu nếp than có được hương vị đặc trưng và có giá trị cảm quan rất riêng. 2.7 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than 2.7.1 Quy trình sản xuất Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 26 Amylase Gạo nếp than Nghiền Nấu và thủy phân Lọc Thanh trùng (870C, 3 phút) Làm nguội (330C) Lên men Hãm cồn (18%V) Lên men phụ Chiết Sản phẩm Men giống (0,1%) Lắng trong Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 27 2.7.2 Thuyết minh quy trình a. Nghiền Gạo nếp than sau khi được làm sạch sẽ đem nghiền mịn nhằm giúp cho tinh bột và một số chất khô khác dễ hòa tan trong quá trình nấu. Giúp rút ngắn thời gian hồ hóa. Trong quá trình nghiền, nguyên liệu nếp than chịu tác động của ba lực cơ hoc đó là: lực nén ép, lực va đập và lực cắt xé. Trong đó lực va đập là lực tác động chủ yếu trong quá trình nghiền. b. Nấu và thủy phân Mục đích của quá trình nấu là làm hạt tinh bột trương nở và giải phóng amylose và amylopectin, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hòa tan trong nước nhằm tạo điều kiện cho enzyme amylase dễ dàng tấn công amylose và amylosepectin. Bản chất quá trình nấu là quá trình hồ hóa. Sau quá trình hồ hóa là quá trình đường hóa. Trong cả hai giai đoạn có bổ sung enzyme amylase. Bột nếp than được phối trộn với nước theo tỉ lệ 1 : 4. Sau đó được đun đến 800C, bổ sung enzyme α-amylase với tỉ lệ 0,08% theo thể tích và giữ 15 phút để cho enzyme dịch hóa. Tiếp tục đun cho dịch cháo đến sôi và giữ ở nhiệt độ sôi 10 phút cho tinh bột hồ hóa hoàn toàn. Làm nguội dịch cháo đến khoảng 650C, rồi cho 0,08% enzyme γ-amylase vào. Giữ ở nhiệt độ này khoảng 40 phút cho đến khi quá trình đường hóa kết thúc rồi đem lọc. c. Lọc Mục đích của quá trình lọc là làm sạch và nâng cao chất lượng của sản phẩm. Là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp vải lọc, bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch đi xuyên qua màng lọc dưới áp suất dư so với áp suất phía bên dưới vật ngăn. Sau khi lọc dung dịch trong suốt hầu như không thay đổi thành phần hóa học tuy nhiên có một số thay đổi: + Chất lượng sản phẩm tăng do ít tạp chất. + Thay đổi trạng thái và màu sắc. + Hao hụt vật chất. + Loại được một số vi sinh vật. d. Thanh trùng Mục đích của quá trình thanh trùng là diệt vi sinh vật nhiễm (nấm men dại, vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh, các chủng Lactobacillus ), và tăng khả năng bảo quản. Quá trình này gây ra những thay đổi nhỏ về tính chất cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 28 Quá trình thanh trùng được thực hiện ở 870C trong khoảng thời gian 3 phút. e. Làm nguội Hỗn hợp sau khi thủy phân tinh bột có nhiệt độ khá cao. Trong khi đó nấm men phát triển tốt ở nhiệt độ 30 – 330C. Vì vậy ta phải làm nguội hỗn hợp xuống để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men phát triển. f. Lên men Tiến hành lên men ở nhiệt độ thường, thời gian này có hai quá trình xảy ra song song với các mức độ khác nhau, đó là quá trình tăng sinh khối của nấm men và quá trình rượu hóa. Cho nấm men vào dịch sau khi lọc với tỉ lệ 0,1% theo thể tích để cho nấm men phát triển sinh khối trong khoảng thời gian 4 giờ. Sau đó trích dịch nấm men phát triển cho vào các hủ chứa dịch nếp than để tiến hành lên men. Thời gian lên men khoảng 4 ngày. g. Hãm cồn Sau khi lên men, hàm lượng cồn đạt 6 - 10%. Với hàm lượng cồn này rất khó bảo quản và chất lượng rượu không cao. Do đó, ta phải bổ sung thêm cồn để tăng hàm lượng cồn trong sản phẩm. Lượng cồn thêm vào tùy theo yêu cầu của người tiêu dùng, ở quy trình này đề nghị là 18% thể tích. h. Lên men phụ Rượu vang nếp than được lên men ở nhiệt độ cao lại không qua chưng cất, nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều rượu bậc cao và các andehyde gây độc cho cơ thể người. Vì vậy, cần phải có thời gian dài để cho các sản phẩm phụ này chuyển hóa và ổn định rượu, làm cho chất lượng rượu được tốt hơn. Thời gian lên men phụ là 6 tháng. i. Chiết Do thị hiếu của người tiêu dùng mà người ta tiến hành lọc để lấy phần dịch, bỏ phần xác nguyên liệu rồi đem đi tồn trữ, sản phẩm có màu sắc giống với màu nguyên liệu sản xuất. 2.8 Chất lượng và các dạng hư hỏng của rượu nếp than 2.8.1 Chất lượng rượu nếp than Rượu nếp than hiện có 2 loại: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 29 - Rượu nếp than dạng đục: sau khi lên men, đem cả phần xác của dịch lên men xay nhuyễn, hãm cồn và tồn trữ tạo hương. Có màu tương ứng với màu của nguyên liệu đưa vào sản xuất. - Rượu nếp than dạng trong: sau khi lên men, đem xay và hãm cồn, sau đó lọc lấy phần dịch, rồi đưa đi tồn trữ, tạo hương, có màu tương ứng với màu của nguyên liệu sản xuất. Cả 2 loại rượu nếp than trên đều có màu và mùi vị đặc trưng, còn hàm lượng cồn thấp hay cao tùy theo đối tượng phục vụ mà lượng cồn hãm vào sau khi lên men nhiều hay ít. 2.8.2 Các dạng hư hỏng của rượu nếp than khi lên men a. Lên men lactic Sự lên men lactic cũng gây nhiều tác hại như làm chua và vẫn đục rượu, nước ngọt, nước giải khát,… Vi khuẩn lactic thường dễ xâm nhập vào các thiết bị lên men rượu, từ đó nó lên men lactic làm hư hại cả một giai đoạn của sự lên men rượu, làm rượu bị giảm chất lượng do nó tạo ra acid lactic, acetic, manic. Lên men này còn gây hư hỏng, làm chua một số thực phẩm có đường khi bảo quản. Thủ phạm gây ra hiện tượng này là do vi khuẩn lactic, đặc biệt là chủng lactobacterium manitopocrum CHOHCOOHCHOHC 36126 2→ b. Lên men butyric Vi khuẩn butyric khi nhiễm vào thùng ủ sẽ lên men butyric tạo ra nhiều khí hydro, tuy nhiên độ acid không tăng cao. 222236126 22 HCOCOOHCHCHCHOHC ++→ c. Lên men dại Thường gặp là lọai nấm men hình oval lớn, lên men rất nhanh, tạo độ acid cao và độ rượu sớm làm ức chế hoạt động nấm men cần thiết để thực hiện quá trình lên men. d. Sự tạo thành ester Song song với việc tạo ra acid và alcohol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcohol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng. Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 30 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp & SHƯD – Trường Đại Học Cần Thơ 3.1.1 Nguyên liệu - Nếp thơm và nếp than được mua tại chợ Cần Thơ. - Men được mua tại lò men Cần Thơ. - Enzyme α – amylase, γ – amylase được mua tại Cần Thơ. 3.1.2 Hóa chất Acid citric và Natribicacbonat dược dùng để điều chỉnh pH của dịch lên men và sản phẩm. Pb(CH3COO)2 , Na2SO4 bão hòa, dung dịch Felling A và Felling B dùng để chuẩn đường khử. Methyl xanh dùng làm thuốc thử trong quá trình chuẩn đường. 3.1.3 Trang thiết bị trong quá trình thí nghiệm - Chiết quang kế. - Cồn kế. - Tủ lạnh. - Máy đo màu. - Nhiệt kế. - Tủ thanh trùng. - Tủ cấy vi sinh. - Máy đo pH. - Cân điện tử và một số dụng cụ thông thường: bếp gas, nồi nấu, muỗng, đũa thủy tinh,… 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ phối trộn nguyên liệu ảnh hưởng đến chất lượng rượu nếp than. a Mục đích thí nghiệm: chọn được tỷ lệ phối trộn nguyên liệu thích hợp cho rượu nếp than có được chất lượng cao. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 31 b Bố trí thí nghiệm: Nguyên liệu nếp thơm và nếp than sau khi nghiền được phối trộn với các tỷ lệ như sau: A0: nếp thơm : nếp than = 0 : 100 A1: nếp thơm : nếp than = 20 : 80 A2: nếp thơm : nếp than = 25 : 75 A3: nếp thơm : nếp than = 30 : 70 c Tiến hành thí nghiệm Nguyên liệu nếp thơm và nếp than sau khi nghiền, chia làm bốn mẫu được phối trộn theo tỷ lệ đã bố trí. Tiếp theo sau đó là quá trình thủy phân với enzyme α–amylase và γ-amylase. Sau khi thanh trùng dịch thủy phân xong thì tiến hành bổ sung nấm men với tỷ lệ 0,1% theo thể tích. Các mẫu được lấy và phân tích theo thời gian để đánh giá và so sánh. d Chỉ tiêu theo dõi - Hàm lượng đường khử - pH - Độ Bx - Mật số tế bào nấm men - Độ rượu tạo thành - Cảm quan về màu sắc, mùi vị và trạng thái của sản phẩm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 32 Nghiền Nấu và thủy phân Lọc Thanh trùng Làm nguội (330C) Lên men Hãm cồn (18%V) Lên men phụ Chiết Sản phẩm α và γ - amylase Đánh giá cảm quan Nguyên liệu A0= 0% nếp thơm : 100% nếp than A1= 20% nếp thơm : 80% nếp than A2= 25% nếp thơm : 75% nếp than A3= 30% nếp thơm : 70% nếp than Lắng trong Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 33 3.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát tỷ lệ phụ gia (acid ascorbic và chất nhũ hóa) bổ sung đến khả năng giữ màu và mùi vị sản phẩm rượu nếp than. a Mục đích thí nghiệm: chọn được tỷ lệ phụ gia bổ sung thích hợp nhằm tăng khả năng giữ màu sắc và mùi vị cho sản phẩm rượu nếp than. b Bố trí thí nghiệm: Rượu thành phẩm được phối trộn với phụ gia theo các tỷ lệ như sau: B0: không bổ sung phụ gia B1: bổ sung 0,1% phụ gia B2: bổ sung 0,2% phụ gia B3: bổ sung 0,3% phụ gia B4: bổ sung 0,4% phụ gia B5: bổ sung 0,5% phụ gia c Tiến hành thí nghiệm Rượu thành phẩm được phối trộn với phụ gia (acid ascorbic và chất nhũ hóa) theo các tỷ lệ đã bố trí. Sau thời gian bảo quản, ta tiến hành đem đi lọc rồi sau đó đo độ hấp thụ của sản phẩm và tiến hành đánh giá cảm quan về các chỉ tiêu màu, mùi, vị và trạng thái. Độ hấp thụ của các mẫu được đo ở bước sóng 523nm. d C._.