Ảnh hưởng của loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH đến quá trình thủy phân nếp than ứng dụng cho quá trình lên men

HỦY PHÂN NẾP THAN ỨNG DỤNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN” do Nguyễn Thanh Vũ thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện Nhan Minh Trí Nguyễn Công Hà Lý Nguyễn Bình Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007 Chủ tịch hội đồng Lý Nguyễn Bình Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM TẠ Chân thành cám ơn Thầy Nhan Minh Trí và Nguyễn Công Hà đã hướng dẫn và giúp đỡ tận t ình tôi trong suố t quá tr ình thực hiện luận văn tố t nghiệp Xin cảm ơn tấ t cả Thầy cô và Cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã truyền đạ t k iến thức cho tôi trong suố t thờ i g ian khóa học và tạo đ iều k iện thuận lợ i giúp tôi hoàn thành tố t luận văn này Xin cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm Khoá 28 đã ủng hộ và giúp đỡ tô i trong suố t quá tr ình thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn. Nguyễn Thanh Vũ Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ii TÓM TẮT Với mong muốn sử dụng nguồn enzyme amylase để thay thế nấm mốc ở giai đoạn đường hóa trong quá trình sản xuất rượu nếp than nhằm nhằm nâng cao hiệu suất và đảm bảo chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu khảo sát đồng thời 3 nguồn enzyme amylase thương mại trích ly từ vi khuẩn Bacillus, hỗn hợp vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus, nấm mốc Aspergillus niger. Qua đó tìm ra loại enzyme và điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ thích hợp nhất cho quá trình thủy phân nếp than đạt hiệu quả. Kết quả thí nghiệm thu được như sau : - Nồng độ tối ưu đối với enzyme amylase từ Bacillus, từ Aspergillus niger là 2,5ml/50g còn đối với nguồn từ hỗn hợp vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus là 1,5ml/50g - Nhiệt độ thủy phân tối ưu đối với enzyme từ Aspergillus niger, từ Bacillus và Aspergillus là 700C còn đối với enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thì nhiệt độ tối ưu là 700C và 750C. - pH thích hợp cho phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme từ Bacillus pH 5,5; từ Bacillus và Aspergillus là pH 3,5 còn đối với enzyme có nguồn gốc từ Aspergillus niger là pH 5,5. - Từ các thông số tối ưu đã khảo sát trên enzyme từ 3 nguồn khác nhau, tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện tối thích của enzyme, nhận thấy khả năng thủy phân nếp than của enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus đạt được hiệu suất cao hơn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iii MỤC LỤC Lời cảm tạ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Mục lục................................................................................................................... iii Danh sách hình ....................................................................................................... vi Danh sách bảng..................................................................................................... viii CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .............................................................. 2 2.1 Giới thiệu chung về nếp than.......................................................................... 2 2.2 Giới thiệu chung về enzyme amylase............................................................. 3 2.3 Cấu trúc phân tử amylase............................................................................... 3 2.3.1 Thành phần cấu tạo........................................................................................ 3 2.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme ................................................................... 4 2.3.3 Tính đặc hiệu của enzyme............................................................................... 4 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của amylase ........................................ 5 2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme ........................................ 5 2.4.2 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng của enzyme ................................................ 5 2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng của enzyme............................ 5 2.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng enzyme.................................. 7 2.4.5 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt động của amylase ...................... 8 2.4.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm ........................................................................ 8 2.4.7 Cơ chất tác dụng ........................................................................................... 9 2.5 Đặc tính và cơ chế tác dụng ............................................................................ 10 2.5.1 α-amylase (EC.3.2.1.1)................................................................................... 10 2.5.2 β-amylase (EC.3.2.1.2).................................................................................. 13 2.5.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4- glucan-glucohydrolase) (EC.3.2.1.3).... 14 2.5.4 Oligo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10) ................ 15 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iv 2.5.5 Pullulanase (EC3.2.1.41) ............................................................................... 16 2.5.6 Transglucosidase ........................................................................................... 16 2.7 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm ....................... 16 2.7.1 Trong sản xuất rượu....................................................................................... 16 2.7.2 Trong sản xuất bia ......................................................................................... 16 2.7.1 Trong công nghệ sản xuất bánh mì................................................................. 17 2.7.1 Trong sản xuất bánh kẹo ................................................................................ 17 2.7.1 Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường.......................................... 17 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ............... 18 3.1 Phương tiện thí nghiệm................................................................................... 18 3.1.1 Địa điểm ....................................................................................................... 18 3.1.2 Thời gian....................................................................................................... 18 3.1.3 Nguyên liệu ................................................................................................... 18 3.1.4 Hoá chất ...................................................................................................... 18 3.1.5 Trang thiết bị ................................................................................................ 18 2.1 Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 19 2.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase thương mại đến quá trình thủy phân tinh bột .................................................................................... 19 2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme amylase, nồng độ enzyme, pH và nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân nếp than.......................................................... 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 23 4.1 Xác định hoạt tính của enzyme thương mại .................................................. 23 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme .......................................................................................... 24 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus ............................................. 24 4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn Bacillus.. 29 4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus niger ......................... 35 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng v 4.3 So sánh khả năng thủy phân của loại enzyme để ứng dụng cho quá trình lên men ............................................................................................................................... 40 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 41 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 41 5.2 Đề nghị............................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 42 PHỤ LỤC .............................................................................................................. ix Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vi DANH SÁCH HÌNH Hình1 : Nguyên liệu nếp than.................................................................................. 2 Hình 2: Cấu trúc của anthocyanin ........................................................................... 2 Hình 3: Các loại enzyme endoamylase và exoamylase ............................................ 4 Hình 4: Hoạt động phân cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid của amylase............... 10 Hình 5: Cơ chế tác dụng của hệ enzyme amylase ................................................... 10 Hình 6: Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột................................................ 14 Hình 7: Nếp sau khi nghiền nhỏ .............................................................................. 23 Hình 8: Mẫu xác định hoạt lực của 3 loại enzyme................................................... 23 Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 5, nồng độ 0,5ml/50g................................................................................................................ 24 Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 5,5 và nhiệt độ 650C 25 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 2,5ml/50g và nhiệt độ 700C.................................................................................... 26 Hình 12: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g ........ 27 Hình 13: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g ........ 27 Hình 14: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g ........ 27 Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 2,5ml/50g trong không gian....................................................... 28 Hình 16: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 3,5; nồng độ 0,5ml/50g........................................................................................................... 29 Hình 17: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 3,5 và nhiệt độ 600C 30 Hình 18: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 1,5ml/50g và nhiệt độ 600C.................................................................................... 31 Hình 19: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g ........ 32 Hình 20: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g ........ 32 Hình 21: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g ........ 33 Hình 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 0,5ml/50g trong không gian....................................................... 33 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vii Hình 23: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 4,5, nồng độ 0,5ml/50g........................................................................................................... 34 Hình 24: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 4 và nhiệt độ 600C 35 Hình 25: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 0,5ml/50g và nhiệt độ 600C.................................................................................... 36 Hình 26: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g ........ 37 Hình 27: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g ........ 37 Hình 28: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g ........ 38 Hình 29: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 0,5ml/50g trong không gian....................................................... 38 Hình 30: Đồ thị hàm lượng chất tan thu được trong dịch lọc và hàm lượng đường trong bã của enzyme từ nguồn khác nhau............................................................................. 40 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1:Thành phần hóa học của gạo nếp than......................................................... 3 Bảng 2: Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase .................................................. 11 Bảng 3: Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau ...................... 11 Bảng 4: Hoạt độ của enzyme amylase ..................................................................... 24 Bảng 5: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme α- amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus ............................................................. 24 Bảng 6: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme α- amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus ............................................................. 25 Bảng 7: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme α- amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus ............................................................. 26 Bảng 8: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus ................................................................. 29 Bảng 9: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus ................................................................. 31 Bảng 10: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus ................................................................. 32 Bảng 11: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ aspergillus niger ..................................................... 35 Bảng 12: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger .......................................................................... 36 Bảng 13: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger .......................................................................... 37 Bảng 14: So sánh khả năng thủy phân của enzyme................................................. 39 Bảng 15: Hiệu suất thủy phân của các loại enzyme ................................................. 40 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt khoa học và kỹ thuật sản xuất. Ở các nước trong khu vực hiện nay đã nghiên cứu cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc. Ở Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng, từ rượu Cần ở các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu đế, rượu nếp than của người Kinh. Nhiều địa phương đã sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu làng Vân ở miền Bắc, rượu Gò Đen, rượu Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng. Trong các loại rượu lên men truyền thống kể trên thì rượu nếp than là một loại rượu khá đặc biệt. Sản phẩm là kết quả của quá trình lên men không chưng cất nguyên liệu nếp mà thành. Tuy nhiên do nhân dân ta sản xuất theo phương pháp truyền thống (sử dụng bánh men thuốc bắc) nên chất lượng rượu không ổn định, năng suất rượu không cao vì trong thành phần bánh men thuốc bắc chứa nấm mốc, nấm men và vi khuẩn mà chúng ta không thể kiểm soát được số lượng của chúng trong bánh men chính vì vậy mà làm cho chất lượng và hiệu suất rượu không ổn định. Mặt khác thời gian sản xuất cũng rất dài do phải mất thời gian khoảng 3 ngày để nấm mốc chuyển hóa tinh bột thành đường và khoảng 4 ngày để nấm men chuyển hóa đường thành rượu. Với việc ứng dụng phương pháp enzyme để thay thế nấm mốc ở giai đoạn đường hóa có thể rút ngắn được thời gian sản xuất cũng như đảm bảo được chất lượng rượu do ít bị nhiễm vi sinh vật lạ và ít tốn kém lượng chất khô, vì vậy sẽ giảm được chi phí cho quá trình sản xuất, đảm bảo chất lượng sản phẩm và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này. Từ những lí do trên việc ứng dụng phương pháp enzyme trong sản xuất rượu vang nếp than cần được quan tâm và nghiên cứu. 1.2 Mục tiêu - Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase từ nấm mốc đến quá trình thuỷ phân tinh bột. - Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme (α-amylase, glucoamylase từ vi khuẩn và nấm mốc), nồng độ enzyme và nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân tinh bột. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về nếp than Nguyên liệu thường được sử dụng để sản xuất rượu là các loại ngũ cốc vì chứa hàm lượng tinh bột rất cao. Trong đó gạo, nếp là hai nguyên liệu quan trọng với hàm lượng tinh bột trên 70% được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu. Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng ở nhiều vùng Nam bộ, vì thế loại rượu này là đặc sản của vùng Nam bộ. Tên khoa học là Oryza Sativa Tamaka. Gạo nếp than gồm 4 loại: -Nếp cẩm Đức Hòa - Nếp đen Khánh Vinh - Nếp than Long Đất - Lúa lứt nếp cẩm Các loại lúa này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha. Hiện nay dân vùng Đồng bằng Nam bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này nếp than được chia thành 2 loại: - Nếp than đen huyền - Nếp than hồng đỏ Màu sắc của nếp than đó là màu anthocyanin, nó dễ dàng hòa tan trong nước và cho màu sắc đẹp tự nhiên. Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose... kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Hình 2: Cấu trúc của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường. Thông thường khi pH < 7 các anthocyanin Hình1 : Nguyên liệu nếp than Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH = 7 - 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh. Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng các loại nếp than có thành phần hóa học không khác nhiều. Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than Thành phần Hàm lượng Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu cơ Tro 14 8,2 1,5 74,9 0,6 0,8 Nguyễn Đức Lượng,2003 2.2 Giới thiệu chung về enzyme amylase Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrinh thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn. Amylase tìm thấy trong tuyến nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, trong sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Trong đó amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất. Dựa theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại: α-amylase, β-amylase, γ-amylase (glucoamylase), oligo-1,6-glucozidase (dextrinase),… Enzyme amylase cũng như các enzyme khác đều có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học. 2.3 Cấu trúc phân tử amylase 2.3.1 Thành phần cấu tạo Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, nghĩa là sản phẩm của sự phân giải enzyme này hoàn toàn chỉ gồm toàn những acid amin. Vì vậy, chúng thuộc loại enzyme đơn giản ( đơn cấu tử). Hiện nay, người ta biết có sáu loại enzyme được xếp thành hai nhóm là endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào). - Endoamylase: gồm α–amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (α-dextrin-6- Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 4 glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong chuỗi polysaccharide. - Exoamylase: gồm β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysacchride. Amylase Exoamylase Endoamylase β-amylase γ-amylase Enzyme khử nhánh α -amylase Khử trực tiếp Khử gián tiếp α-dextrin-6-glucanohydrolase Oligo-1,6- glucosidas (pullulanase) (transglucosilase) Và amylo-1,6-glucosidase Hình 3: Các loại enzyme endoamylase và exoamylase 2.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme Enzyme amylase nói riêng hay tất cả các enzyme nói chung đều là loại protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme. Không phải toàn bộ enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc biệt này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Đối với enzyme amylase trung tâm hoạt động của nó thường là những nhóm chức như: - NH2, - COOH, - SH… Ngoài ra để thực hiện được chức năng của mình enzyme amylase còn phải trải qua vai trò trung gian của phân tử H2O. 2.3.3 Tính đặc hiệu của enzyme Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định. Mỗi enzyme đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định và đối với một phản ứng hóa học nhất định. Tính chất xúc tác đặc hiệu đó gọi là tính đặc hiệu của enzyme. Tính đặc hiệu là một trong những tính chất cơ bản nhất của enzyme. Do cấu trúc hóa lý đặc biệt của enzyme và đặc biệt là trung tâm hoạt động mà enzyme có tính chất đặc hiệu rất cao so với các xúc tác thông thường khác. Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển hóa nhất định trong các kiểu phản ứng: oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân,… Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 5 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của amylase 2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme. Tốc độ phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tốc độ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và làm enzyme vô hoạt. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 400C – 500C. Nhiệt độ này tối ưu của enzyme khác nhau sẽ khác nhau. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH và các chất bảo vệ. Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. 2.4.2 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng của enzyme pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch về phía lớn hơn. Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến thực phẩm. 2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng của enzyme Enzyme tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Trong trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất tạo thành một sản phẩm (P), phản ứng xảy ra như sau. E+S K1 ES K3 P + E K2 K1 : hằng số vận tốc phản ứng tạo ES. K2 : hằng số vận tốc phân ly ES tạo cơ chất ban đầu. K3 : hằng số phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 6 Mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác và nồng độ cơ chất được biểu diễn theo phương trình Michaelis – Menten như sau: Vmax[S] v = Km + [S] Trong đó: - v : vận tốc phản ứng - Km : hằng số Michaelis – Menten - Vm : vận tốc phản ứng cực đại - [S] : nồng độ cơ chất Trong đó v là hàm số của [S], đồ thị có dạng nhánh hyperbol vuông góc: v Vmax Vmax/2 mK [S] Km gọi là hằng số Michaelis – Menten và đặc trưng cho mỗi enzyme, đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất. Km có giá trị càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng enzyme càng lớn. Qua đồ thị chung của đường biểu diễn cho thấy khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng tăng. Khi tăng nồng độ cơ chất đến giới hạn xác định nào đó, vận tốc phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax, sau đó vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng độ cơ chất. Từ phương trình (*), ta có thể xét 3 trường hợp xảy ra: - Nếu [S] << Km v = Vmax. [S]/Km. Như vậy khi [S] thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S], phương trình phản ứng theo bậc 1. - Nếu [S] >> Km v = Vmax : vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S]. Phản ứng bậc 0. - Nếu [S] = Km v = Vmax/2 Để dễ dàng xác định giá trị Km và Vmax, Line Weaver và Burk đã biến đổi phương trình Michaelis – Menten thành dạng phương trình đường thẳng bằng cách lấy nghịch đảo cả 2 vế của phương trình. Phương trình theo Line Weaver và Burk có dạng: Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 7 Km 1 1 1 = * + (**) V V [S] Vmax Phương trình (**) có dạng y = ax + b, đường biểu diễn là đường thẳng, cắt trục tung ở giá trị 1/Vmax, cắt trục hoành ở giá trị -1/Km. tg α = Km/Vmax 1/Vmax -1/Km 1/[S] Quan hệ giữa vận tốc phản ứng enzyme và nồng độ cơ chất theo Line Weaver và Burk. Theo cách này, chỉ cần thí nghiệm với 3, 4 nồng độ cơ chất thì ta có thể vẽ được đồ thị khá chính xác và xác định được các trị số Km, Vmax. 2.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng enzyme Vận tốc của của phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme khi có đầy đủ cơ chất. Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu. Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm V = k[E] Trong đó : V: Vận tốc phản ứng K: Hằng số vận tốc [E] : Nồng độ enzyme 2.4.5 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt động của amylase Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme amylase từ trạng thái không hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn, chất hoạt hóa có bản chất giống nhau có thể là: - Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro. Ví dụ: NAP+, NAD._.P+, acid arcosbic (chuyển hydro), ADP (chuyển photphat)... Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 8 - Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là bỏ một vài đoạn peptid, phá thế bị bao vây của các nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động. - Các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. Ví dụ: Trung tâm hoạt động của papain có chứa nhóm – SH sẽ chuyển thành - S – S- làm enzyme mất khả năng hoạt động. Nếu thêm vào môi trường các chất hoạt hóa có tính khử như cystein, glutation, nhóm – SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại. - Các anion, các ion kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của enzyme. Tuy nhiên, khi sử dụng các hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme. 2.4.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm Các chất kìm hãm là chất có mặt trong phản ứng enzyme làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là ion kim loại, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và protein. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Thường phân biệt hai loại kìm hãm thuận nghịch là: Kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh. - Kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả làm hoạt động của enzyme sẽ giảm. - Kìm hãm không cạnh tranh: Chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả chất kìm hãm này làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác, làm giảm hoạt động của enzyme. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi những ion kim loại nặng như: Cu2+, Ag2+, Hg2+...Ngoài ra axit sunfosalisilic 20%, acid chlohydric làm ngưng hoạt động của enzyme. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 9 2.4. 7 Cơ chất tác dụng Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. i. Tinh bột Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai mì,… trong các loại ngũ cốc, các loại hạt. Công thức tổng quát của tinh bột là (C6H12O6)n. Tinh bột từ các nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và amylopectin (Meyer, 1940). Các loại tinh bột đều có 20 – 30 % amylose và 70 – 80 % amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng. Amylose có trọng lượng phân tử 50000 – 160000, được cấu tạo từ 200 – 1000 phân tử D- glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylopectin có trọng lượng phân tử 400000 đến hàng chục triệu, được cấu tạo từ 600 – 6000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6- glucosid tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng hỗn hợp tinh bột khi bị đun nóng 60 – 850C thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và gọi là hồ tinh bột. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucosid bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và sau đó dextrin tiếp tục bị đường hóa tạo sản phẩm cuối là maltose và glucose. Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trong cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột, nhưng tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột. ii. Glycogen Glycogen là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng dần dần. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4- glucosid. Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6- glucosid. Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột. Glycogen dễ tan trong nước, nếu ta ăn quá nhiều carbohyrate thì cơ thể sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu trong gan. 2.5 Đặc tính và cơ chế tác dụng Các enzyme amylase từ các nguồn sẽ khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân. Ngay cả các amylase cùng loại do vi sinh vật tổng Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 10 hợp nên cũng có nhiều điểm khác nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động. Hình 4: Hoạt động phân cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid của amylase Hình 5: Cơ chế tác dụng của hệ enzyme amylase 2.5.1 α-amylase (EC.3.2.1.1) i. Đặc tính α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau. α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionin, có khoảng 7 – 10 gốc cysteine. Trọng lượng phân tử của α-amylase từ malt là 59 kDa (Fischer, Stein, 1960), từ nấm mốc là 45 – 50 kDa. α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH: 4,2 – 5,7(Bernfeld, 1951). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 11 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật. Là một metaloenzyme. Mỗi phân tử đều có chứa 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 – 6 nguyên tử gam/mol. Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme (Molodova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử enzyme bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của nấm sợi bền vững đối với acid tốt hơn α-amylase của malt và vi khuẩn. Ở pH 3,6 và 00C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 20 phút; α-amylase vi khuẩn bị vô hoạt 50 %, trong khi đó hoạt lực của α-amylase nấm sợi hầu như không giảm bao nhiêu. α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật. Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II. Hoạt hóa bởi ion hóa trị I như sau: Cl- > Br- > I-. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+… α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase). Bảng 2: Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase Nguồn gốc Nhiệt độ tối thích pH tối thích Malt 72-75 5.5-5.7 Nấm mốc 50-60 5.0-6.0 Vi khuẩn 60-70 6.0-7.0 Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004 Bảng 3: Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau Nhiệt độ (0C) Hoạt tính của α-amylase, % so hoạt tính với ban đầu Nấm sợi Malt Vi khuẩn 65 100 100 100 70 52 100 100 75 3 58 100 80 - 25 92 85 - 1 58 90 - - 52 95 - - 8 Nguyễn Đức Lượng, 2004 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 12 ii. Cơ chế tác dụng lên mạch Amylose và Amylopectin α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 Glucoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme). α-amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn có khả năng phân huỷ cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn: Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục để tạo thành maltose và glucose. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm 6-7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến maltose. Sau thời gian thủy phân amylose sản phẩm bao gồm: 87% maltose, 13% glucose. Dưới tác dụng của enzyme α-amylase amylopectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì α- amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy phân nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và izomaltose là 8%. Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của α-amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: α-amylase Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp - Giai đoạn đường hóa: α-amylase Dextrin tetra và trimaltose di và monosaccharides α-amylase Amylose Oligosaccharide Polyglucose Maltose maltotriose Maltotetrose Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi α-amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa 2.5.2 β-amylase (EC.3.2.1.2) i. Đặc tính β-amylase là một loại albumin. Tâm xúc tác của nó chứa gốc-SH, - COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 13 trong các hạt nẫy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc cho đến nay vẫn chưa được xác định. β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, urê, ido, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. pH tối thích trong dung dịch bột thuần khiết là 4-6, trong dung dịch nấu là 5-5.6. Nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40-500C. Trong dung dịch nấu là: 60-650C β-amylase bị vô hoạt ở nhiệt độ 700C. ii. Cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử. Maltose có cấu hình β được tạo thành. β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo- enzyme). β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Do mỗi nhánh của amylopectin có từ 20-25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10-12 phân tử maltose. Khi tới liên kết α-1,4 glucoside gắn với α-1,6 glucoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn. Có chứa nhiều liên kết α-1,6 glucoside gọi là dextrin có màu tím đỏ với iod. Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95%. Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau β-amylase Tinh bột maltose (54 – 58%) + β-dextrin (42 – 46%) Hình 6: Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 14 2.5.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4- glucan-glucohydrolase) (EC.3.2.1.3) i. Đặc tính γ-amylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự tham gia của các amylase khác. Glucoamylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng: Cu2+, Hg2+…có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn. Hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH 3.5-5.5. ii. Cơ chế tác dụng lên amylase và amylopectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4; 1,6 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose. Là enzyme ngoại phân exo-enzyme. Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Chúng không thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo thành glucose còn có thể tạo thành oligosaccharide. Ngoài ra, γ-amylase còn có thể phân cắt cả liên kết α-1,2; 1,3-glucoside nữa. Chú ý khi sử dụng hệ enzyme amylase trong sản xuất rượu: - Nguồn gốc của hệ enzyme amylase để biết được khoảng nhiệt độ, pH thích hợp. Nắm được chất hoạt hóa, chất ức chế đối với từng enzyme để làm tăng khả năng hoạt động của nó, tăng nhanh hiệu suất đường hóa. - Tùy nguyên liệu cụ thể có thành phần amylase, amylosepectin khác nhau mà sử dụng loại enzyme thích hợp, cân đối. - Tùy từng loại men, từng loại sản phẩm lên men mà có thành phần nguyên liệu khác nhau, hàm lượng đường lên men khác nhau, dẫn đến chủng loại enzyme khác nhau. Nói cách khác, chúng ta phải biết được các tính chất của nguồn enzyme đang sử dụng như tỉ lệ các loại enzyme, nhiệt độ, pH thích hợp cho enzyme đó. (Công nghệ enzyme, 2005) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 15 2.5.4 Oligo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10) Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucosid trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm (malt, thóc mầm). Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase (R-enzyme) và dextrin-1,6- glucosidase (còn gọi là amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-6- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.33). Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase nên trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1. 2.5.5 Pullulanase (EC3.2.1.41) Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside trong tinh bột và glycogen. Phân tử lượng của nó là 145000. pH hoạt động tối thích là 5,0 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 47,50C. Enzyme này có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside. 2.5.6 Transglucosidase Transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase. Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase. Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltotriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6-glucosid để tạo thành panose hoặc izomaltose. 2.7 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm 2.7.1 Trong sản xuất rượu Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu cho phép tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt, rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất, bởi enzyme amylase thủy phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian ngắn. Amylase không những quan trọng ở giai đoạn đường hóa mà còn ở cả giai đoạn xử lý nước nhiệt nguyên liệu nữa. Việc sử dụng amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85-900C cho phép có thể chỉ hoàn toàn dùng hơi thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi phí hơi trong gia nhiệt và giảm bớt tổn thất tinh bột. Vì vậy làm cho hiệu quả sản xuất tăng. 2.7.2 Trong sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có trong mầm đại mạch. Nguyên liệu chính là đại mạch nẩy mầm loại tốt. Khác với rượu ở đây mức độ đường hóa chứa trong nguyên liệu Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 16 thấp hơn. Cần có các dextrin chưa đường hóa làm cho bia có hương vị. Việc chuyển hóa tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các enzyme amylase đảm nhiệm nên trong quá trình dịch hóa và đường hóa thì enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng và vai trò quan trọng bậc nhất. Ta có thể bổ sung enzyme amylase từ các nguồn khác như vi sinh vật vào trong quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn. Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: - Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9% đại mạch ). - Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp ... những nguyên liệu không nẩy mầm. - Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt do đó tăng hiệu suất lao động. 2.7.3 Trong công nghệ sản xuất bánh mì Trong bánh mì, enzyme dược xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề sau: - Làm tăng nhanh thể tích bánh - Làm màu sắc của bánh đẹp hơn - Làm tăng mùi thơm cho bánh Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường. Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh . Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt. 2.7.4 Trong sản xuất bánh kẹo Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa từ tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh. Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin. Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 17 2.7.5 Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh. Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 18 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp & SHƯD- Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài được tiến hành từ ngày 26/02/07 đến ngày 18/05/07. 3.1.3 Nguyên liệu - Nếp than - Chế phẩm enzyme amylase thương mại (α-amylase từ Bacillus, glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus, glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger) - Các nguyên liệu khác 3.1.4 Hoá chất - Iod - NaOH - HCl - Fehling A và B - Một số hoá chất khác - Acid citric - Pb(CH3COO)2 - Na2SO4 3.1.5 Trang thiết bị - Chiết quang kế - Tủ lạnh - Máy đo độ màu - Nhiệt kế - Ống nghiệm - Máy xay nhỏ - Máy điều nhiệt - Ống đong - Erlen, Becker - Pipet các loại - Phểu thủy tinh - Cân phân tích Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase thương mại đến quá trình thuỷ phân tinh bột. i. Mục đích Nhằm rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao hiệu suất sản xuất. ii. Chuẩn bị mẫu - Mẫu tinh bột 5%. - Mẫu enzyme mỗi loại. - Mẫu dung dịch đệm (pH = 5) iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Chế phẩm enzyme A1 A2 A3 Tinh bột Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba loại enzyme: A1: α-amylase từ Bacillus A2 : glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus A3 : glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger Số lần lặp lại: 2 iv. Tiến hành - Hút 0,1ml enzyme mỗi loại pha với 200ml nước cất, và lấy: + 2ml tinh bột 5% + 2ml dung dịch đệm (pH 5) + 0,5ml dịch enzyme mỗi loại + 1,5ml nước cất Ta có tổng số ml cho mỗi ống nghiệm là 6ml. Ủ 2 ống nghiệm ở nhiệt độ 500C trong thời gian 5 phút. Lấy 0,5ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm thêm vào 5ml HCl 0,1N để phản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 2 ứng dừng lại. Tiếp tục lấy 0,5ml trong mỗi ống nghiệm và 5ml dung dịch iod cho vào 2 ống nghiệm, lắc kỹ. Đo độ hấp thụ ở bước sống 620nm. - Tính vận tốc phản ứng: gọi Ao – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu ban đầu (mẫu đối chứng); A1 – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu thủy phân trong 5 phút. Ao a mg tinh bột Ao – A1 o o A AA 1− * a (số mg tinh bột bị thủy phân trong khoảng thời gian t) Định nghĩa vận tốc phản ứng là số mg tinh bột bị thủy phân trong thời gian 1 phút. Công thức tính: t a A AA o o ∗ − 1 - Hoạt tính của enzyme Định nghĩa: Hoạt tính của enzyme là số ml dịch enzyme có thể thủy phân 1 mg tinh bột trong 1 phút ở 500C. Công thức tính: X = aAA Atb o o ∗− ∗∗ )( 1 v. Chỉ tiêu theo dõi - Lượng tinh bột còn lại. Kết quả theo dõi sẽ được xử lý bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0. 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme amylase, nồng độ enzyme, pH và nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân nếp than. i. Mục đích Nhằm xác định loại enzyme, nồng độ và nhiệt độ thuỷ phân thích hợp để quá trình thuỷ phân đạt hiệu quả cao. ii. Chuẩn bị mẫu - Nếp than được làm sạch, nghiền nhỏ. - Chế phẩm enzyme thương mại được chuẩn bị với 3 nồng độ khác nhau cho mỗi loại. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 Hình 7: Nếp sau khi nghiền nhỏ iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Nếp than Xử lý Trộn Chế phẩm enzyme 1 Chế phẩm enzyme 2 Chế phẩm enzyme 3 (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) A2 A3 A4 A1 A2 A3 A1 A2 A3 C4,C5,C6 C4,C5,C5 C4,C5,C6 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C2,C3,C4 C2,C3,C4 C2,C3,C4 Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba nhân tố Nhân tố A: giá trị nhiệt độ thay đổi theo các mức độ A1: 600C A2: 650C A3: 700C A4: 750C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 22 Nhân tố B: nồng độ enzyme sử dụng thay đổi theo các mức độ B1: 0,5 ml/50 g B2: 1,5ml/50 g B3: 2,5 ml/50 g Nhân tố C: giá trị pH thay đổi ở các mức độ C1: pH 3,5 C2: pH 4 C3: pH 4,5 C4: pH 5 C5: pH 5,5 C6: pH 6 Số lần lặp lại: 2 Tổng số nghiệm thức là: 102 iv. Tiến hành thí nghiệm Với mỗi loại enzyme ta tiến hành như sau: Cho 0,2ml enzyme vào 50g nếp than đã được nghiền sẵn với 200ml nước, sau đó chỉnh về pH C1 rồi đem đun ở nhiệt độ 70 0C trong 10 phút. Sau đó tiến hành nâng nhiệt độ lên nhiệt độ hồ hóa khoảng 10 phút rồi cho lượng enzyme còn lại ứng với nồng độ B1 (kể cả lượng enzyme lúc đầu), sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ A1 khoảng 40 phút. Trong suốt quá trình làm cứ 5 phút ta lấy mẫu ra làm lạnh để xác định Bx. Tổng thời gian nấu là 60 phút. Lặp lại với các nhiệt độ, pH và nồng độ còn lại cho cả ba nguồn chế phẩm enzyme khác nhau. v. Chỉ tiêu theo dõi - Độ Brix. - Hàm lượng đường tổng số của bã. Xử lý kết quả thống kê bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 23 A B A B B A CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định hoạt tính của enzyme thương mại Bảng 4: Hoạt độ của enzyme amylase Loại enzyme Hoạt độ (số ml enzyme/1mg tinh bột/1phút) α-amylase từ Bacillus 0,051 Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 0,052 Glucoamylase từ Aspergillus niger 0,054 Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị trong bảng càng nhỏ thì hoạt độ của enzyme càng mạnh. Từ bảng trên cho thấy enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn có hoạt tính mạnh hơn enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc. (a) α-amylase từ Bacillus (b) Glucoamylase từ Aspergillus niger Chú thích: A: mẫu có chứa enzyme B: mẫu đối chứng (c) Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus Hình 8: Mẫu xác định hoạt lực của 3 loại enzyme 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Tiến hành khảo sát ở 3 mức độ của enzyme, pH, nhiệt độ khác nhau kết quả thể hiện ở các đồ thị và bảng thống kê sau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 24 Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân, ở nồng độ 0,5ml/50g Ở các nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Giai đoạn đầu tốc độ tăng độ brix cao do nồng độ cơ chất cao, khi nồng độ cơ chất cao cơ hội enzyme tiếp xúc được với cơ chất lớn vì vậy enzyme thủy phân mạnh. Sau đó nồng độ cơ chất giảm, enzyme không còn đủ cơ chất để thủy phân như lúc đầu nên tốc độ tăng độ brix cũng chậm dần. Điều này cũng phù hợp với qui luật ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của enzyme (Giáo trình sinh hóa - Bùi Hữu Thuận). Qua đồ thị cũng thấy rõ khi nhiệt độ tăng thì khả năng thuỷ phân của enzyme cũng tăng vì nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng sẽ tăng. Kết quả cho thấy ở bảng 5 Bảng 5: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nhiệt độ Độ Brix 650C 17,87b 700C 18,06a 750C 18,19a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% Kết quả thống kê cho thấy nhiệt độ 700C và 750C khả năng thủy phân của enzyme là tốt nhất và không có sự khác biệt ở hai nhiệt độ. Đây là nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme vì enzyme được trích ly từ vi khuẩn nên khả năng chịu nhiệt của enzyme này cũng cao hơn so với những nguồn khác như nấm mốc, hay trích ly từ thực vật. Điều này 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65oC 70oC 75oC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C pH 5,5 pH 6 pH 5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 25 đã được chứng minh rằng nhiệt độ tối thích cho enzyme trích ly từ vi khuẩn từ 700C - 750C (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 650C Ở các nhiệt độ 700C và 750C cũng tuân theo qui luật như ở nhiệt độ 650C Từ đồ thị thấy rõ sự khác biệt của nồng độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Khi nồng độ tăng thì độ brix đạt được cũng tăng vì nồng độ enzyme tăng thì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất sẽ tăng nên tốc độ thủy phân cũng tăng. Bảng 6: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nồng độ Độ Brix 0,5ml/50g 17,78c 1,5ml/50g 18,09b 2,5ml/50g 18,24a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Theo kết quả bảng 6, 2,5ml/50g cho độ brix cao nhất và khác biệt có ý nghĩa. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5m l 1,5ml 2,5m l 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml pH 5 pH 5,5 pH 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ._.