Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter Xylinum tạo Cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở Quy mô Pilot

36 Chöông 3 VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.1 Gioáng Moät soá chuûng Acetobacter xylinum thu thaäp töø caùc Vieän nghieân cöùu trong vaø ngoaøi nöôùc. Moät soá maãu phaân laäp thu thaäp töø caùc cô sôû saûn xuaát Nata – de Coco trong vaø ngoaøi nöôùc. Nguoàn thu thaäp gioáng vaø maãu phaân laäp theå hieän chi tieát qua baûng 3.1. Baûng 3.1 Ñòa ñieåm thu thaäp gioáng vaø maãu phaân laäp Kyùhieäu maãu Nguoàn thu thaäp Kyù hieäu maãu Nguoàn thu thaäp 1 Vieän Coâng ngheä AÙ chaâu taïi Thaùi Lan 8 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (Bulacan-Philippines) 2 Tröôøng Ñaïi hoïc Kasetsart Thaùi Lan 9 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (Namli-Philippines) 3 Vieän coâng ngheä Thöïc phaåm vaø moâi tröôøng Philippines 10 Cô sôû saûn xuaát thaïch döøa (Pulalan-Philippines) 4 Vieän Sinh hoïc nhieät ñôùi TP.HCM 11 Dòch giaám thoát noát 5 Tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa TP.HCM 12 Dòch giaám gaïo 6 Tröôøng Ñaïi hoïc Y Döôïc TP.HCM 13 Dòch giaám döùa 7 Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm I Haø noäi 14 Dòch giaám nöôùc döøa 3.2 Nguyeân lieäu vaø moâi tröôøng dinh döôõng 3.2.1 Nguyeân lieäu • Nöôùc döøa giaø: ñöôïc laáy taïi cô sôû saûn xuaát kem Thuû Ñöùc, thaønh phoá Hoà Chí Minh. • Ræ ñöôøng: ræ ñöôøng mía coù nguoán goác töø nhaø maùy ñöôøng Bieân Hoaø. • Nöôùc mía: Gioáng mía ROC – 10 laø nguyeân lieäu cho caùc nhaø maùy ñöôøng. Mía ñöôïc söû duïng trong giai ñoaïn thu hoaïch ñeå thu dòch mía eùp. 37 • Dòch traùi caây pheá thaûi: Dòch phuï phaåm cuûa saûn phaåm xoaøi- döùa ñoùng hoäp. Dòch maét döùa, phuï phaåm cuûa saûn phaåm döùa ñoùng hoäp. • Tinh boät saén: Cô sôû Taøi Kyù, thaønh phoá Hoà Chí Minh. • Dòch ñaäu naønh: dung dòch ñaäu naønh thu ñöôïc sau khi ñoâng tuï söõa ñaäu naønh coù chöùa nitô doài daøo söû duïng laøm nguoàn [N] höõu cô vaø chaát kích thích sinh tröôûng boå sung cho vi khuaån. • Dòch naám men thuûy phaân: 8 g men khoâ( töông ñöông 75g men eùp töôi) hoøa vaøo 1 lít nöôùc maùy, ngaâm 20 phuùt ôû nhieät ñoä aám vaø naâng daàn ñeán nhieät ñoä soâi. Ñun soâi trong 20 phuùt. Thu dòch trong vaø boå sung nöôùc cho ñuû 1 lít. Khöû truøng ôû 0,5 atm trong 20-30 phuùt. Baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng trong voøng 2 thaùng. Caùc nguyeân lieäu treân ñöôïc khaûo saùt thaønh phaàn oån ñònh ñeå thí nghieäm vaø trích daãn trong phuï luïc . 3.2.2 Moâi tröôøng dinh döôõng Goàm caùc moâi tröôøng phaân laäp, nhaân gioáng vaø leân men saûn xuaát BC. 3.2.2.1 Moâi tröôøng ræ ñöôøng Baûng 3.2 Thaønh phaàn moâi tröôøng ræ ñöôøng Moâi tröôøng phaân laäp Moâi tröôøng nhaân gioáng Moâi tröôøng leân men BC Moâi tröôøng choïn loïc ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine Ræ ñöôøng : 4% Cao baép : 0,5% Cao naám men : 0,5% Cao thòt : 0,1% (NH4)2HPO4 : 0, 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% MgSO4.7H2O : 0,1% KH2PO4 : 0,05% K2HPO4 : 0,05% Agar : 2% Nöôùc caát : Ñuû Ræ ñöôøng : 4% Cao naám men: 1% (NH4)2HPO4 : 0, 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% MgSO4.7H2O : 0,1% KH2PO4 : 0,05% K2HPO4 : 0,05% Acid acetic : 0,5% Nöôùc caát : Ñuû Ræ ñöôøng : 4% Pepton : 1,5% Acid acetic : 0,5% (NH4)2HPO4 : 0, 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% Nöôùc caát : Ñuû Ræ ñöôøng : 4% Cao naám men: 0,5% Cao baép : 0,5% (NH4)2HPO4 : 0, 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% MgSO4.7H2O : 0,1% KH2PO4 : 0,05% K2HPO4 : 0,05% Agar : 2% Nöôùc caát : Ñuû Sulfaguanidine : 850 mg/ l moâi tröôøng 3.2.2.2 Moâi tröôøng nöôùc mía 38 Töông töï caùc moâi tröôøng ræ ñöôøng, thay theá ræ ñöôøng baèng 10% dòch nöôùc mía. 3.2.2.3 Moâi tröôøng phuï phaåm traùi caây Töông töï caùc moâi tröôøng ræ ñöôøng, thay theá ræ ñöôøng baèng 10% dòch nöôùc eùp maét döùa hoaëc phuï phaåm xoaøi döùa vaø 1% ñöôøng saccharose. 3.2.2.4 Moâi tröôøng tinh boät Söû duïng hai moâi tröôøng hoùa chaát toång hôïp cuûa caùc taùc giaû Moon Soo Heo vaø Hong Joo Son [ 85], trong ñoù nguoàn glucose thay theá baèng nguoàn tinh boät thuûy phaân ( Kyù hieäu TB1 vaø TB2). TB1: Tinh boät : 5% Cheá phaåm amylase : 1% (NH4)2SO4 : 0, 2% Ethanol : 1,4% K2HPO4 : 0,25% Na2HPO4.12 H2O : 0,3% MgSO4.7H2O : 0,05% FeSO4.7H2O : 0,00025% Nicotinamide : 6.10-5% Inositol : 0,00025% TB2: Tinh boät : 5% Cheá phaåm amylase : 1% Cao naám men : 5% Ethanol : 1,4% Na2HPO4.12 H2O : 0,3% Acid citric : 0,115% 3.2.2.5 Moâi tröôøng ñoái chöùng nöôùc döøa giaø Moâi tröôøng nhaân gioáng: Glucose : 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% Cao naám men : 0,5% Pepton : 0,5% (NH4)2HPO4 : 0, 2% Acid acetic : 0,5% Nöôùc döøa giaø : 1 lít Moâi tröôøng leân men: Glucose : 2% (NH4)2SO4 : 0, 8% (NH4)2HPO4 : 0, 2% Acid acetic : 0,5% Nöôùc döøa giaø :1 lít 39 3.3 Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu 3.3.1 Caùc böôùc thí nghieäm Baûng 3.3 Noäi dung vaø caùc böôùc thí nghieäm Thöù töï Böôùc thí nghieäm Noäi dung tieán haønh 1 GIOÁNG Söu taäp gioáng - Saøng loïc gioáng cho töøng loaïi nguyeân lieäu vaø kieåu leân men - Caûi thieän gioáng - Nhaân gioáng 2 NGUYEÂN LIEÄU Maät ræ ñöôøng - Nöôùc mía - Dòch traùi caây pheá thaûi - Tinh boät thuûy phaân 3 KIEÅU LEÂN MEN Leân men beà maët - Leân men chìm 4 CAÙC ÑIEÀU KIEÄN LEÂN MEN PHOØNG THÍ NGHIEÄM pH - Nhieät ñoä - Thôøi gian - Tyû leä gioáng - Phöông thöùc khuaáy ñaûo 5 LEÂN MEN QUY MOÂ PILOT Leân men beà maët quy moâ pilot treân dieän tích roäng 1,5m2 - Leân men beà maët quy moâ pilot treân khay nhoû- Leân men chìm quy moâ pilot 6 SAÛN PHAÅM BC Daïng maøng - Mieáng - Haït - Sôïi – Boät 7 ÖÙNG DUÏNG - Söû duïng BC laøm chaát neàn ( matrix) ñeå coá ñònh teá baøo vi khuaån - Söû duïng BC laøm giaù ñôõ (supporter) ñeå leân men baùn raén thu sinh khoái vi sinh vaät. -Söû duïng teá baøo vi khuaån Acetobacter xylinum laøm taùc nhaân keát dính. 3.3.2 Laäp boä söu taäp gioáng Ñeå laäp boä söu taäp gioáng, chuùng toâi tieán haønh : • Thu thaäp gioáng vaø maãu töø caùc nguoàn trong vaø ngoaøi nöôùc. Caùc maãu ñöôïc giôùi haïn coù söï hieän dieän cuûa vi khuaån Acetobacter. • Kieåm tra caùc ñaëc tính cuûa Acetobacter. 40 • Sô tuyeån nhanh vaø ñaùnh giaù caùc chuûng Acetobacter coù khaû naêng saûn sinh cellulose treân moâi tröôøng dòch theå. • Vôùi caùc doøng sô tuyeån, tieán haønh kieåm tra caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc ( hình thaùi hoïc, teá baøo hoïc, sinh tröôûng treân moâi tröôøng ñaëc, loûng, caùc ñaëc ñieåm sinh lyù vaø sinh hoùa ) [1,2]. Hình thaùi hoïc vaø teá baøo hoïc: khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình daïng teá baøo, söï saép xeáp cuûa teá baøo, khaû naêng di ñoäng, söï toàn taïi cuûa baøo töû, kích thöôùc teá baøo, nhuoäm Gram, bao nhaày. Hình aûnh vi theå chuïp treân kính hieån vi ñieän töû JEM 1010 (x10000) vaø kính hieån vi ñoä phoùng ñaïi 1000 laàn. Hình daïng vaø söï lieân keát cuûa teá baøo ñöôïc xaùc ñònh khi soi kính hieån vi. Kích thöôùc teá baøo ñöôïc xaùc ñònh döôùi kính hieån vi nhôø traéc vi thò kính. Phaùt hieän khaû naêng di ñoäng trong tieâu baûn gioït treo coù boå sung HgCl2 0,1% ñeå phaân bieät vôùi chuyeån ñoäng Brown. Phaùt hieän baøo töû khi nhuoäm maøu phaân bieät teá baøo, baøo töû vaø khi theo doõi söï phaùt trieån trong moâi tröôøng ñöôïc caáy baèng huyeàn phuø ñaõ khöû truøng Pasteur. Phaùt hieän bao nhaày baèng caùch duøng möïc nho ñeå taïo ra söï töông phaûn aâm. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng treân moâi tröôøng ñaëc: Phaân laäp vaø nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch ñóa theo phöông phaùp Vinogradxki. Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm khuaån laïc cuûa caùc chuûng vi khuaån sô tuyeån thoâng qua hình daïng, kích thöôùc, ñöôøng kính, ñaëc tính quang hoïc, maøu saéc khuaån laïc, beà maët vaø maët caét ngang khuaån laïc, meùp khuaån laïc, caáu truùc vaø ñoä ñaëc khuaån laïc. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng treân moâi tröôøng loûng: Khaûo saùt möùc ñoä sinh tröôûng, khaû naêng taïo maøng vaø ñaëc ñieåm cuûa maøng. Ñaëc ñieåm sinh lyù: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa oxygen, nhieät ñoä vaø pH. 41 Ñaëc ñieåm sinh hoùa: Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm sinh hoùa duøng ñeå phaân loaïi bao goàm oxy hoùa ethanol thaønh acid acetic, catalase, sinh tröôûng treân moâi tröôøng Hoyer, chuyeån hoùa glucose thaønh acid, chuyeån hoaù glycerol thaønh dihydroxyaceton, khaû naêng sinh saéc toá naâu, khaû naêng toång hôïp cellulose. . Khaû naêng oxy hoùa ethanol: Theâm 1ml dung dòch Bromocresol vaøo moâi tröôøng kieåm tra. Tröôùc khi caáy vi khuaån cho theâm 1ml ethanol 15% vaøo. Ñoái vôùi Acetobacter xylinum, moâi tröôøng chuyeån thaønh maøu vaøng sau ñoù trôû thaønh maøu lam luïc. . Sinh tröôûng treân moâi tröôøng Hoyer. Acetobacter xylinum khoâng phaùt trieån treân moâi tröôøng Hoyer. . Khaû naêng chuyeån hoaù glucose thaønh acid: Quan saùt söï xuaát hieän voøng saùng quanh khuaån laïc cuûa Acetobacter xylinum khi nuoâi treân moâi tröôøng kieåm tra. . Khaû naêng chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxyaceton: Nhoû dung dòch Fehling leân maët thaïch ñeå kieåm tra söï taïo thaønh dihydroxyaceton (coù söï xuaát hieän voøng CuO quanh khuaån laïc taïo thaønh maøu ñoû). . Sinh saéc toá naâu: Acetobacer xylinum khoâng sinh saéc toá naâu. . Sinh toånghôïp cellulose: Nhoû dung dòch Lugol vaø H2SO4 60% leân maët thaïch seõ khoâng xuaát hieän maøu lam. . Hoaït tính catalase: 42 Laáy 1ml H2O2 nhoû tröïc tieáp vaøo oáng thaïch nghieâng ñaõ caáy Acetobacter, sau 2 giôø nuoâi caáy neáu coù boït khí xuaát hieän laø catalase döông tính [1, 2, 38]. 3.3.3 Saøng loïc gioáng phuø hôïp vôùi nguoàn nguyeân lieäu Saøng loïc gioáng thích öùng vôùi töøng nguoàn nguyeân lieäu (ræ ñöôøng, nöôùc mía,…) thoâng qua caùc chæ tieâu : - Khaû naêng taêng tröôûng treân moâi tröôøng ñaëc (ræ ñöôøng, nöôùc mía,…) - Maät ñoä teá baøo treân moâi tröôøng loûng(ræ ñöôøng, nöôùc mía,…) - Thôøi gian xuaát hieän maøng - Ñoä daøy cuûa maøng - Saûn löôïng BC thu ñöôïc trong leân men beà maët vaø leân men chìm. 3.3.4 Caûi thieän gioáng: Ñoät bieán baèng tia UV, choïn loïc doøng ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine, coù khaû naêng toång hôïp cellulose cao Gaây ñoät bieán baèng tia UV ôû böôùc soùng 260nm ñeå choïn loïc doøng coù khaû naêng taïo ra BC cao treân moâi tröôøng ræ ñöôøng qua caùc khaûo saùt: - Aûnh höôûng cuûa tia töû ngoaïi ñeán teá baøo vi khuaån Acetobacter xylinum, xaùc ñònh möùc ñoä soáng soùt vaø tyû leä % gaây cheát. - Choïn loïc ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine. - Khaû naêng leân men cellulose cuûa caùc doøng ñoät bieán treân moâi tröôøng ræ ñöôøng, so saùnh maät ñoä teá baøo vaø saûn löôïng BC cuûa caùc doøng ñoät bieán so vôùi doøng goác. • Taùc ñoäng gaây cheát cuûa tia töû ngoaïi leân teá baøo vi khuaån Acetobacter xylinum: - Hoaït hoùa vaø nhaân gioáng vi khuaån A.xylinum ôû 28-300C trong 4 ngaøy. Xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch nhaân gioáng. Chuyeån dòch nhaân gioáng vaøo ñóa Petri voâ truøng sao cho beà cao cuûa dòch gioáng trong ñóa laø 4mm. - Chieáu xaï tia töû ngoaïi: Trong tuû caáy voâ truøng ñöôïc boá trí moät ñeøn töû ngoaïi coù chieàu daøi 60 cm, maùy khuaáy töø. Khoaûng caùch töø ñeøn töû ngoaïi ñeán beà maët maùy khuaáy töø laø 9cm. Ñaët ñóa Petri chöùa dòch teá baøo vi khuaån 43 A.xylinum leân maùy khuaáy töø trong tuû voâ truøng ( ñieàu chænh toác ñoä khuaáy phuø hôïp ñeå teá baøo ñöôïc troän ñeàu trong quaù trình chieáu xaï). Môû naép hoäp Petri vaø baät ñeøn UV ñeå thöïc hieän caùc lieàu chieáu xaï nhö sau : 0; 10-4J/cm2; 1,5.10-4J/cm2; 2.10-4J/cm2; 2,5.10-4J/cm2; 3.10-4J/cm2. Thôøi gian chieáu xaï töông öùng laø 0; 30; 60; 90; 120 vaø 150 giaây. - ÔÛ moãi lieàu chieáu xaï, duøng pipetman huùt 500µ l cho vaøo caùc oáng eppendorf töông öùng. - Ñeå traùnh aùnh saùng tieáp xuùc vôùi dòch, caùc oáng eppendorf caàn boïc giaáy baïc beân ngoaøi vaø uû toái trong 2 giôø ñeå traùnh hieän töôïng quang phuïc hoài. - Traûi dòch gioáng teá baøo chieáu xaï leân moâi tröôøng choïn loïc ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine. - Xaùc ñònh tyû leä soáng soùt cuûa caùc teá baøo sau chieáu xaï. • Choïn loïc caùc ñoät bieán khaùng Sulfaguanidine - Vôùi 4 loâ thí nghieäm A,B, C, D nhö sau: Dòch gioáng Moâi tröôøng Dòch gioáng khoâng chieáu xaï Dòch gioáng chieáu xaï Moâi tröôøng khoâng coù Sulfaguanidine Loâ A Loâ C Moâi tröôøng Sulfaguanidine 850 mg/l moâi tröôøng LoâB Loâ D Sau 4 ngaøy uû ôû nhieät ñoä 28-300C, ñeám soá khuaån laïc treân moãi ñóa ôû moãi loâ thí nghieäm. 44 Kieåm tra laïi tính khaùng Sulfaguanidine cuûa caùc chuûng ñoät bieán baèng phöông phaùp in daáu nhung. 3.3.5 Khaûo saùt quaù trình nhaân gioáng quy moâ nhoû vaø quy moâ pilot Caùc khaûo saùt quaù trình nhaân gioáng xaùc ñònh: - Xaùc ñònh nguoàn[N] höõu cô: Söû duïng 4 nguoàn pepton, cao naám men, dòch ñaäu naønh vaø dòch chieát naám men thuûy phaân. Xaùc ñònh nguoàn [N] höõu cô phuø hôïp. - Xaùc ñònh toác ñoä laéc : Khaûo saùt 5 toác ñoä quay cuûa maùy laéc 100, 200, 250, 300 vaø 350 voøng/ phuùt. - Xaùc ñònh thôøi gian nhaân gioáng trong khoaûng töø 2 ñeán 6 ngaøy. - Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä nuoâi caáy trong quaù trình nhaân gioáng qua 5 möùc 25oC, 28oC, 30oC, 32oC vaø 35oC. - Xaùc ñònh phöông thöùc khuaáy ñaûo trong nhaân gioáng quy moâ lôùn (nhaân gioáng caáp 3) qua 3 kieåu: fermentor, thieát bò coù heä thoáng thoåi khí vaø thieát bò coù heä thoáng thoåi khí - hoài löu. Fermentor: Bio Flo 115 Modular Fermentor ME1275 – 0055, vôùi caùc thoâng soá ñaõ xaùc ñònh ôû treân veà moâi tröôøng nhaân gioáng, thôøi gian, nhieät ñoä, pH toái öu, heä thoáng caùnh khuaáy cheõ ba vôùi toác ñoä 200 voøng / phuùt ñaït noàng ñoä oxy hoøa tan trong khoûang 0,5-0,6 mmol / l / phuùt. Thieát bò coù heä thoáng thoåi khí: maùy suïc khí Lifetech AP1000 vôùi caùc thoâng soá nhö sau: - Löu löôïng khí max: 1 m3/phuùt. - Löu löôïng khí duøng trong thí nghieäm: 5.10-2 m3/phuùt. Thieát bò coù heä thoáng thoåi khí – hoài löu: + Maùy suïc khí Lifetech AP1000 vôùi caùc thoâng soá nhö treân. + Maùy bôm Lifetech AP1600 vôùi löu löôïng bôm 100 l/h. Chæ tieâu theo doõi: maät ñoä teá baøo/ml. 45 Moät soá phöông thöùc trong quaù trình nhaân gioáng, leân men BC ñöôïc ghi nhaän qua hình 3.1. 1.Lên men bề mặt 2. Lên men chìm (Maùy lắc) 3. Lên men chìm (Thoåi khí-Hồi lưu) 4. Lên men chìm (Fermentor) Hình 3.1. Moât soá phöông thöùc trong quaù trình nhaân gioáng, leân men BC 3.3.6 Thaønh phaàn moâi tröôøng phuø hôïp phöông thöùc leân men beà maët vaø leân men chìm - Xaùc ñònh nguoàn [N] höõu cô: Söû duïng 4 nguoàn laø pepton, cao naám men, dòch ñaäu naønh vaø dòch chieát naám men thuûy phaân. - Xaùc ñònh noàng ñoä [N] höõu cô ( dòch chieát naám men): Vôùi 5 möùc [N] thay ñoåi 1% , 3%, 5%, 7%, 9%. - Xaùc ñònh noàng ñoä [C] (nguoàn ræ ñöôøng) thay ñoåi 2%, 4%, 6%, 8%. 46 Caùc chæ tieâu theo doõi: maät ñoä teá baøo, saûn löôïng S-BC, saûn löôïng A-BC. 3.3.7 Moät soá ñieàu kieän nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men beà maët vaø leân men chìm BC - Aûnh höôûng cuûa pH ban ñaàu vôùi caùc möùc khaûo saùt pH thay ñoåi töø 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6. - Aûnh höôûng cuûa löôïng gioáng vaø thôøi gian leân men vôùi 5 möùc thay ñoåi tyû leä gioáng 4%, 6%, 8%, 10%, 12% trong thôøi gian theo doõi töø 4 -8 ngaøy. - Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä moâi tröôøng trong quaù trình leân men BC vôùi 5 möùc 26oC , 28 oC, 30 oC, 32oC, 34oC. - Rieâng ñoái vôùi kieåu leân men chìm ñeå thu A-BC : Theo doõi toác ñoä quay cuûa maùy laéc trong leân men chìm vaø theo 3 phöông thöùc khuaáy ñaûo: söû duïng maùy laéc, thieát bò coù heä thoáng thoåi khí vaø thieát bò coù heä thoáng thoåi khí - hoài löu. Caùc chæ tieâu theo doõi: Saûn löôïng S-BC, saûn löôïng A-BC. 3.3.8 Nghieân cöùu bieán ñoäng trong quaù trình leân men BC ôû quy moâ phoøng thí nghieäm Vôùi caùc thoâng soá toái öu, khaûo saùt caùc bieán ñoäng trong quaù trình leân men beà maët vaø leân men chìm cellulose vi khuaån ôû quy moâ phoøng thí nghieäm vôùi 4 chæ tieâu: - Maät ñoä teá baøo (106 teá baøo/ ml). - Ñöôøng toång (g/ l). - pH. - Saûn löôïng S-BC hoaëc A-BC ( g/ l moâi tröôøng). Maät ñoä teá baøo ñeám giaùn tieáp khuaån laïc treân moâi tröôøng thaïch ñóa. Caùc phöông phaùp phaân tích ñöôøng Bectrand, so maøu, ño pH baèng maùy ño pH. S-BC hoaëc A-BC sau khi thu hoaïch ñeå raùo nöôùc hoaøn toaøn, caân troïng löôïng töôi ñeå xaùc ñònh saûn löôïng BC töôi. 47 S-BC hoaëc A-BC sau khi thu hoaïch ñeå raùo nöôùc hoaøn toaøn, saáy ôû 1050C cho ñeán khi khoâng thay ñoåi troïng löôïng, caân troïng löôïng khoâ ñeå xaùc ñònh saûn löôïng BC khoâ. 3.3.9 Thöû nghieäm leân men BC ôû quy moâ pilot 3.3.9.1 Leân men beà maët treân dieän tích roäng 1,5 m2 - Thí nghieäm treân caùc khung goã coù dieän tích 1,5 m2 (1m x 1,5 m), loùt baèng bao PE môùi loaïi 2 lôùp coù thanh truøng (ngaâm coàn) chöùa 20 lít dòch moâi tröôøng leân men. Quy moâ 100 lít/meû, thí nghieäm laäp laïi 3 laàn. - So saùnh bieán ñoäng trong quaù trình leân men beà maët BC treân moâi tröôøng ræ ñöôøng quy moâ phoøng thí nghieäm vaø quy moâ pilot vôùi caùc chæ tieâu bieán ñoäng töông töï muïc 3.3.8. - Chæ tieâu theo doõi: Maät ñoä teá baøo, Ñöôøng toång, pH, saûn löôïng S-BC. 3.3.9.2 Leân men beà maët quy moâ pilot treân nhieàu khay nhoû - Kích thöôùc khay 30 cm x 25 cm chöùa 1 lít moâi tröôøng (MT) leân men. - Quy moâ: 200 lít/meû. - Chæ tieâu theo doõi : Saûn löôïng S-BC. 3.3.9.3 Leân men chìm quy moâ pilot vôùi thieát bò leân men coù heä thoáng thoåi khí - hoài löu. - Dung tích bình chöùa: 25 lít. - Theå tích dòch leân men: 15 lít / bình. - Quy moâ: 75 lít/ meû. So saùnh bieán ñoäng quaù trình leân men chìm BC treân moâi tröôøng ræ ñöôøng quy moâ phoøng thí nghieäm vaø quy moâ pilot, ñeå caûi thieän saûn löôïng A-BC qua caùc phöông aùn ñieàu chænh taêng tyû leä gioáng vaø keùo daøi thôøi gian leân men. 3.3.10 Phöông phaùp xöû lyù BC - Muïc ñích: xöû lyù BC ( S-BC vaø A-BC) ñeå söû duïng BC laøm chaát neàn– giaù theå( matrix) coá ñònh teá baøo vi sinh vaät. 48 - Yeâu caàu: BC töôi thu ñöôïc sau leân men coù ñoä ngaäm nöôùc khaù cao. Trong BC chöùa moät löôïng lôùn moâi tröôøng leân men vaø caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát (acid acetic …), do ñoù xöû lyù BC phaûi ñaït caùc yeâu caàu sau: • Coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh ñeå chòu ñöôïc caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän, caùc aùp löïc … • Voâ truøng. • Loaïi boû hoaøn toaøn caùc taïp chaát ñeå chaát neàn BC khoâng aûnh höôûng ñeán teá baøo vi sinh vaät seõ coá ñònh. - Phöông phaùp 1: Ñun BC vôùi NaOH 3% trong 30 phuùt. Trung hoøa baèng HCl 5%. - Phöông phaùp 2: Ngaâm vôùi NaOH 3% trong 12 giôø. Trung hoøa baèng HCl 5%. - Phöông phaùp 3: BC thoâ thu ñöôïc sau leân men coù aåm ñoä töø 90-92%. • Ngaâm nöôùc: thôøi gian 24 h, thay nöôùc 4 laàn. • Vaét laàn 1: Thôøi gian 10 phuùt, toác ñoä vaét 100-200 v/phuùt, aåm ñoä 50 -55% sau khi vaét. • Ngaâm nöôùc cho tröông nôû trôû laïi: thôøi gian laø 24h, thay nöôùc 4 laàn. • Vaét laàn 2: thôøi gian 10 phuùt, toác ñoä vaét töø 100-200 v/phuùt, aåm ñoä sau khi vaét 50-55%. • Saáy: nhieät ñoä saáy laø 40oC, thôøi gian laø 10h vaø aåm ñoä sau khi saáy laø 12-15%. Sau khi saáy, vôùi S-BC coù theå ñeå nguyeân maøng hoaëc caét thaønh caùc mieáng nhoû coù kích thöôùc 4 x 2 cm vaø 2 x 2 cm ñeå tieän söû duïng (neáu caàn) , ñoái vôùi daïng A-BC thì ñeå nguyeân daïng haït. • Khöû truøng: 121oC trong 15-20 phuùt. - Phöông phaùp 4: Ngaâm vôùi NaOH 3% trong 2 giôø. Trung hoøa baèng HCl 5%. Laëp laïi phöông phaùp 3. 49 - Xaùc ñònh phöông phaùp xöû lyù BC phuø hôïp. 3.3.11 Phöông phaùp coá ñònh vi khuaån A.xylinum treân BC Böôùc 1) Xöû lyù dòch gioáng vi khuaån caàn coá ñònh - Chuaån bò gioáng thuaàn khieát treân moâi tröôøng thaïch nghieâng. - Nhaân gioáng : caùc cheá ñoä nhaân gioáng toái öu muïc 3.3.5. Maät ñoäâ gioáng trung bình ñaït 48.106 ñeán 5.107 teá baøo/ml. - Ly taâm thu sinh khoái gioáng Böôùc 2) Phöông phaùp baãy haáp thuï vi khuaån treân BC: goàm 2 giai ñoaïn * Giai ñoaïn 1: BC ñoùng vai troø laø chaát neàn ( matrix) ñeå haáp thuï vi khuaån caàn coá ñònh. - Chuyeån BC ñaõ xöû lyù, sinh khoái gioáng vi khuaån sau ly taâm vaø dòch moâi tröôøng dinh döôõng töôi vaøo bình ( 100 gam BC ñaõ xöû lyù coù khaû naêng haáp thuï vaø tröông nôû hoøan toaøn 0,5 lít dòch coù maät ñoä gioáng laø 3.108 teá baøo/ ml ). Söû duïng bình coù dung tích 1 lít. - 3 phöông phaùp haáp thuï sau: • Phöông phaùp A: ngaâm trong thôøi gian 20-30 phuùt, cho ñeán khi mieáng BC tröông nôû hoaøn toaøn trong dòch gioáng. • Phöông phaùp B: nhö phöông phaùp A nhöng keát hôïp söû duïng caùnh khuaáy ñeå taêng khaû naêng haáp thuï teá baøo vi khuaån vaøo chaát mang. • Phöông phaùp C: töông töï phöông phaùp A nhöng keát hôïp söû duïng cheá ñoä laéc 250 v/phuùt ñeå taêng khaû naêng haáp thuï teá baøo vi khuaån vaøo chaát mang. * Giai ñoaïn 2: BC ñoùng vai troø laø giaù ñôõ ( supporter) ñeå nhaân gioáng thu sinh khoái vi khuaån - Chaát neàn BC sau khi coá ñònh vi khuaån ñöôïc chuyeån vaøo caùc ñóa Petri. - Ñaët caùc ñóa Petri chöùa BC ñaõ coá ñònh vi khuaån vaøo tuû aám phuø hôïp vôùi nhieät ñoä sinh lyù vi khuaån coá ñònh. Ví duï, vôùi A.xylinum thì nhieät ñoä uû trong khoaûng 28-30oC. Vôùi nhoùm vi khuaån Lactic thì nhieät ñoä uû töø 40- 50 450C. Thôøi gian uû toái öu ñöôïc xaùc ñònh khi maät ñoä vi khuaån coá ñònh cao nhaát. Phöông phaùp theo doõi trong vaø sau quaù trình coá ñònh - Maät ñoä vi khuaån phaùt trieån treân chaát neàn (matrix) trong thôøi gian uû: . Khaûo saùt 2 daïng chaát neàn laø S-BC vaø A-BC . Xaùc ñònh thôøi gian uû toái öu, cho maät ñoä teá baøo vi khuaån cao nhaát. - Gia taêng maät ñoä vi khuaån phaùt trieån treân caùc chaát neàn baèng caùch caûi tieán phöông phaùp haáp thuï. - Maät ñoä vi khuaån coá ñònh treân chaát neàn trong thôøi gian baûo quaûn ôû 2 cheá ñoä : nhieät ñoä phoøng vaø nhieät ñoä maùt. 3.3.12 Taïo 2 cheá phaåm A.xylinum BC16 vaø A.xylinum BC16S1 . ÖÙng duïng cheá phaåm Acetobacter xylinum ñeå leân men BC Vôùi caùc thoâng soá ñaõ ñöôïc xaùc ñònh treân ñaây, söû duïng hai chuûng A.xylinum BC16 vaø A.xylinum BC16S1, taïo hai cheá phaåm ñeå öùng duïng leân men beà maët vaø leân men chìm cellulose vi khuaån. - Söû duïng cheá phaåm A.xylinum BC16 trong leân men beà maët cellulose vi khuaån. Quy moâ 100 lít/meû treân khay nhöïa (25 x 30 cm). • Xaùc ñònh noàng ñoä cheá phaåm söû duïng trong leân men. Quy ñoåi maät ñoä teá baøo vi khuaån töông ñöông giöõa dòch gioáng loûng vaø cheá phaåm vi khuaån coá ñònh. Khaûo saùt 3 möùc noàng ñoä cheá phaåm laø 1g/ l, 2g/ l, 3g/ l moâi tröôøng leân men. • Xaùc ñònh soá laàn taùi söû duïng cheá phaåm vaø so vôùi ñoái chöùng. - Söû duïng cheá phaåm A.xylinum BC16S1 trong leân men chìm cellulose. Quy moâ 75 lít/ meû vôùi phöông thöùc thoåi khí-hoài löu. • Xaùc ñònh noàng ñoä cheá phaåm söû duïng trong leân men. 51 Quy ñoåi maät ñoä teá baøo vi khuaån töông ñöông giöõa dòch gioáng loûng vaø cheá phaåm vi khuaån coá ñònh. Khaûo saùt 4 möùc noàng ñoä cheá phaåm laø 1g/ l, 2g/ l, 3g/ l, 4g/ l moâi tröôøng leân men. • Xaùc ñònh soá laàn taùi söû duïng cheá phaåm vaø so vôùi ñoái chöùng. 3.3.13 Coá ñònh vi khuaån Lactic vaø öùng duïng leân men söõa chua Ñeå taïo cheá phaåm vi khuaån Lactic coá ñònh boû qua giai ñoaïn tìm hieåu veà ñoái töôïng vi khuaån coá ñònh (vi khuaån Lactic), chuùng toâi söû duïng tröïc tieáp men LACBUL ñoâng khoâ, goàm heä vi khuaån Lactic: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, nguoàn goác Haøn Quoác (coâng ty Ildong Pharm saûn xuaát), maät ñoä 109-1010 teá baøo/g men. Men LACBUL ñöôïc duøng ñeå saûn xuaát söõa chua vôùi noàng ñoä söû duïng trung bình laø 1g men LACBUL / lít söõa. Caùc böôùc coá ñònh toùm taét nhö sau: - Vi khuaån coá ñònh: heä vi khuaån Lactic coù trong cheá phaåm LACBUL ñaõ ñöôïc hoaït hoùa treân moâi tröôøng söõa ( thôøi gian hoaït hoùa 2 h, nhieät ñoä laø 45oC, ñöôïc xaùc ñònh laø heä vi khuaån Lactic baét ñaàu chuyeån qua pha log). - Chaát neàn ( matrix): BC xöû lyù vaø voâ truøng. - Chuyeån BC ñaõ xöû lyù, dòch sinh khoái gioáng vi khuaån vaøo bình ( 100 gam BC ñaõ xöû lyù coù khaû naêng haáp thuï vaø tröông nôû hoøan toaøn 0,5 lít dòch coù maät ñoä gioáng vi khuaån Lactic khoaûng 1,27.109 teá baøo/ ml ). Söû duïng bình coù dung tích 1 lít. - Phöông phaùp haáp thuï: Laéc 250 v/ phuùt, thôøi gian laø 30 phuùt cho tröông nôû hoaøn toaøn chaát mang trong dòch hoaït hoùa. - Thôøi gian uû sau haáp thuï: 1 ngaøy, nhieät ñoä laø 45oC, ñieàu kieän yeám khí. Quy ñoåi maät ñoä teá baøo vi khuaån töông ñöông giöõa men LACBUL vaø cheá phaåm vi khuaån Lactic coá ñònh ñeå xaùc ñònh noàng ñoä cheá phaåm söû duïng trong leân men söõa chua. Moãi laàn taùi söû duïng, caùc chæ tieâu theo doõi trong quaù trình leân men : pH, 52 acid toång, tính chaát caûm quan vaø toång soá vi khuaån Lactic trong maãu söõa chua thaønh phaåm. So saùnh maãu thí nghieäm vôùi maãu ñoái chöùng. 3.3.14 Thaêm doø söû duïng sinh khoái Acetobacter xylinum laøm taùc nhaân keát dính ñeå taïo moät soá vaät lieäu coù giaù trò töø pheá thaûi noâng nghieäp Thu nhaän caùc cheá phaåm ñeå eùp dính : * Nuoâi caáy beà maët trong caùc khay nhöïa vôùi caùc ñieàu kieän nhö treân vôùi 2 caùch: - Cho caùc nguyeân lieäu vaøo moâi tröôøng ræ ñöôøng loûng cho ñaày khay, sau vaøi ngaøy lôùp maøng BC hình thaønh treân beà maët seõ naâng khoái nguyeân lieäu ñeå hình thaønh lôùp maøng ôû giöõa khoái nguyeân lieäu hoaëc coù theå ñaûo laät beà maët döôùi leân treân ñeå taïo maøng BC töø phía döôùi vaø nhaän cheá phaåm coù loõi vaø 2 maët BC ñeå eùp. - Cho khoái nguyeân lieäu (buïi xô döøa, baõ mía,…) ngaám vaøo moâi tröôøng ræ ñöôøng toái öu roài nhaác cao leân ñeå thoâng khí cho vi khuaån moïc ôû saâu trong khoái nguyeân lieäu. Thöïc chaát ñaây laø kieåu leân men baùn raén coù keát hôïp boå sung dinh döôõng, nhaèm taän duïng khoâng khí töï nhieân khoâng duøng maùy suïc khí. * Troän BC nguyeân chaát nghieàn nhoû vôùi nguyeân lieäu hoaëc hoãn hôïp nhieàu loaïi (buïi xô döøa, baõ mía,…) ñeå keát dính. Thu saûn phaåm keát dính, ñeå khoâ töï nhieân, eùp saûn phaåm baèng maùy eùp thuûy löïc, vôùi löïc eùp thaêm doø laø F = 167 kg/ cm2 vaø saáy khoâ ñeán troïng löôïng khoâng ñoåi. Caùc chæ tieâu theo doõi: Ñoä beàn neùn (kg/cm2), Ñoä beàn keùo ( kg/cm2), Vò trí ñöùt caùch taâm (cm), Goùc uoán cong (ñoä), Tæ leä ngaäm nöôùc (%), Ñoä beàn neùn khi ngaäm nöôùc (kg/ cm2), Ñoä beàn keùo khi ngaäm nöôùc (kg/ cm2) 3.3.15 Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu Xöû lyù thoáng keâ baèng phaàn meàm Microsoft Excel vaø MSTATC ( Russel D. Freed). ._.