Sản xuất chitin-Chitosan từ vỏ tôm

CHÖÔNG I MÔÛ ÑAÀU 1.1. Ñaët vaán ñeà Chitin laø moät polysaccharide ñöùng thöù hai veà löôïng trong töï nhieân chæ sau cellulose. Chitin vaø caùc saûn phaåm cuûa chuùng hieän nay ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc nhö: y hoïc, saûn xuaát myõ phaåm, baûo quaûn noâng saûn, xöû lyù moâi tröôøng. Ngoaøi ra khi ta khöû acetylene trong hôïp chaát chitin seõ taïo thaønh chitosan laø ñôn vò cao phaân töû cuûa glucosamine, laø moät chaát coù öùng duïng roäng raõi trong caùc ngaønh coâng nghieäp nheï, thöïc phaåm, noâng nghieäp. Vieäc nghieân cöùu vaø taùch chieát chitin töø voû giaùp xaùc ñaõ ñöôïc thöïc hieän hôn moät theá kyû nay. Hieän nay, toâm laø maët haøng cheá bieán chuû löïc cuûa ngaønh thuyû saûn Vieät Nam, chuû yeáu laø toâm ñoâng laïnh. Theo baùo caùo cuûa Boä thuyû saûn, saûn löôïng toâm naêm 2003 laø 193973 taán, tuyø thuoäc vaøo saûn phaåm cheá bieán vaø saûn phaåm cuoái cuøng, pheá lieäu toâm coù theå leân tôùi 40 – 70% khoái löôïng nguyeân lieäu. Töông öùng vôùi saûn löôïng toâm haøng naêm seõ coù khoái löôïng pheá lieäu khoång loà goàm ñaàu vaø voû toâm ñöôïc taïo ra. Hieän nay, ôû nöôùc ta nguoàn pheá lieäu ñaàu vaø voû toâm chöa ñöôïc taän duïng treân quy moâ lôùn. Tình traïng treân ñaët ra yeâu caàu caáp baùch cho caùc nhaø khoa hoïc coâng ngheä, cho ngaønh thuyû saûn laø phaûi söû duïng hôïp lyù vaø hieäu quaû löôïng pheá lieäu toâm raát lôùn do caùc nhaø maùy cheá bieán thuyû saûn taïo ra haøng ngaøy ñeå saûn xuaát ra saûn phaåm coù giaù trò cao, chitin – chitosan. Tuy nhieân, quy trình saûn xuaát chitin ñöôïc söû duïng phoå bieán hieän nay laø theo phöông phaùp hoaù hoïc, protein trong ñaàu vaø voû toâm ñöôïc loaïi boû baèng caùch xöû lyù vôùi NaOH. Nhö vaäy, vöøa toán moät löôïng hoaù chaát vöøa coù haïi cho moâi tröôøng, hôn nöõa con ñöôøng xöû lyù hoaù hoïc laøm giaûm chaát löôïng saûn phaåm chitosan vì phaûn öùng vôùi NaOH laøm giaûm ñi ñoä nhôùt cuûa chitosan. Moät trong nhöõng höôùng giaûi quyeát vaán ñeà treân laø söû duïng cheá phaåm enzyme thuyû phaân protein trong voû toâm ñeå saûn xuaát ra saûn phaåm chitin coù chaát löôïng cao vaø vöøa giaûi quyeát ñöôïc vaán ñeà moâi tröôøng. Nhieàu loaïi enzyme protease ñaõ ñöôïc trích ly töø töï nhieân vaø ñöôïc öùng duïng roäng raõi nhö: protease töø noäi taïng toâm caù, bromelaine töø döùa, papain töø ñu ñuû, protease töø vi sinh vaät ..vv. Vieäc söû duïng enzyme vaøo saûn xuaát coâng nghieäp khoâng nhöõng ñem laïi hieäu quaû cao maø coøn coù theå laøm giaûm chi phí saûn xuaát baèng caùch taùi söû duïng laïi enzyme. Ñeå coù theå taùi söû duïng ñöôïc enzyme ta coù theå tieán haønh coá ñònh enzyme vaøo moät chaát mang baèng phöông phaùp nhoát vaø chitosan laø moät chaát ñöôïc xem laø coù nhieàu trieån voïng trong vieäc coá ñònh enzyme vaø teá baøo. Vôùùi mong muoán goùp phaàn giaûi quyeát nhöõng yeâu caàu treân, chuùng toâi ñaõ thöïc hieän ñeà taøi “saûn xuaát chitin – chitosan töø voû toâm” 1.2. Muïc ñích khoaù luaän Saûn xuaát chitin – chitosan baèng caùch söû duïng enzyme protease thu ñöôïc töø nuoâi caáy naám moác Aspergillus oryzae baèng caùc nguyeân lieäu reû tieàn, ñoàng thôøi nghieân cöùu öùng duïng chitosan thu ñöôïc laøm giaù theå coá ñònh enzyme 1.3. Noäi dung Thu nhaän enzyme protease töø Aspergillus oryzae. Khaûo saùt quaù trình keát tuûa cuûa enzyme protease. Söû duïng enzyme protease trong saûn xuaát chitin – chitosan töø voû toâm. Khaûo saùt quaù trình thuyû phaân. Öùng duïng chitosan laøm giaù theå coá ñònh enzyme protease. CHÖÔNG II TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 2.1 Nguoàn goác vaø söï toàn taïi cuûa chitin – chitosan trong töï nhieân Chitin – chitosan laø moät polysaccharide toàn taïi trong töï nhieân vôùi saûn löôïng raát lôùn ñöùng thöù hai sau cellulose. Trong töï nhieân chitin toàn taïi trong caû ñoäng vaät vaø thöïc vaät. Chitin – chitosan laø polysaccharide coù ñaïm khoâng ñoäc, coù khoái löôïng phaân töû lôùn. Caáu truùc cuûa chitin laø taäp hôïp caùc monosaccharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) lieân keát vôùi nhau bôûi caùc caàu noái glucozit vaø hình thaønh moät maïng caùc sôïi coù toå chöùc. Hôn nöõa chitin toàn taïi raát hieám ôû traïng thaùi töï do vaø haàu nhö luoân luoân noái bôûi caùc caàu noái ñaúng trò (coralente) vôùi caùc protein, CaCO3 vaø caùc hôïp chaát höõu cô khaùc. Veà maët lòch söû, chitin ñöôïc Braconnot phaùt hieän ñaàu tieân vaøo 1821, trong caën dòch chieát töø moät loaïi naám. OÂng ñaët teân cho chaát naøy laø “Fungine” ñeå ghi nhôù nguoàn goác cuûa noù. Naêm 1823 Odier phaân laäp moät chaát töø boï caùch cöùng maø oâng goïi laø chitin hay “chiton”, tieáng Hy Laïp coù nghóa laø voû giaùp, nhöng oâng khoâng phaùt hieän ra söï coù maët cuûa nitô trong ñoù. Cuoái cuøng caû Odier vaø Braconnot ñeàu ñi ñeán keát luaän chitin coù daïng coâng thöùc gioáng nhö cellulose. 2.1.1 Caáu truùc hoaù hoïc cuûa chitin Chitin coù caáu truùc tinh theå raát chaët cheõ vaø ñeàu ñaën. Baèng phöông phaùp nhieãu xaï tia X. ngöôøi ta coù theå chöùng minh ñöôïc chitin toàn taïi ôû 3 daïng caáu hình: α, β, γ- chitin. Caùc daïng naøy cuûa chitin chæ do söï saép xeáp khaùc nhau veà höôùng cuûa moãi maét xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong maïch. Coù theå bieåu dieãn moãi maét xích naøy baèng muõi teân chæ nhoùm –CH2OH, phaàn ñuoâi chæ nhoùm –NHCOCH3, thì caùc caáu truùc α, β, γ - chitin ñöôïc moâ taû nhö sau: α – chitin β- chitin γ – chitin α – chitin coù caáu truùc caùc maïch ñöôïc saép xeáp ngöôïc chieàu nhau ñeàu ñaën, neân ngoaøi lieân keát hydro trong moät lôùp vaø heä chuoãi, noù coøn coù lieân keát hydro giöõa caùc lôùp do caùc chuoãi thuoäc lôùp keà nhau neân raát beàn vöõng. Do caùc maét xích saép xeáp ñaûo chieàu, xen keõ thuaän lôïi veà maët khoâng gian vaø naêng löôïng. Ñaây cuõng laø daïng phoå bieán trong töï nhieân. β,γ- chitin da maét xích gheùp vôùi nhau theo kieåu song song (β- chitin ) vaø hai song song moät ngöôïc chieàu (γ- chitin ), giöõa caùc lôùp khoâng coù loaïi lieân keát hydro. Daïng β- chitin cuõng coù theå chuyeån sang daïng α – chitin nhôø quaù trình acetyl hoaù cho caáu truùc tinh theå beàn vöõng hôn. Qua nhieàu nghieân cöùu veà söï thuyû phaân chitin baèng enzyme hay acid HCl ñaäm ñaëc thì ngöôøi ta thaáy raèng chitin coù caáu truùc laø moät polymer ñöôïc taïo thaønh töø caùc ñôn vò N-acetyl-β-D-glucosamine lieân keát vôùi nhau bôûi lieân keát β- (1-4) glucozit. Coâng thöùc phaân töû: [C8H13O5N]n Phaân töû löôïng: Mchitin = (230.09)n Hình 1 Coâng thöùc caáu taïo cuûa chitin Teân goïi: poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose 2.1.2 Tính chaát cuûa chitin Chitin ôû theå raén vaø coù ñoä keát tinh cao do goác –NHCOCH3 ôû vò trí cacbon thöù hai, laøm taêng lieân keát hydro giöõa caùc maïch vaø trong maïch vôùi nhau Chitin laø moät polysaccharide beàn trong moâi tröôøng kieàm nhöng keùm beàn trong moâi tröôøng acid Chitin coù maøu traéng, khoâng tan trong nöôùc, trong acid loaõng, trong kieàm loaõng, caùc thuoác thöû Schweitzer vaø caùc dung moâi höõu cô nhö röôïu, este,. .. nhöng noù hoaø tan trong moät soá dung dòch nhö hydrochloride, acid ñaäm ñaëc (acid nitrit, formic, acid khan). Ñaëc bieät noù coøn hoaø tan trong dung dòch ñaëc noùng cuûa muoái thioxianat liti (LiSCN) vaø muoái thixianat canxi [Ca(SCN)2] taïo thaønh dung dòch keo Chitin oån ñònh vôùi caùc chaát oxy hoaù khöû nhö KMnO4, H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2, ... lôïi duïng tính chaát naøy ñeå khöû maøu chitin. Khi ñun noùng trong moâi tröôøng kieàm ñaäm ñaëc, chitin bò khöû bôûi goác acetyl taïo thaønh chitosan 2.1.3 Caáu truùc hoaù hoïc cuûa chitosan Trong caùc daãn xuaát cuûa chitin thì chitosan laø moät trong nhöõng daãn xuaát quan troïng vì noù coù hoaït tính sinh hoïc cao vaø coù nhieàu öùng duïng trong thöïc teá. Vieäc saûn xuaát chitosan töông ñoái ñôn giaûn, khoâng caàn dung moâi, hoaù chaát ñoäc haïi, ñaét tieàn. Chitosan thu ñöôïc baèng phaûn öùng deacetyl hoaù chitin, bieán ñoåi nhoùm N-acetyl thaønh nhoùm amin ôû vò trí C2. Do quaù trình khöû acetyl xaûy ra khoâng hoaøn toaøn neân ngöôøi ta qui öôùc neáu ñoä deacetyl hoaù (degree of deacetylation) DD > 50% thì goïi laø chitosan, neáu DD < 50% goïi laø chitin Chitosan coù caáu truùc tuyeán tính töø caùc ñôn vò 2-amino-2-deoxy-β-D-glucosamine lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát β-(1-4) glucozit. Coâng thöùc phaân töû chitosan [C6H11O4N]n Phaân töû löôïng: Mchitosan = (161.07)n Hình 2 Coâng thöùc caáu taïo cuûa chitosan Teân goïi khoa hoïc: poly(1-4)-amino-2-deoxy-β-D-glucose Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Qua caáu truùc cuûa chitin – chitosan ta thaáy chitin chæ coù moät nhoùm chöùc hoaït ñoäng laø –OH ( H ôû nhoùm hydroxyl baäc 1 linh ñoäng hôn H ôû nhoùm hydroxyl baäc 2 trong voøng 6 caïnh) coøn chitosan coù 2 nhoùm chöùc hoaït ñoäng laø –OH, -NH2, do ñoù chitosan deã daøng tham gia phaûn öùng hoaù hoïc hôn chitin. Trong thöïc teá chitin – chitosan ñan xen nhau, vì vaäy taïo ra nhieàu saûn phaåm ñoàng thôøi, vieäc taùch vaø phaân tích chuùng raát phöùc taïp. 2.1.4 Tính chaát cuûa chitosan Troïng löôïng phaân töû chitosan tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän saûn xuaát, thöôøng naèm trong khoaûng 10.000 – 1.000.000 Da vôùi möùc ñoä deacetyl hoaù thöôøng laø 70 – 90% Chitosan ôû theå raén, maøu traéng ngaø, khoâng muøi, khoâng vò, khoâng tan trong nöôùc, kieàm, aicd ñaäm ñaëc nhöng tan trong acid loaêng, tan toát trong dung dòch acid acetic loaõng (0.5 – 1.5%) taïo thaønh dung dòch keo, trong suoát. Lôïi duïng tính chaát naøy cuûa chitosan ñeå thöïc hieän coá ñònh enzyme baèng phöông phaùp nhoát Chitosan laø moät polyamine, noù ñöôïc xem nhö laø moät polymer cationic coù khaû naêng cho caùc ion kim loaïi naëng baùm dính vaøo caùc beà maët tích ñieän aâm taïo ra phöùc chaát vôùi kim loaïi vaø tuûa xuoáng, loaïi caùc ion kim loaïi naëng ra khoûi dung dòch Chitosan coù taùc duïng khaùng khuaån khaù toát, nhaát laø treân caùc khuaån gaây beänh nhö E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa vaø taùc duïng dieät naám nhaát laø naám Candida albicans Chitosan coù nhieät ñoä noùng chaûy laø 309 – 3110C Chitosan coù caáu truùc sieâu loã, deã taïo maøng, taïo haït, khaû naêng haáp phuï toát, coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh, thöôøng ñöôïc duøng coá ñònh enzyme qua caàu noái glutaradehyde. Chitosan phaûn öùng vôùi caùc acid ñaäm ñaëc taïo thaønh muoái khoù tan, taùc duïng vôùi iod vaø acid sulfuric thaønh phaûn öùng maøu tím, coù theå duøng trong phaân tích ñònh tính chitosan Ngoaøi caùc tính naêng treân cuûa chitosan, noù coøn ñöôïc xem laø nguoàn nguyeân lieäu voâ cuøng quyù giaù ñeå cho ra caùc daãn xuaát chitosan raát haáp daãn trong caùc lónh vöïc thöïc phaåm, döôïc phaåm, sinh hoïc vaø baûo veä moâi tröôøng 2.1.5 Nguoàn thu nhaän chitin Chitin coù maët ôû khaép nôi trong töï nhieân trong ñoâng vaät, thöïc vaät vaø caû vi sinh vaät Trong ñoäng vaät chitin laø moät thaønh phaàn quan troïng cuûa caùc voû moät soá ñoäng vaät khoâng xöông soáng nhö: coàn truøng, nhuyeãn theå, giaùp xaùc vaø giun troøn. Trong ñoäng vaät baäc cao monome cuûa chitin laø moät thaønh phaàn chuû yeáu trong moâ da noù giuùp cho söï taùi taïo vaø gaén lieàn caùc veát thöông ôû da. Trong thöïc vaät chitin coù ôû thaønh teá baøo naám hoï zygenmyctes, vaø caùc sinh khoái naám moác, moät soá loaøi taûo .. . Tuy nhieân treân thöïc teá voû toâm cua laïi chieám thaønh phaàn chitin khaù cao(14-35%). Vôùi giaù thaønh reõ neân haàu heát caùc cô sôû saûn xuaát chitin – chitosan ñeàu töø voû toâm. Vì lyù do giaûm thieåu oâ nhieãm moâi tröôøng (saûn xuaát chitin – chitosan chuû yeáu baèng phöông phaùp hoaù hoïc). Naâng cao chaát löôïng saûn phaåm, taän thu caùc pheá phaåm coù giaù trò (voû toâm töø nhaø maùy).. vv goùp phaàn giaûi quyeát oâ nhieãm maø coøn ñem laïi hieäu quaû kinh teá cao. Baûng 2.1: baûng bieåu dieãn thaønh phaàn hoaù hoïc trong ñaàu toâm Thaønh phaàn Aåm ñoä Ñaïm toaøn phaàn Protein thoâ Lipide Calci Phosphor Haøm löôïng 73.22 1.86 11.64 2.01 2.19 0.37 2.2 Phöông phaùp saûn xuaát chitin – chitosan Hieän nay saûn xuaát chitin – chitosan chuû yeáu baèng phöông phaùp hoaù hoïc vaø phaûi qua caùc quaù trình sau: Quaù trình khöû khoaùng Trong voû toâm thaønh phaàn chuû yeáu laø muoái CaCO3, MgCO3 vaø raát ít Ca3(PO4)2. neân ngöôøi ta thöôøng duøng caùc loaïi acid nhö HCL, H2SO4 .. ñeå khöû khoaùng. Khi khöû khoaùng, neáu duøng HCl thì cho hieäu quaû cao hôn. Neáu duøng H2SO4 seõ taïo muoái khoù tan neân ít söû duïng. Phaûn öùng cuûa HCl ñeå khöû khoaùng nhö sau: MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O. CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 Trong quaù trình röûa thì muoái Cl- taïo thaønh ñöôïc röûa troâi, noàng ñoä acid HCl coù aûnh höôûng lôùn ñeán chaát löôïng cuûa chitosan thaønh phaåm, ñoàng thôøi coù aûnh höôûng lôùn ñeán thôøi gian vaø hieäu quaû khöû khoaùng. Neán noàng ñoä HCl cao seõ ruùt ngaén ñöôïc thôøi gian khöû khoaùng nhöng seõ laøm caét maïch do coù hieän töôïng thuyû phaân caùc lieân keát β- (1-4) glucozit ñeå taïo ra caùc polymer coù troïng löôïng phaân töû trung bình thaáp, coù khi bò thuyû phaân trieät ñeå ñeán glucosamin. Ngöôïc laïi neáu noàng ñoä HCl quaù thaáp thì quaù trình khöû khoaùng seõ khoâng trieät ñeå vaø thôøi gian xöû lyù keùo daøi aûnh höôûng ñeán chaát löôïng saûn phaåm. Sau khi khöû khoaùng tieán haønh röûa trung tính, coâng ñoaïn naøy coù taùc duïng röûa troâi heát caùc muoái, acid dö tan trong nöôùc. Quaù trình röûa keát thuùc khi dòch röûa cho pH = 7. Quaù trình loaïi protein Sau khi coù voû toâm ñaõ loaïi khoaùng. Ta tieán haønh loaïi boû hoaøn toaøn protein baèng dung dòch NaOH 3%, protein bò kieàm thuyû phaân thaønh caùc amin töï do tan vaø ñöôïc loaïi ra theo quy trình röûa troâi. Löôïng NaOH 3% cho vaøo ñeán khi ngaäp toaøn boä voû toâm vaø kieåm tra pH = 11 -12 laø ñöôïc ñeå ñaûm baûo vieäc loaïi boû protein ñöôïc hoaøn toaøn. Ñun ôû nhieät ñoä 90 -950C trong 3.5- 4 giôø (trong quaù trình nung löu yù vaán ñeà traøo dung moâi do taïo boät nhieàu vaø muøi bay ra khoù chòu) saûn phaåm sau khi nung ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc thöôøng hoaëc nöôùc caát ñeán pH = 7. Tieáp ñoù chuùng toâi tieán haønh röûa trung tính, nhaèm muïc ñích röûa troâi heát caùc, muoái natri, caùc amin töï do vaø NaOH dö. Saáy khoâ ôû 600C thu ñöôïc chitin thoâ. c) Quaù trình taåy maøu (loaïi boû astaxanthin) chitin thoâ coù maøu hoàng nhaït do coøn saéc toá astaxanthin. Do chitin oån ñònh vôùi caùc chaát oxy hoaù nhö thuoác tím (KMnO4) oxy giaø (H2O2) nöôùc javen (NaOCl + NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3 .. .. lôïi duïng tính chaát naøy ta söû duïng KMnO4 vaø H2O2 ñeå khöû maøu cho chitin. d) Ñieàu cheá chitosan quaù trình ñieàu cheá chitin thaønh chitosan thöïc chaát laø quaù trình deacety hoaù chitin, chuyeån hoaù nhoùm –NHCOCH3 thaønh nhoùm NH2 vaø loaïi boû nhoùm –CH3CO, chuyeån hoaù thaønh muoái natri (CH3COONa. Ñeå thöïc hieän ñöôïc quaù trình deacetyl hoaù hoaøn toaøn, ngöôøi ta söû duïng NaOH ñaäm ñaëc 50% thôøi gian 4 giôø nhieät ñoä ôû 110 – 120C . ôû ñaây döïa vaøo tính chaát chitosan tan ñöôïc trong dung dòch acid loaõng taïo thaønh dung dòch keo trong suoát, trong khi chitin khoâng tan do ñoù ta coù theå sô boä kieåm tra möùc ñoä chuyeån hoaù chitin thaønh chitosan baèng caùch laáy moät ít saûn phaåm cho vaøo CH3COOH 1%. Neáu saûn phaåm tan taïo thaønh dung dòch keo trong suoát laø ñöôïc. Sau ñoù röûa trung tính vaø saáy khoâ, chitosan thu ñöôïc coù maøu traéng saùng. Quaù trình ñieàu cheá chitosan töû chitin cho hieäu suaát töông ñoái cao (60 -75%) 2.3 ÖÙng duïng cuûa chitin – chitosan a) Trong coâng nghieäp thöïc phaåm Chitosan duøng ñeå baûo quaûn hoa quaû vaø rau töôi, baûo quaûn thöïc phaåm töôi soáng. Laøm maøng moûng ñeå bao goùi baùnh keïo. Chitosan vaø muoái cuûa noù ñöôïc duøng nhö chaát tinh luyeän nöôùc eùp töø traùi caây nhö nöôùc taùo, caø roát, chaát naøy laøm thay theá caùc chaát cuõ nhö silicasol, gelatin, ... b) Trong myõ phaåm Chitosan duøng laøm chaát phuï gia, laøm kem boâi maët, thuoác laøm meàm da, laøm taêng khaû naêng hoaø hôïp sinh hoïc giöõa kem thuoác vaø da, caáu taïo thuoác ñònh hình toùc, kem boâi da loät maët, ... c) Trong y teá Chitosan duøng laøm chaát phuï gia raát toát cho kyõ ngheä baøo cheá döôïc phaåm (keo keát dính vieân, taù döôïc ñoän, chaát taïo nang meàm, ...) Chitosan laø chaát mang polymer sinh hoïc ñeå gaén thuoác baèng lieân keát cô hoïc hay hoaù hoïc nhaèm taïo ra thuoác polymer coù nhieàu taùc duïng môùi. Chitosan ñöôïc coi laø moät heä thoáng vaän taûi thuoác khaù lyù töôûng. Baûn thaân chitosan vaø caùc daãn xuaát cuûa noù ñöôïc duøng laøm thuoác chöõa beänh: thuoác haï cholesterol trong maùu, thuoác chöõa trò caùc veát thöông, veát boûng. Thuoác chöõa ñau daï daøy, thuoác choáng ñoâng tuï maùu, thuoác duøng taêng cöôøng mieãn dòch cô theå vaø khaû naêng choáng nhieãm HIV, ... d) Ngaønh y Chitosan laø vaät lieäu cho y khoa raát toát nhö: da nhaân taïo, moâ gheùp, chæ khaâu phaãu thuaät töï tieâu, kem chöõa boûng, thuoác chöõa laønh nöôùu sau khi nhoå raêng, .. e) Trong noâng nghieäp Chitosan ñöôïc duøng nhö laø moät thaønh phaàn chính trong thuoác phoøng tröø naám (ñaïo oân, khoâ vaèn, ..), duøng laøm thuoác kích thích sinh tröôûng cho caây luùa, caây coâng nghieäp, caây caûnh, caây aên quaû, .. f) Trong coâng ngheä hoaù hoïc Chitosan ñöôïc duøng ñeå xöû lyù nöôùc thaûi coâng nghieäp, coù khaû naêng taïo phöc vôùi caùc kim loaïi naëng ñoäc haïi, duøng ñeå loïc nöôùc saïch tieâu duøng g) Trong coâng ngheä sinh hoïc Chitosan ñöôïc duøng laøm chaát nang ñeå coá ñònh enzyme vaø caùc teá baøo 2.4 Tình hình nghieân cöùu saûn xuaát vaø öùng duïng trong thöïc teá cuûa chitin vaø chitosan ôû vieät nam vaø theá giôùi Tröôùc ñaây ngöôøi ta ñaõ thöû taùch chieát chitin töø thöïc vaät bieån nhöng nguoàn nguyeân lieäu khoâng ñuû ñeå ñaùp öùng nhu caàu saûn xuaát. Tröõ löôïng chitin phaàn lôùn coù nguoàn goác töø voû toâm cua. Trong moät thôøi gian caùc chaát pheá thaûi naøy khoâng ñöôïc thu hoài maø laïi thaûi ra ngoaøi gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Naêm 1977 Vieän kyõ thuaät Masachusetts (Myõ), khi tieán haønh xaùc ñònh giaù trò cuûa chitin vaø protein trong voû toâm, cua ñaõ cho thaáy vieäc thu hoài caùc chaát naøy coù lôïi neáu söû duïng trong coâng nghieäp. Phaàn protein thu ñöôïc seõ duøng ñeå cheá bieán thöùc aên gia suùc, coøn laïi chitin seõ ñöôïc duøng laøm nhö moät chaát khôûi ñaàu ñeå ñieàu cheá caùc daãn xuaát coù nhieàu öùng duïng trong lónh vöïc coâng nghieäp Vieäc nghieân cöùu chitin – chitosan vaø caùc öùng duïng cuûa chuùng trong saûn xuaát phuïc phuï ñôøi soáng laø moät höôùng nghieân cöùu töông ñoái môùi meû ôû nöôùc ta. Vaøo nhöõng naêm 1978 ñeán 1980 tröôøng Ñaïi hoïc thuûy saûn nha trang ñaõ coâng boá quy trình saûn xuaát chitin – chitosan cuûa kyõ sö Ñoã Minh Phuïng, nhö chöa coù öùng duïng cuï theå trong saûn xuaát. Gaàn ñaây tröôùc yeâu caàu xöû lyù pheá lieäu thuyû saûn ñoâng laïnh ñang ngaøy caøng caáp baùch, tröôùc nhöõng thoâng tin kyõ thuaät môùi veà chitin – chitosan cuõng nhö tieàm naêng thò tröôøng cuûa chuùng ñaõ thuùc ñaåy caùc nhaø khoa hoïc cuûa chuùng ta baét tay vaøo nghieân cöùu hoaøn thieän quy trình saûn xuaát chitin – chitosan ôû böôùc cao hôn, ñoàng thôøi nghieân cöùu caùc öùng duïng cuûa chuùng trong caùc lónh vöïc saûn xuaát coâng nghieäp. Hieän nay ôû Vieät Nam coù nhieàu cô sôû khoa hoïc ñang nghieân cöùu saûn xuaát chitin – chitosan nhö: Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm – TPHCM. Trung taâm nghieân cöùu polymer – Vieän Khoa Hoïc Vieät Nam, Vieän Hoaù thuoäc phaân Vieän Khoa Hoïc Vieät Nam taïi TPHCM, Trung taâm coâng ngheä vaø sinh hoïc Thuyû saûn - Vieän nghieân cöùu nuoâi troàng thuyû saûn 2. Ôû mieàn Baéc, Vieän Khoa Hoïc Vieät Nam ñaõ keát hôïp vôùi xí nghieäp thuyû saûn Haø Noäi saûn xuaát chitosan vaø öùng duïng trong lónh vöïc noâng nghieäp ôû ñoàng luùa Thaùi Bình vaø ñaõ thu ñöôïc moät soá keát quaû ñaùng kích leä. Ôû mieàn Nam Trung taâm coâng ngheä vaø sinh hoïc thuyû saûn phoái hôïp vôùi moät soá cô quan khaùc: Ñaïi Hoïc Y Döôïc TPHCM, phaân Vieän Khoa Hoïc Vieät Nam. Vieän Khoa Hoïc noâng nghieäp mieàn nam, .. . ñang nghieân cöùu saûn xuaát vaø öùng duïng chitin – chitosan trong lónh vöïc noâng nghieäp, y döôïc vaø myõ phaåm. Trong noâng nghieäp chitosan ñöôïc söû duïng ñeå baûo veä caùc haït gioáng nhaèm muïc ñích ngaên ngöøa söï taán coâng cuûa naám trong ñaát, ñoàng thôøi noù coøn coù taùc duïng coá ñònh phaân boùn, thuoác tröø saâu, taêng cöông khaû naêng naûy maàm cuûa haït Qua nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa chitosan vaø caùc nguyeân toá vi löôïng leân moät soá chæ tieâu sinh hoaù cuûa maï luùa ôû nhieät ñoä thaáp thì keát quaû nghieân cöùu cho thaáy chitosan vi löôïng laøm taêng dieäp luïc vaø haøm löôïng nitô; ñoàng thôøi haøm löôïng caùc enzyme amylase, catalase hay peroxidaza cuõng taêng leân. Ngaøy nay chitosan coøn ñöôïc duøng laøm nguyeân lieäu boå sung vaøo thöùc aên cho toâm, caù, cua ñeå kích thích sinh tröôûng. Nhöõng öùng duïng cuûa chitin – chitosan vaø nhöõng daãn xuaát cuûa chuùng ngaøy caøng phaùt trieån. Moät soá ñaõ ñöôïc öùng duïng nhö laø: chæ khaâu töï huyû, da nhaân taïo, thaáu kính chieát xuaát, vaø moät soá öùng duïng khaùc ñang ñöôïc nghieân cöùu nhö : taùc ñoäng kích thích mieãn dòch, choáng söï phaùt trieån cuûa khoái u, ñaëc tính laøm giaûm cholesterol maùu, trò boûng nhieät .. .. Da nhaân taïo coù nguoàn goác töø chitin, noù gioáng nhö moät taám vaûi vaø ñöôïc boïc oáp leân veát thöông chæ moät laàn ñeán khi khoûi. Da nhaân taïo bò phaân huyû sinh hoïc töø töø cho ñeán luùc hình thaønh lôùp bieåu bì môùi. Noù coù taùc duïng giaûm ñau, giuùp cho caùc veát seïo boûng phuïc hoài bieåu bì nhanh choùng. Tröôøng Ñaïi Hoïc Döôïc Haø Noäi, Ñaïi Hoïc Y Döôïc Haø Noäi, Trung taâm khoa hoïc töï nhieân vaø coâng ngheä quoác gia cuõng ñaõ cheá taïo thaønh coâng loaïi da nhaân taïo naøy vaø böôùc ñaàu öùng duïng hieäu quaû. Chitin – chitossan vaø caùc oligo cuûa noù coù ñaëc tính mieãn dòch do noù kích thích caùc teá baøo giöõ nhieäm vuï baûo veä mieãn dòch vôùi caùc teá baøo khoái u vaø caùc taùc nhaân gaây beänh. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây höôùng vaøo caùc oligo, N-acetyl-glucosamin vaø glucosamin, caùc chaát naøy coù moät soá tính chaát cuûa caùc polymer töông öùng nhöng laïi coù öu theá laø tan toát trong nöôùc do ñoù deã daøng ñöôïc haáp thuï. Hieän nay treân theá giôùi ñaõ thaønh coâng vieäc söû duïng chitosan laøm chaát mang ñeå coá ñònh enzyme vaø teá baøo. Enzyme coá ñònh ñaõ cho pheùp môû ra vieäc söû duïng roäng raõi enzyme trong coâng nghieäp, y hoïc vaø khoa hoïc phaân tích. Enzyme coá ñònh ñöôïc söû duïng laâu daøi, khoâng caàc thay ñoåi chaát xuùc taùc. Nhaát laø trong coâng ngheä laøm saïch nöôùc, laøm trong nöôc hoa quaû, söû duïng enzyme coá ñònh raát thuaän lôïi vaø ñaït hieäu quaû cao. Chitosan thoaû maõn yeâu caàu ñoái vôùi chaát mang coù phaân töû löôïng lôùn, beàn vöõng khoâng tan vaø oån ñònh vôùi caùc yeáu toâ hoaù hoïc. Do coù caáu truùc töông töï nhö cellulose neân chitosan ñöôïc nghieân cöùu boå sung vaøo nguyeân lieäu saån xuaát giaáy cuõng toát hôn. Trong saûn xuaát giaáy qua nghieân cöùu ngöôøi ta thaáy neáu boå sung 1% chitosan thì ñoä beàn cuûa giaáy taêng leân khi bò öôùt hay taêng ñoä neùt khi in. Coù theå thay hoà tinh boät baèng chitosan ñeå hoà vaûi, noù coù taùc duïng laøm tô sôïi beàn, mòn, boùng ñeïp, coá ñònh hình in, chòu ñöôïc acid hay kieàm nheï. Chitosan ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát kem choáng khoâ da do tính chaát cuûa chitosan laø coù theå coá ñònh deã daøng treân bieåu bì cuûa da nhôø caùc nhoùm –NH4+ . caùc nhoùm naøy lieân keát vôùi caùc teá baøo söøng hoaù cuûa da, nhaø vaäy caùc nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu söû duïng chitosan laøm caùc loaïi kem döôõng da choáng naéng. Nhôø khaû naêng laøm ñoâng tuï caùc theå raén lô löûng giaøu protein vaø nhôø khaû naêng dính toát caùc ion kim loaïi nhö Pb, Hg .. . do ñoù chitin ñöôïc söû duïng ñeå taåy loïc nguoàn nöôùc thaûi coâng nghieäp töø caùc nhaø maùy cheá bieán thöïc phaåm. Chitosan söû duïng ñeå choáng hieän töôïng maát nöôùc trong quaù trình laøm laïnh, laøm ñoâng thöïc phaåm. Do chitosan coù tính chaát dieät khuaån, do ñoù noù ñöôïc taïo thaønh maøng moûng ñeå bao goùi thöïc phaåm choáng aåm moác, choáng maát nöôùc. Ñaëc tính dieät khuaån cuûa chitosan ñöôïc theå hieän treân caùc maët sau: Khi tieáp xuùc vôùi thöïc phaåm chitin – chitosan seõ laáy ñi töø caùc vi sinh vaät naøy caùc ion thieát yeáu, ví duï nhö ion Cu2+. Nhö vaäy vi sinh vaät seõ bò cheát do söï maát caân baèng lieân quan ñeán caùc ion thieát yeáu. Ngaên chaën phaù hoaïi chöùc naêng maøng teá baøo. Gaây ra söï roø ræ caùc phaàn beân trong teá baøo. Nhö vaäy vieäc duøng chaát chitosan bao boïc quanh beà maët thöïc phaåm coù theå keùo daøi thôøi gian baûo quaûn, giaûm söï hö hoûng do khaû naêng khaùng naám, khaùng khuaån cuûa noù. 2.5 Moät soá quy trình saûn xuaát chitin vaø chitosan treân theá giôùi vaø ôû vieät nam Treân Theá Giôùi a) Quy trình thuyû nhieät Yamasaki vaø Nacamichi (nhaät baûn) Nguyeân lieäu laø voû cua ñaõ khoâ, saïch ñöôïc ñem khöû khoaùng baèng HCl 2N trong thôøi gian laø 1 giôø (taùc giaû cho raèng hieäu quaû khöû khoaùng coù theå ñaït ñöôïc 100%). Sau ñoù ñem röûa saïch vaø ñem laøm khoâ. Tieáp theo laø tieán haønh keát hôïp hai coâng ñoaïn khöû protein vaø deacetyl ñoàng thôøi trong dung dòch NaOH 15N ôû nhieät ñoä 1500C trong 1 giôø, keát quaû cho thaáy protein ñöôïc taùch ra trieät ñeå vaø ñoä deacetyl ñaït treân 70%. Sau thôøi gian 1 giôø ñem röûa saïch vaø laøm khoâ seõ thu ñöôïc chitosan thaønh phaåm. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø quy trình ñôn giaûn coâng ñoaïn, ruùt ngaén ñaùng keå thôøi gian saûn xuaát so vôùi caùc quy trình khaùc. Hoaù chaát söû duïng ít (HCl vaø NaOH), chitosan thu ñöôïc coù ñoä tinh thieát cao. Tuy nhieân cuõng coù nhöôïc ñieåm laø saûn phaåm chitosan thu ñöôïc coù ñoä nhôùt thaáp, tieâu toán nhieàu naêng löôïng cho caùc khaâu saûn xuaát. b) Quy trình saûn xuaát chitin cuûa Hackman Voû toâm huøm ñöôïc röûa saïch vaø saáy khoâ ôû nhieät ñoä 1000C tieáp theo ñöôïc khöû khoaùng baèng HCl 2N vôùi tyû leä w/v = 1/10 ôû nhieät ñoä phoøng, sau thôøi gian 5 giôø ñem röûa trung tính vaø saáy khoâ ôû 1000C vaø ñem xay nhoû. Ngaâm tieáp trong dung dòch HCl 2N vôùi tyû leä w/v=1/2.5 ôû nhieät ñoä phoøng. Sau 48 giôø ñem ly taâm thu phaàn baõ vaø ñem röûa trung tính. Ngaâm baõ boät ñaõ röûa trong dung dòch NaOH 1N vôùi tyû leä w/v=1/2.5 ôû nhieät ñoä 1000C, sau 42 giôø ñem ly taâm thu phaàn baõ. Sau ñoù laïi tieáp tuïc ngaâm trong NaOH 1N vôùi tyû leä vaø nhieät ñoä treân, sau 12 giôø ñem ly taâm thu phaàn baõ. Tieáp theo ñoù röûa trung tính vaø ñem laøm saïch baèng caùch ly taâm vôùi caùc chaát theo thöù töï: nöôùc, etanol vaø ete. Sau ñoù laøm khoâ ta ñöôïc saûn phaåm daïng boät maøu kem. Vôùi quy trình naøy thì coù nhieàu coâng ñoaïn taêng khaû naêng khöû khoaùng, khöû protein song do coàng keành, chæ thích hôïp cho ñoái töôïng laø voû toâm huøm, toâm muõ ni vaø voû cua, thôøi gian thöïc caùc coâng ñoaïn keùo daøi, do ñoù quy trình Hackman chæ mang tính nghieân cöùu thí nghieäm, khoâng coù tính khaû thi neáu saûn xuaát ñaïi traø, quy trình môùi chæ döøng laïi ñeán saûn phaåm laø chitin. c) Quy trình saûn xuaát chitosan cuûa phaùp Nguyeân lieäu voû toâm saïch ñöôïc ñem ñi haáp chín, phôi khoâ, ta ñem ñi xay nhoû. Khöû protein baèng NaOH 3.5% vôùi tyû leä w/v=1/10, ôû nhieät ñoä 650C. sau 2 giôø vôùt ra röûa trung tính, tieáp ñoù ngaâm trong HCl 1N vôùi tyû leä w/v=1/10, ôû nhieät ñoä phoøng sau 2 giôø vôùt ra tieán haønh taåy caùc chaát maøu höõu cô baèng aceton vôùi tyû leä w/v=1/5, ôû nhieät ñoä phoøng sau 30 phuùt vôùt ra röûa saïch vaø taåy maøu laïi baèng nöôùc javen (NaOCl + NaCl) 0.135%, tyû leä w/v=1/10, ôû nhieät ñoä phoøng sau 6 phuùt vôùi ra röûa trung tính, thu ñöôïc chitin saïch. Sau ñoù tieán haønh deacetyl chitin baèng NaOH 40% vôùi tyû leä w/v=1/4, ôû nhieät ñoä 850C sau thôøi gian 4 giôø ñem röûa trung tính thu ñöôïc chitosan. Quy trình coù öu ñieåm laø thôøi gian saûn xuaát ngaén, saûn phaåm coù maøu saéc ñeïp, saïch do coù hai böôùc khöû saéc toá. Tuy nhieân NaOCl laø moät chaát oxy hoaù maïnh, aûnh höôûng ñeán maïch polymer, do ñoù ñoä nhôùt saûn phaåm giaûm roõ reät. Maët khaùc aceton coù giaù trò ñaét tieàn, toån thaát nhieàu, giaù thaønh saûn phaåm seõ cao. Chöa keå caùc yeáu toá trong an toaøn saûn xuaát, coâng ngheä naøy khoù aùp duïng trong ñieàu kieän saûn xuaát ôû nöôùc ta hieän nay. Phöông phaùp ñieàu cheá chitin cuûa Capozza Caân 149g nguyeân lieâu voû toâm saïch cho vaøo bình khuaáy vôùi moät maùy khuaáy, theâm töø töø 825ml acid HCl 2N vaøo bình, thöïc hieän phaûn öùng ôû 40C trong thôøi gian 48 giôø. Saûn phaåm sau quaù trình khöû khoaùng ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc ñeán pH = 7. xaùc ñònh haøm löôïng tro 0.4 -0.5%. sau ñoù saûn phaåm ñöôïc khuaáy ôû nhieät ñoä phoøng vôùi 1500ml acid fomic HCOOH 90%. Ñeå qua ñeâm. Hoãn hôïp ñöôïc loïc ly taâm laáy phaàn baõ vaø röûa laïi vôùi nöôùc nhieàu laàn cho ñeán khi pH = 7. saûn phaåm saïch sau ñoù ñöôïc ngaâm ñöôïc traùng röûa laïi trong ethanol 960 vaø ether, saáy khoâ ôû 400C döôùi aùp suaát giaûm. Khoái löôïng chitin thoâ saïch thu ñöôïc laø 66g hieäu suaát 44,3% Taïi Vieät Nam Quy trình saûn xuaát chitosan cuûa Ñoã Minh Phuïng Nguyeân lieäu laø voû toâm khoâ ñöôïc khöû khoaùng baèng HCl 6N vôùi tyû leä w/v=1/2.5. ôû nhieät ñoä phoøng, sau 48 giôø ñem röûa trung tính, tieáp theo ñun trong NaOH 8% vôùi tyû leä w/v=1/1.5, ôû nhieät ñoä 1000C, sau 2 giôø khöû protein roài ñem röûa trung tính. Tieán haønh taåy maøu baèng KMnO4 1% trong moâi tröôøng H2SO4 10% sau 1 giôø röûa saïch vaø khöû maøu phuï baèng Na2S2O3 1.5% trong 15 phuùt, vôùt ra röûa saïch thu ñöôïc chitin. Deacetyl chitin baèng NaOH 40% vôùi tyû leä w/v=1/1, ôû nhieät ñoä 800C sau 24 giôø ñem röûa saïch vaø cuoái cuøng thu ñöôïc chitosan. Saûn phaåm coù chaát löôïng khaù toát, chitin coù maøu traéng ñeïp. Song thôøi gian coøn daøi, söû duïng nhieàu chaát oxy hoùa deã laøm aûnh höôûng tôùi ñoä nhôùt cuûa saûn phaåm. Quy trình saûn xuaát chitosan ôû trung taâm cao phaân töû vieän khoa hoïc Vieät Nam Nguyeân lieäu laø voû gheï hay voû toâm saïch ñöôïc khöû khoaùng laàn 1 baèng HCl 4% ôû nhieät ñoä phoøng, sau thôøi gian 24 giôø ñem röûa trung tính ñeå laøm giaûm löôïng NaOH tieâu hao ôû coâng ñoaïn sau. Naáu trong NaOH 3% ôû nhieät ñoä 90 -950C sau 3 giôø ñem röûa trung tính, tieáp tuïc khöû khoaùng laàn hai baèng HCl ôû nhieät ñoä phoøng 90 -950C sau 3 giôø ñem rö._.ûa trung tính. Cuoái cuøng naáu trong NaOH 40%, röûa trung tính vaø saáy khoâ thu ñöôïc chitosan. Saûn phaåm chitosan saûn xuaát theo quy trình naøy coù maøu saéc khoâng ñeïp baèng saûn phaåm theo quy trình cuûa kyõ sö Ñoã Minh Phuïng, thôøi gian thöïc hieän quy trình keùo daøi, nhieàu coâng ñoaïn. Quy trình saûn xuaát chitin cuûa xí nghieäp thuûy saûn Haø Noäi Nguyeân lieäu laø voû toâm khoâ hoaëc töôi ñöôïc loaïi boû heát taïp chaát, xöû lyù taùch khoaùng laàn 1 trong HCl 4%, tyû leä w/v=1/2, ôû nhieät ñoä phoøng 24 giôø vôùt ra röûa trung tính. Sau ñoù duøng NaOH 2% ñeå taùch protein laàn 1 vôùi tyû leä w/v=1/2.8 ôû nhieät ñoä 90-950C, sau 3 giôø röûa vaø tieán haønh khöû khoaùng laàn 2 cuõng duøng HCl 4%, tyû leä w/v=1/2, ôû nhieät ñoä phoøng sau 24 giôø ñem röûa trung tính. Ñeå taùch protein laàn 2 cuõng duøng NaOH 2%, w/v=1/2.8, ôû nhieät ñoä 90-950C, sau 3 giôø röûa trung tính vaø tieán haønh khöû khoaùng laàn 3 cuõng gioáng nhö laàn khöû khoaùng treân. Saûn phaåm ñem laøm khoâ thu ñöôïc chitin. Chitin thu ñöôïc coù ñoä traéng cao maëc duø khoâng coù coâng ñoaïn taåy maøu. Nhöng nhöôïc ñieåm laø thôøi gian saûn xuaát cuûa quy trình keùo daøi, noàng ñoä hoaù chaát polymer trong moâi tröôøng acid daãn ñeán ñoä nhôùt giaûm. Quy trình saûn xuaát chitosan theo phöông phaùp sinh hoïc keát hôïp vôùi hoaù hoïc. Vieäc saûn xuaát chitosan theo phöông phaùp sinh hoïc keát hôïp hoaù hoïc cuõng thöïc hieän theo caùc böôùc: khöû khoaùng, khöû protein vaø deacetyl. Coâng ñoaïn khöû khoaùng hieäu quaû nhaát vaø duy nhaát chæ thöïc hieän baèng phöông phaùp hoaù hoïc. Coâng ñoaïn khöû protein vaø deacetyl coù theå thay theá baèng phöông phaùp sinh hoïc, ñoù laø khöû protein baèng enzyme protease vaø deacetyl baèng enzyme deacetylaza. Voû toâm ñöôïc ngaâm trong HCl 10% tyû leä w/v =1/10, ñeå ôû nhieät ñoä phoøng trong thôøi gian 5 giôø. Röûa saïch ñeán pH = 7.sau ñoù khöû protein baèng papain 13% tyû leä w/v =1/5, pH = 5-5,5, ôû nhieät ñoä 70 -800C trong thôøi gian 4 giôø. Röûa saïch, taåy maøu saáy khoâ ôû nhieät ñoä 600C thu ñöôïc chitin thoâ, traéng. Deacetyl chitin baèng NaOH 35%, tyû leä w/v =1/10, ôû 900C trong thôøi gian 5,5 giôø. Röûa saïch vaø saáy khoâ thu ñöôïc chitosan saïch. Chitosan thu ñöôïc coù maøu saéc traéng, ñeïp trong vaø meàm maïi. Quy trình papain cho saûn phaåm coù ñoä nhôùt cao hôn caùc quy trình khaùc. Tuy nhieân ñieàu kieän khoù khaên do vieäc tìm mua hoaëc saûn xuaát enzyem deacetylaza neân coâng ñoaïn deacetyl ñöôïc thöïc hieän baèng vieäc naáu NaOH ñaäm ñaëc. e) Quy trình saûn xuaát chitin – chitosan theo phöông phaùp sinh hoïc Trong vaøi naêm gaàn ñaây ñaõ coù nhieàu phaùt hieän môùi lieân quan ñeán saûn xuaát chitin – chitosan baèng caùch nuoâi caáy naám moùc Rhizopus azygosporus vaø naám moác Actinomucor taiwanensis vaø coâ laäp chitin – chitosan töø söï nuoâi caáy ñoù. Sau khi nuoâi caáy teá baøo naám moác ñöôïc thu nhaän töø canh tröôøng leân men vaø xöû lyù chuùng vôùi NaOH noàng ñoä 1N ôû 1210C thôøi gian 15 phuùt. Sau ñoù troän vôùi nöôùc caát ñem ñi ly taâm röûa laïi baèng nöôùc caát hoaëc coàn roài tieáp tuï xöû lyù vôùi dung dòch acetic 2% uû nhieät ñoä 950C trong 12 giôø. Keát quaû hình thaønh daïng buøn sau ñoù coâ laäp baèng caùch ly taâm. Phaàn tan ôû treân chöùa chitosan phaàn caën laéng xuoáng chöùa chitin. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø ít söû duïng hoaù chaát ít gaây oâ nhieãm moâi tröôøng saûn phaåm chaát löôïng cao. Nhöôïc ñieåm laø giaù thaønh cao quaù trình thöïc hieän phöùc taïp hôn caùc quy trình hoaù hoïc. 2.6 Nhu caàu söû duïng phöông phaùp sinh hoïc keát hôïp vôùi hoaù hoïc Qua caùc quy trình saûn xuaát treân ta ñaõ thaáy roõ phöông phaùp hoaù hoïc coøn nhieàu haïn cheá, tieâu toán nhieàu hoaù chaát gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Coøn phöông phaùp sinh hoïc giaù thaønh laïi cao, do ñoù ñieàu kieän caáp thieát laø phaûi coù moät quy trình saûn xuaát ít gaây oâ nhieãm vaø giaù thaønh hôïp lyù vì vaäy ta seõ thay theá quaù trình thuyû phaân protein baèng enyzme protease. 2.7 Caùc nguoàn enzyme protease a) Töø ñoäng vaät Protease ñoäng vaät thöôøng coù ôû tuî taïng, nieâm maïc ruoät non, nieâm maïc daï daøy, …. Pancreatin: goàm trypsin, chymotrypsin vaø moät soá enzyme khaùc coù ôû tuî taïng, chuùng ñöôïc tieát ra ngoaøi teá baøo cuøng vôùi dòch tuî. Pepsin coù ôû nieâm maïc daï daøy, ñöôïc tieát ra ngoaøi teá baøo cuøng vôùi dòch vò. Renin chæ coù ôû ngaên thöù tö trong daï daøy beâ non döôùi 5 thaùng tuoåi, laø enzyme ñoâng tuï söõa ñieån hình trong coâng ngheä saûn xuaát phomat. b) Töø thöïc vaät: enzyme protease töø thöïc vaät coù ôû caùc phaàn khaùc nhau cuûa caây nhö: thaân, laù vaø ñaëc bieät coù nhieàu ôû quaû. Enzyme naøy chuû yeáu coù ôû moät soá caây vuøng nhieät ñôùi nhö: ñu ñuû, döùa, caây sung, articho vaø ñaäu töông. Ví duï: Papain coù trong muû caây ñu ñuû, quaû ñu ñuû coøn xanh. Bromelin coù trong thaân caây thôm vaø quaû thôm xanh. Ficin coù trong muû caây sung, quaû sung, quaû vaû c) Töø vi sinh vaät Nhieàu loaïi vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp maïnh protease. Caùc enzyme naøy coù theå ôû trong teá baøo (protease noäi baøo) hoaëc ñöôïc tieát vaøo trong moâi tröôøng nuoâi caáy (protease ngoaïi baøo). Cho ñeán nay protease ngoaïi baøo ñöôïc nghieân cöùu kyõ hôn caùc protease noäi baøo. Moät soá protease ngoaïi baøo ñaõ saûn xuaát ôû quy moâ coâng nghieäp vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi trong nhieàu ngaønh kyõ ngheä khaùc nhau trong noâng nghieäp vaø y döôïc. Trong caùc loaïi protein, protein vi sinh vaät töø naám moác laø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát vì saûn löôïng lôùn, deã daøng thao thaùc, deã daøng nuoâi caáy chuû ñoäng ñöôïc nguoàn protein cho saûn xuaát. Enyzme coù hoaït tính cao .. vv . do ñoù chuùng toâi ñaõ choïn naám moác Aspergillus oryza vì enzyme protease töø naám moác coù hoaït tính cao, sinh saûn nhanh, deã daøng thu nhaän chuû ñoäng ñöôïc trong quaù trình saûn xuaát. 2.8 Ñaëc ñieåm chuûng naám moác Aspergillus oryzae a) Phaân loaïi Giôùi: Fungi Ngaønh: Ascomycota Ngaønh phuï: Pezizomycota Lôùp: Ascomycetes Boä: Plectascales Hoï: Aspergillusceae Gioáng: Aspergillus Loaøi: Aspergillus Oryzae b) Ñaëc ñieåm Hình thaùi Chuûng naám moác Aspergillus oryzae coù maøu xanh, sôïi naám phaùt trieån raát maïnh (chieàu ngang 5 – 7µm), coù vaùch ngaên chia sôïi naám thaønh nhieàu teá baøo (naám ña baøo), phaùt trieån thaønh töøng ñaùm goïi laø heä sôïi naám hay khuaån ty. Ñieàu kieän phaùt trieån Ñoä aåm moâi tröôøng toái öu cho söï hình thaønh baøo töû laø 45% Ñoä aåm moâi tröôøng toái öu cho söï hình thaønh enzyme laø 55 – 58% Ñoä aåm khoâng khí laø 85 – 95% pH moâi tröôøng laø 5.5 – 6.5 Nhieät ñoä nuoâi caáy laø 27 – 300C Hình 2.1 Aspergillus oryzae döôùi kính hieån vi Thu nhaän enzyme protenase töø phöông phaùp nuoâi caáy beà maët Ñeå thu nhaän cheá phaåm proteinase töø vi sinh vaät cöng nhö caùc enzyme khaùc coù theå duøng hai phöông phaùp nuoâi caáy: phöông phaùp nuoâi caáy beà maët vaø phöông phaùp nuoâi caáy veà saâu. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët thöôøng duøng ñeå nuoâi caáy naám moác, phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu thöôøng duøng ñoái vôùi vi khuaån. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët laø phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø phaùt trieån raát maïnh trong nhöõng naêm ñaàu theá kyû 20. löôïng enzyme ñöôïc taïo thaønh töø nuoâi caáy beà maët thöôøng cao hôn raát nhieàu so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy chìm. Nguyeân lieäu söû duïng nuoâi caáy beà maët thöôøng laø nhöõng nguyeân lieäu coù nguoàn goác veà thöïc vaät nhö caùm mì, caùm gaïo, gaïo, ngoâ, traáu .. khi nuoâi caáy vi sinh vaät ñeå thu nhaän protease ngöôøi ta cho theâm boät ñaäu xanh hoaëc boät ñaäu naønh nhö nhöng cô chaát caûm öùng cho söï toång hôïp cuûa protease. Quaù trình phaùt trieån cuûa naám moác trong moâi tröôøng baùn raén khi nuoâi baèng phöông phaùp beà maët traûi qua caùc giai ñoaïn sau: Giai ñoaïn 1: giai ñoaïn naøy keùo daøi 10 -14 giôø keå töø thôøi gian baét ñaàu nuoâi caáy. Ôû giai ñoaïn naøy coù nhöõng thay ñoåi sau: Nhieät ñoä taêng raát chaäm Sôïi naám baét ñaàu hình thaønh vaø coù maøu traéng hoaëc maøu söõa Thaønh phaàn dinh döôõng baét ñaàu coù söï thay ñoåi Khoái moâi tröôøng coøn rôøi raïc Enzyme môùi baét ñaàu hình thaønh Trong giai ñoaïn naøy phaûi ñaëc bieät quan taâm ñeán cheá ñoä nhieät ñoä. Tuyeät ñoái khoâng ñöôïc ñöa nhieät ñoä cao quaù 300C vì thôøi kyø ñaàu gioáng raát maãn caûm vôùi nhieät. Giai ñoaïn 2: giai ñoaïn naøy keùo daøi khoaûng 14 – 18 giôø. Trong giai ñoaïn naøy coù nhöõng thay ñoåi cô baûn sau: Toaøn boä baøo töû ñaõ phaùt trieån thaønh sôïi naám vaø sôïi naám baét ñaàu phaùt trieån raát maïnh. Caùc sôïi naám taïo ra nhöõng maïng sôïi chaèng chòt khaép trong caùc haït moâi tröôøng. Moâi tröôøng ñöôïc keát laïi khaù chaët Ñoä aåm moâi tröôøng giaûm daàn Nhieät ñoä moâi tröôøng taèng nhanh coù theå leân tôùi 40 – 450C Caùc chaát dinh döôõng baét ñaàu giaûm nhanh, do söï ñoàng hoaù maïnh cuûa naám sôïi Caùc loaïi enzyme ñöôïc hình thaønh vaø enzyme naøo coù chaát caûm öùng troäi hôn seõ taïo ra nhieàu hôn Löôïng oxy trong khoâng khí giaûm vaø CO2 seõ taêng daàn, do ñoù trong giai ñoaïn naøy caàn phaûi ñöôïc thoâng khí maïnh vaø nhieät ñoä coá gaéng duy trì trong khoaûng töø 29 -300C laø toát nhaát Giai ñoaïn 3: giai ñoaïn naøy keùo daøi khoaûng 10 -20 giôø. Ôû giai ñoaïn naøy coù moät soá thay ñoåi cô baûn sau: Quaù trình trao ñoåi chaát seõ yeáu daàn, do maät ñoä giaûm chaát dinh döôõng seõ chaäm laïi Nhieät ñoä cuûa khoái moâi tröôøng giaûm, do ñoù laøm löôïng khoâng khí moâi tröôøng xuoáng coøn 20 – 250C theå tích khoâng khí/theå tích phoøng nuoâi caáy/1 giôø. Nhieät ñoä duy trì ôû 300C. Trong giai ñoaïn naøy baøo töû ñöôïc hình thaønh nhieàu do ñoù löôïng enzyme giaûm. Chính vì theá vieäc xaùc ñònh thôøi ñieåm caàn thieát ñeå thu nhaän enzyme laø raát caàn thieát. Keát thuùc quaù trình nuoâi caáy ta thu nhaän ñöôïc cheá phaåm enzyme. Cheá phaåm naøy ñöôïc goïi laø cheá phaåm enzyme thoâ (vì ngoaøi thaønh phaàn enzyme ra, chuùng coøn chöùa sinh khoái vi sinh vaät, thaønh phaàn moâi tröôøng vaø nöôùc coù trong moâi tröôøng). 2.8.2 Thu nhaän vaø tuûa enzyme Coù nhieàu phöông phaùp khaùc nhau ñeå thu nhaän enzyme töø moâi tröôøng nuoâi caáy nhö: duøng dung dòch muoái loaõng hoaëc duøng nöôùc. Thoâng thöôøng, ñeå chieát enzyme ngöôøi ta duøng nöôùc vôùi tyû leä thích hôïp cho moâi tröôøng nuoâi caáy vaøo, khaáy ñeàu trong thôøi gian nhaát ñònh, loaïi boû caën, laáy dòch trong chöùa enzyme hoaø tan. Ñeå tuûa enzyme cuõng coù nhieàu phöông phaùp: Tuûa baèng muoái sunphat ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau. Phöông phaùp naøy reû tieàn do duøng caùc muoái thoâng duïng nhö: Na2SO4, (NH4)2SO4, khoâng laøm bieán tính protein, loaïi boû deã daøng baèng phöông phaùp Dialis (quaù trình thaåm tích). Tuy nhieân, chuùng laïi cho keát quaû tuûa khoâng cao, khi chaïy saéc kyù phaûi loaïi muoái tröôùc, phaûi söû duïng nhieàu noàng ñoä muoái khaùc nhau. Tuûa baèng dung moâi höõu cô nhö: Acetone, isopropanol, ethanol (ñöôïc duøng nhieàu nhaát). Öu ñieåm cuûa phöông phaùp laø cho keát quaû toát hôn so vôùi tuûa baèng muoái, khoâng caàn loaïi muoái tröôùc khi chaïy saéc kyù, caùch tieán haønh ñôn giaûn. Nhö khi tuûa phaûi thöïc hieän trong ñieàu kieän laïnh vò neáu ôû nhieät ñoä thöôøng seõ laøm bieán tính protein, löông dung moâi caàn duøng töông ñoái nhieàu. Tuûa baèng ñaúng ñieän: taïi ñieåm ñaúng ñieän, protein bin maát ñieän tích neân gaây tuûa, phöông phaùp naøy cho keát quaû raát cao, tuy nhieân caùch tieán haønh phöùc taïp vaø thöôøng phaûi keát hôïp vôùi phöông phaùp tuûa baèng dung moâi höõu cô. Tuûa baèng loaïi polymer nhö: Polyacrylic acid, polysaccaride, polyphosphate. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp coù theå tieán haønh ôû nhieät ñoä thöôøng, deã thu hoài polymer, hieäu suaát taïo keát tuûa cao. Chi phí cho phöông phaùp naøy cao. Tuûa baèng chaát ña ñieän phaân: thöôøng duøng polyethylene glycol coù phaân töû löôïng 6000 vaø 20.000. Coù theå söû duïng vôùi löôïng chaát naøy raát nhoû, hieäu suaát taïo keát tuûa cao. Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø raát ñaéc tieàn vaø deã gaây bieán tính protein. 2.8.3 Tinh saïch enzyme Ñeå tinh saïch enzyme, ngöôøi ta thöôøng duøng caùc kyõ thuaät saéc kyù. Ñaây laø phöông phaùp taùch lieân tuïc töøng vi phaân cuûa moät hoãn hôïp chaát do söï phaân boá khoâng ñoàng ñeàu giöõa phase tónh vaø phase ñoäng khi cho phase ñoäng di chuyeån xuyeân qua phase tónh. Döïa vaøo cô cheá cuûa quaù trình phaân taùch, coù nhieàu loaïi saéc kyù: Ñaëc tính Kyõ thuaät Kích thöôùc Loïc gel hay GF (gel filtration), coøn goïi laø phaân taùch theo kích thöôùc Ñieän tích Saéc kyù trao ñoåi ion hay IEC (ion exchange chromatography) Kî nöôùc Saéc kyù töông taùc kî nöôùc hay HIC (hydroâphbic iteraction chromatography) Saéc kyù ñaûo phase hay RPC (reversed phase chromatography) Nhaän bieát sinh hoïc (tính ñaëc hieäu cuûa ligand) Saéc kyù aùi löïc hay AC (afftinity chromatography) Loïc gel laø kyõ thuaät ñôn giaûn nhaát trong caùc loaïi saéc kyù, phaân taùch caùc phaân töû döïa treân söï khaùc bieät veà kích thöôùc. Kyõ thuaät naøy coù theå aùp duïng theo hai caùch: a) phaân taùch nhoùm (group seperations): caùc thaønh phaàn cuûa moät maãu ñöôïc phaân taùch thaønh hai nhoùm chính theo phaïm vi kích thöôùc. Söï phaân taùch nhoùm ñöôïc söû duïng ñeå loaïi caùc phaân töû lôùn hoaëc caùc taïp chaát nhoû, ñeå loaïi muoái hoaëc trao ñoåi ñieän. b) phaân ñoaïn caùc phaân töû sinh hoïc vôùi toác ñoä phaân giaûi cao (high resolutiion frationation of biomolecules): duøng ñeå phaân taùch caùc monomer ra khoûi khoái hoãn hôïp, xaùc ñònh troïng löôïng phaân töû hoaëc phaân tích söï phaân boá theo troïng löôïng phaân töû. Saéc kyù loïc gel cuõng duøng ñeå thöïc hieän vieäc gaáp cuoän laïi caùc protein bieán tính deã daøng hôn baèng vieäc kieåm soaùt caån thaän söï thay ñoåi ñieàu kieän cuûa dung dòch ñeäm Saéc kyù loïc gel khaù phuø hôïp cho caùc phaân töû sinh hoïc maãn caûm vôùi söï thay ñoåi cuûa pH, noàng ñoä ion kim loaïi hoaëc caùc co – factor vaø caùc ñieàu kieän khaéc nghieät. Söï phaân taùch coù theå ñöôïc thöïc hieän khi coù maët caùc ion hoaëc caùc co – factor ôû cöôøng ñoä cao hoaëc thaáp, ôû 370C hoaëc phoøng laïnh theo yeâu caàu thí nghieäm. Protein tinh saïch coù theå ñöôïc thu nhaän trong baát kyø loaïi dung dòch ñeäm naøo. Ñeå phaân taùch protein baèng saéc kyù loïc gel, moâi tröôøng gel ñöôïc nhoài trong coät ñeå taïo neàn nhoài. Ñaây laø chaùt neàn coù loã ôû daïng haït hình caàu, coù tính oån ñònh veà vaät lyù vaø hoùa hoïc, coù tính trô. Neàn nhoài ñöôïc caân baèng bôûi dung dòch ñeäm, dung dòch naøy laøm ñaày caùc loã cuûa chaát neàn vaø khoaûng khoâng giöõa caùc haït. Chaát loûng beân trong caùc loã ñoâi khi ñöôïc xem nhö phase tónh vaø chaát loûng naøy ôû traïng thaùi caân baèng vôùi chaát loûng ôû beân trong caùc haït, ñöôïc xem nhö phase ñoäng. Trong quaù trình phaân taùch vaø giaûi haáp thuï chæ duøng moät loaïi ñeäm. Böôùc röûa giaûi duøng loaïi ñeäm ñang chaïy vaø tieán haønh ôû thôøi ñieåm keát thuùc quaù trình phaân taùch cho vieäc loaïi boû nhöõng phaân töû coøn löu laïi trong coät deã daøng hôn vaø ñeå chuaån bò coät cho laàn chaïy keá tieáp. 2.9 Giôùi thieäu veà söï coá ñònh enzyme 2.9.1 Ñònh nghóa Enzyme coá ñònh hay enzyme khoâng hoaø tan laø nhöõng enzyme ñöôïc ñöa vaøo nhöõng pha rieâng reõ, pha naøy ñöôïc taùch rieâng vôùi pha dung dòch töï do. Pha enzyme khoâng hoaø tan trong nöôùc vaø ñöôïc gaén vôùi nhöõng polymer öu nöôùc coù troïng löôïng phaân töû lôùn. Caùc enzyme hoaø tan ñöôïc gaén vôùi caùc polymer (chaát mang) baèng nhieàu kyõ thuaät khaùc nhau, nhôø quaù trình gaén naøy maø enzyme chuyeån töø traïng thaùi hoaø tan sang traïng thaùi khoâng hoaø tan. 2.9.2 Tính chaát cuûa enzyme coá ñònh Khi gaén enzyme vaøo moät chaát mang, enzyme naøy coù nhöõng ñaëc ñieåm sau: Hoaït tính cuûa enzyme khoâng hoaø tan thöôøng nhoû hôn hoaït tính cuûa enzyme hoaø tan cuøng loaïi, nguyeân nhaân do: Do aûnh höôûng cuûa ñieän tích cuûa chaát mang. Khi gaén enzyme vaøo chaát mang coù ñieän tích khaùc vôùi ñieän tích cuûa enzyme, caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme coù söï thay ñoåi ôû möùc ñoä nhaát ñònh. Do ñoù söï töông taùc cuûa enzyme vaø cô chaát chaäm laïi, phaûn öùng xaûy ra yeáu hôn. Möùc ñoä giaûm hoaït tính cuûa enzyme phuï thuoäc vaøo möùc ñoä thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme khi gaén chuùng vaøo chaát mang. Do enzyme bò nhoát vaøo moät gel. Khi enzyme bò nhoát trong gel naøo ñoù, gel seõ bao laáy toaøn boä phaân töû enzyme. Do ñoù, söï tieáp xuùc giöõa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme vôùi cô chaát gaëp khoù khaên hôn so vôùi söï tieáp xuùc giöõa cô chaát vôùi enzyme töï do. Enzyme khoâng hoaø tan hoaøn toaøn tuaân theo ñònh luaät Michealis – Menten. Tuy nhieân trong phaûn öùng giöõa cô chaát vôùi enzyme khoâng hoaø tan coù nhöõng sai khaùc nhaát ñònh: Coù theå xaûy ra hieän töôïng caïnh tranh cô chaát vôi enzyme vaø chaát mang. Hieän töôïng caûn trôû söï khuyeách taùn cô chaát vaø caùc saûn phaåm cuûa phaûn öùng laøm giaûm toác ñoä phaûn öùng. Enzyme khoâng hoaø tan coù tính beàn nhieät hôn enzyme hoaø tan cuøng loaïi vì chuùng ñöôïc baûo veä bôûi chaát mang. Enzyme khoâng hoaø tan coù xu höôùng chuyeån dòch pH toái öu sang kieàm hoaëc acid so vôùi pH toái öu cuûa enzyme hoaø tan chöù khoâng truøng vôùi pH toái öu cuûa enzyme hoaø tan cuøng loaïi Enzyme khoâng hoaø tan coù khaû naêng baûo quaûn toát hôn enzyme hoaø tan cuøng loaïi. Enzyme khoâng hoaø tan coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn. Trong khi ñoù enzyme hoaø tan chæ coù theå söû duïng moät laàn. Ñaëc ñieåm naøy raát coù yù nghóa veà kinh teá khi ta tieán haønh caùc phaûn öùng theo quy moâ coâng nghieäp. 2.9.3 Vaät lieäu coá ñònh Nhöõng yeâu caàu chung cuûa moät chaát mang yù töôûng moät chaát mang lyù töôûng caàn coù nhöõng tính chaát sau: Giaù thaønh reõ, ñieàu naøy coù lieân quan ñeán hieäu quaû kinh teá cuûa quy trình coâng ngheä. Tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh. Nhö vaäy thì chaát mang môùi chòu ñöôïc söï taùc ñoäng töø moâi tröôøng beân ngoaøi nhö söï khuaáy troän, aùp löïc trong caùc quy trình saûn xuaát. Veà maët hoaù hoïc, chaát mang phaûi beàn vöõng khoâng tan trong moâi tröôøng phaûn öùng. Chaát mang khoâng ñöôïc laøm maát hoaït tính cuûa enzyme. Chaát mang khoâng ñöôïc gaây ra nhöõng phaûn öùng haáp phuï khoâng ñaëc hieäu. Chaát mang phaûi coù tính khaùng khuaån cao, beàn vöõng vôùi söï taán coâng cuûa vi sinh vaät. Chaát mang phaûi coù ñoä tröông nôû toát, coù dieän tích beà maët tieáp xuùc lôùn. Tính chaát naøy cuûa chaát mang vöøa taêng khaû naêng coá ñònh enzyme vöøa taêng khaû naêng tieáp xuùc cuûa cô chaát vôùi enzyme, nhôø ñoù laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø soá laàn taùi söû duïng. Chaát mang coù theå coù caáu truùc loã xoáp, sieâu loã, coù theå ôû daïng haït, daïng maøng, daïng phim moûng. Phaân loaïi chaát mang Taát caû caùc chaát mang duøng trong coá ñònh enzyme ñöôïc chia laøm hai nhoùm: Chaát mang laø polymer höõu cô, goàm hai nhoùm: Chaát mang laø caùc polymer töï nhieân: Chaát mang polysaccharide: laø nhoùm chaát mang ñang thònh haønh vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát hieän nay, ñoù laø cellulose, agarose, dextran, sephadex vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng. Agarose laø vaät lieäu oån ñònh, ñoàng nhaát vaø deã daøng taïo haït. Tuy nhieân do vaán ñeà giaù caû neân chæ ñöôïc söû duïng chuû yeáu trong nghieân cöùu vaø vì muïc ñích y hoïc Cellulose vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng nhö CM – cellulose, DEAE – cellulose coù tính chaát cô lyù khaù toát, giaù reõ nhöng laïi khoâng ñoàng nhaát vaø oån ñònh neân chæ ñöôïc söû duïng ôû daïng sôïi vaø vi haït. Alginate, carragenan laø hai vaät lieäu khaù môùi meû. Caùc vaät lieäu naøy taïo gel trong dung dòch CaCl2 duøng ñeå nhoát teá baøo, enzyme. Tuy nhieân gel cuûa hai loaïi vaät lieäu naøy ñeàu khoâng oån ñònh trong moâi tröôøng coù phosphate. Tinh boät laø vaät lieäu raát phong phuù vaø reû tieàn. Töø laâu, tinh boät duøng ñeå ñoùng gaïch, diethanolamin tinh boät ñaõ ñöôïc duøng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö laø lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase, .. . tuy nhieân, coù nhöôïc ñieåm laø ñoä tröông nôû coøn haïn cheá vaø thieáu caùc nhoùm chöùc naêng vì vaäy khaû naêng coá ñònh vaø hoaït tính cuûa enzyme coøn thaáp. Chitin vaø chitosan laø moät vaät lieäu polymer coù nhieàu trieån voïng trong coá ñònh enzyme vaø teá baøo. Chitin vaø chitosan coù caáu truùc sieâu loã, deã taïo maøng, taïo haït, khaû naêng haáp thuï toát, tính chaát cô lyù beàn vöõng, oån ñònh, thöôøng duøng ñeå coá ñònh enzyme qua caàu noái glutaraldehyte vaø sodiumtripolyphosphate, ferrocianur potassium, .. .. caû chitin vaø chitosan ñeàu coù moät nhöôïc ñieåm laø tính chaát kî nöôùc, ñoä tröông nôû keùm, dieän tích beà maët tieáp xuùc nhoû. Chaát mang laø proteine thöôøng duøng nhö gelatin, keratin, albumin. Vaät lieäu thuoäc nhoùm naøy thöôøng deã taïo maøng, taïo haït, coù nhoùm chöùc naêng laø NH2 vì vaäy thöôøng ñöôïc söû duïng nhoát enzyme trong khuoân gel vôùi taùc nhaân ñoùng maïch laø glutaraldehyte. Nhöng coù nhöôïc ñieåm laø thöôøng keùm beàn, deã nhieãm khuaån, hay gaây ra caùc phaûn öùng mieãn dòch vôùi cô theå khi söû duïng treân ngöôøi vaø ñoäng vaät. Chaát mang laø caùc polymer toång hôïp: Hieän nay coù raát nhieàu polymer toång hôïp ñöôïc söû duïng laøm chaát mang coá ñònh enzyme nhö polyacrylamide, polyester, polyvinyalcohol, polyvinyacetate, polyacrylic, polystyrene, polyethylene gheùp vôùi vinyl monomer, … öu ñieåm chung cuûa caùc polymer toång hôïp laø beàn, tính chaát cô lyù toát, hoaøn toaøn trô vôùi söï taán coâng cuûa vi khuaån, ñoä tröông nôû toát, moät soá polymer coù theå ñieàu chænh ñöôïc kích thöôùc sieâu loã, … tuy nhieân caùc polymer toång hôïp cuõng boäc loä nhöõng nhöôïc ñieåm nhaát ñònh nhö: moät soá coù giaù thaønh cao nhö polyacrylic, polyacrylamide; coù khaû naêng töông hôïp sinh hoïc keùm vaø moät nhöôïc ñieåm quan troïng nöõa laø do quaù beàn vöõng khoâng theå phaân huyû trong töï nhieân vì vaäy gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Chaát mang voâ cô: ngoaøi caùc polymer ñöôïc söû duïng laøm chaát mang coøn coù moät soá chaát mang voâ cô ñaõ ñöôïc xöû duïng thöông maïi nhö sôïi boâng thuyû tinh, silicum oxide, alluminium oxide, magnesium oxide. Ñaây laø nhöõng daïng oxide coù caáu truùc sieâu loã vaø coù khaû naêng haáp phuï toát. Nhöôïc ñieåm cuûa caùc vaät lieäu naøy laø tan trong dung dòch kieàm coù pH lôùn hôn 7.5 2.9.4 Phöông phaùp coá ñònh a) phaân loaïi Döïa vaøo baûn chaát caùc lieân keát taïo thaønh giöõa chaát mang vaø enzyme, ngöôøi ta chia thaønh hai phöông phaùp coá ñònh: phöông phaùp vaät lyù (lieân keát vaät lyù) vaø phöông phaùp hoaù hoïc (lieân keát ñoàng hoaù trò). Theo Scouten vaø Gerhartz, coù boán phöông phaùp coá ñònh enzyme laø: Phöông phaùp lieân keát enzyme vôùi vaät lieäu coá ñònh (carrier binding) Phöông phaùp haáp thuï vaät lyù (physical adsorption) Phöông phaùp nhoát (entrapment) Phöông phaùp khaâu maïch ( cross – linking). Phöông phaùp taïo enzyme khoâng hoaø tan Phöông phaùp nhoát Nhoát trong caáu truùc maïng gel: Ñaây laø phöông phaùp khaù ñôn giaûn, enzyme ít bò bieán ñoåi qua quaù trình coá ñònh. Ñeå goùi enzyme vaøo trong khuoân gel ngöôøi ta tieán haønh truøng hôïp hoaù caùc gel khi coù maët ñoàng thôøi enzyme. Sau khi hoaøn thaønh quaù trình truøng hôïp ngöôøi ta thu ñöôïc enzyme bò nhoát trong caùc loã gel. Gel ñaõ coù enzyme coù theå nghieân nhoû baèng caùch ñoàng hoaù hoaëc eùp qua raây coù loã nhôû roài ñem saáy ôû nhieät ñoä thaáp. Daãn xuaát enzyme loaïi naøy laàn ñaàu tieân do Bernfeld (1993) thu ñöôïc baèng caùch truøng hôïp acrylamine vôùi N, vaø nN – metylenbisacrylamine. Phöông phaùp naøy thöôøng duøng gaàn ñaây do chaát truøng hôïp thu ñöôïc deã taïo thaønh haït vaø tuyø vaøo ñieàu kieän tieán haønh maø gel coù ñoä xoáp khaùc nhau. Alginate vaø carragennan laáy töø rong bieån thöôøng coù khaû naêng taïo gel toát, thuaän lôïi ñeå goùi enzyme vaø teá baøo. Canxialginate laø moät trong nhöõng vaät lieäu thích hôïp cho phöông phaùp nhoát enzyme, hoãn hôïp enzyme vaø alginate ñöôïc nhoû xuoáng dung dòch CaCl2 ñeå taïo haït. Daïng caùc sôïi toång hôïp: Phöông phaùp naøy ñöôïc thöïc hieän baèng vieäc troän enzyme vaøo chaát mangm taïo dòch loûng, cho dòch loûng naøy chaûy tuaàn hoaøn beân trong sôïi do ñoù haïn cheá söï phaân cöïc beà maët vaø söï bòt laáp thöôøng gaëp ôû caùc maøng. Phöông phaùp naøy ñöôïc Dinelli (1972) tieán haønh gioáng nhö taïo sôïi celluloza triacetate trong methylen clorua vaø enzyme daïng dung dòch trong ñeäm coù chöùa glycerol ñöôïc eùp qua moät khuoân loïc döôùi aùp suaát cuûa nitô. Caùc sôïi ra khoûi khuoân ñöôïc nhuùng vaøo trong moät caùi beå ñoâng tuï coù chöùa toluene, sau ñoù ñöôïc laøm khoâ trong chaân khoâng. Daïng bao vi theå: Enzyme ñöôïc nhoát trong bao vi theå coù maøng baùn thaám, maøng naøy ñöôïc taïo ra töø caùc polymer coù kích thöôùc loã ñuû nhoû ñeå ngaên caûn söï khuyeách taùn ra ngoaøi. Vì ezyme hoaït ñoäng trong moâi tröôøng dung dòch neân khaû naêng tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát lôùn hôn so vôùi tröôøng hôïp nhoát trong caáu truùc daïng gel. Daïng maøng sieâu loïc: Phöông phaùp naøy ñôn giaûn töông töï nhö nhoát trong bao vi theå. Enzyme ñöôïc giöõ trong maøng sieâu loïc. Maøng baùn thaám naøy cho pheùp caùc cô chaát vaø saûn phaåm coù troïng löôïng phaân töû thaáp qua laïi töï do, nhöng giöõ laïi enzyme coù troïng löôïng phaân töû cao. 2.9.5. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh Khi gaén leân chaát mang, enzyme bò giôùi haïn trong moät phaïm vi moâi tröôøng xaùc ñònh, caáu taïo khoâng gian cuûa phaân töû coù theå bò thay ñoåi, do ñoù laøm bieán ñoåi moät soá tính chaát cuûa enzyme ban ñaàu (enzyme hoaø tan). Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme khoâng hoaø tan laø: 2.9..5.1 Baûn chaát vaø tính chaát hoaù hoïc cuûa chaát mang Caùc tính chaát lyù hoïc cuûa chaát mang nhö tính hoaø tan, tính beàn cô hoïc, ñoä tröông, ñieän tích, tính haùo nöôùc vaø kò nöôùc, .. ñeàu coù aûnh höôûng nhaát ñònh ñeán löôïng enzyme ñöôïc lieân keát, tính beàn, vaø hoaït tính sinh hoïc cuûa caùc daãn xuaát enzyme coá ñònh. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa chaát mang cuõng coù aûnh höôûng ñaùng keå ñeán khaû naêng taïo thaønh daãn xuaát enzyme, vaø tôi khaû naêng chaát mang haáp thuï khoâng ñaëc tröng caùc chaát töø moâi tröôøng phaûn öùng. Daãn xuaát enzyme khoâng haøo tan thöôøng coù tính beàn nhieät cao so vôùi enzyme hoaø tan do keát quaû cuûa söï ñònh vò enzyme taïo neân. Chaát mang cuõng coù taùc duïng haïn cheá bieán tính cuûa enzyme trong dung moâi coù khaû naêng laøm ñöùt moái lieân keát hydrogen vaø lieân keát kî nöôùc. Söï khuyeách taùn cuûa cô chaát, saûn phaåm vaø caùc phaân töû khaùc. 2.9.5.2 Toác ñoä khuyeách taùn cuûa cô chaát, saûn phaåm vaø caùc chaát khaùc phuï thuoäc vaøo caùc yeáu toá Kích thöôùc loã gel cuûa chaát polymer. Troïng löôïng phaân töû cuûa cô chaát. Söï cheânh leäch noàng ñoä giöõa vuøng moâi tröôøng vi moâ xung quanh enzyme vaø dung dòch töï do. Trong vaán ñeà naøy, ñöôøng kính loã cuûa chaát mang polymer vaø troïng löôïng phaân töû cuûa cô chaát ñoùng vai troø haøng ñaàu. Song nhöõng haïn cheá khuyeách taùn khoâng ñôn giaûn nhö vaäy bôûi vì coøn coù söï khaùc bieät noàng ñoä giöõa vuøng moâi tröôøng vi moâ xung quanh enzyme vaø dung dòch töï do. 2.9.5.3 Aûnh höôûng cuûa pH leân enzyme khoâng haøo tan Ñieän tích cuûa chaát mang coù aûnh höôûng ñaùng keå ñeán pH toái öu cuûa enzyme coá ñònh. pH toái öu cuûa enzyme hoaø tan, söï chuyeån dòch pH toái öu laø do aûnh höôûng cuûa tröôøng tónh ñieän cuûa chaát mang taïo neân. 2.9.6 Öùng duïng cuûa enzyme coá ñònh Trong coâng nghieäp: Ngaøy nay, nhieàu quy trình öùng duïng enzyme coá ñònh trong coâng nghieäp nhö: coâng nghieäp saûn xuaát röôïu bia, nöôùc giaûi khaùt, cheá bieán söõa, saûn xuaát da, hoaù chaát, … Röôïu bia: caùc enzyme amylase, teá baøo naám men coá ñònh enzyme ñöôïc söû duïng ôû quy moâ lôùn. Cheá bieán söõa: enzyme lactase coá ñònh ñeå thuyû phaân lactose söõa. Naêm 1969, Wilson ñaõ saûn xuaát lieân tuïc glucose baèng glucoseamylase coá ñònh Naêm 1971, ñaõ söû duïng chymotrypsin lieân keát coäng hoaù trò vôùi carboximethyl cellulose laøm ñoâng tuï söõa thay cho remin ñaét tieàn. Trong y hoïc: Enzyme coá ñònh ñöôïc öùng duïng nhieàu trong y hoïc ñeå chöõa caùc beänh di truyeàn do thieáu enzyme hoaëc hoaït ñoä enzyme yeáu. Naêm 1954, Chung ñaõ taïo ñöôïc vi tieåu caàu baùn thaám coù gaén enzyme, nhôø theá enzyme coù theå toàn taïi trong cô theå laâu daøi vì enzyme bò bieät laäp vôùi moâi tröôøng xung quanh. Do ñoù, cô theå taïo ñöôïc noàng ñoä cao cuûa enzyme thieáu maø khoâng bò aûnh höôûng cuûa caùc phaûn öùng phuï. Enzyme coá ñònh coøn ñöôïc duøng trong chuaån ñoaùn beänh. Ngoaøi caùc öùng duïng ñieän cöïc enzyme trong phaân tích caùc chæ tieâu sinh hoùa cuûa maùu nhö: löôïng glucose, urea, cholesterol, … enzyme horse radish peroxidase coá ñònh treân polystyrene cuøng vôùi khaùng theå, giuùp chuaån ñoaùn nhanh vaø chính xaùc (kyõ thuaät ELISA). Trong nghieân cöùu khoa hoïc: Naêm 1967, ñieän cöïc enzyme ñaàu tieân ñaõ ñöôïc cheá taïo ñeå xaùc ñònh noàng ñoä glucose nhôø glucoseoxydase coá ñònh. Ñieän cöïc enzyme laø ñieän cöïc oxy treân beà maët coù gel polyacrylamide. Nhuùng ñieän cöïc vaøo dung dòch coù glucose thì cô chaát vaø oxy seõ khuyeách taùn vaøo gel coù chöùa enzyme. Nhö vaäy söï bieán ñoåi doøng ñieän trong heä thoáng ñieän cöïc phuï thuoäc vaøo toác ñoä cuûa phaûn öùng vaø noàng ñoä glucose. Ngoaøi ra enzyme coá ñònh coøn coù theå ñöôïc duøng vaøo nhieàu muïc ñích khaùc nhau nhö: hoaït hoùa zymogen, nghieân cöùu caáu truùc phaân töû proteinem söû duïng trong phöông phaùp saéc kyù aùi löïc ñeå tinh cheá moät soá chaát coù khaû naêng lieân keát ñaëc hieäu vôi enzyme. Ngaøy nay coù nhieàu quy trình söû duïng cheá phaåm teá baøo coá ñònh ñeå xöû lyù nöôùc thaûi ñaït hieäu quaû. Trong baûo veä moâi tröôøng: Trong coâng nghieäp cheá bieán thöïc phaåm, röôïu bi._.g chitosan thu ñöôïc laøm giaù theå coá ñònh enzyme Phöông phaùp coá ñònh enyzme protease vaøo trong chitosan baèng phöông phaùp nhoát a) nguyeân lyù: chitosan coù khaû naêng taïo gel hay maøng boïc, enzyme seõ ñöôïc giöõ trong gel hay maøng boïc ñoù sau quaù trình truøng hôïp vôùi söï coù maët cuûa moät hay nhieàu taùc nhaân khaâu maïch, taïo phöùc chelate. b) hoaù chaát boät chitosan Acid acetic 1% Tripolyphosphate 3% caùch tieán haønh Dung dòch chitosan ñöôïc chuaån bò baèng vieäc cho 3g chitosan vaøo 100 ml dung dòch acid acetic 1%, sau ñoù hoaø troän hoãn hôïp treân vôùi 2 ml dung dòch enzymeâ 5%. Duøng oáng tieâm cho chaûy nhoû gioït hoãn hôïp treân vaøo 500 ml dung dòch tripolyphosphate (TPP) 3%. Chuùng ñöôïc ñeå qua ñeâm cho raén laïi vaø sau ñoù ñöôïc röûa hai laàn treân maøng loïc vôùi nöôùc caát. Dung dòch TPP sau khi röûa ñöôïc thu thaäp ñeå xaùc ñònh hieäu suaát nhoát. Xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh enzyme CiVi - CfVf Hieäu suaát (%) = x 100 CiVi Trong ñoù: Ci : laø noàng ñoä ban ñaàu cuûa protein. Vi : laø theå tích ban ñaàu cuûa dung dòch protein. Cf : laø noàng ñoä protein trong toång phaàn nöôùc loïc ra. Vf : laø toång theå tích cuûa phaàn nöôùc loïc. 3.3.5 Xaùc ñònh haøm löôïng protein vaø hoaït tính protease trong cheá phaåm enzyme ban ñaàu Caân 0.05g cheá phaåm enzyme hoaø tan trong 5ml dung dòch nöôùc caát, sau ñoù tieán haønh thí nghieäm xaùc ñònh haøm löôïng protein vaø hoaït tính protease theo phöông phaùp Bradford vaø Amano 3.3.5.1 Xaùc ñònh hieäu suaát hoaït tính enyzme coá ñònh Hieäu suaát hoaït tính enzyme coá ñònh ñöôïc xaùc ñònh bôûi coâng thöùc: E0V0 - EfVf H = x 100 E0V0 Trong ñoù: H : hieäu suaát hoaït tính enzyme coá ñònh (%). E0 : hoaït tính enzyme protease coù trong theå tích duøng ñeå coá ñònh (U/ml). V0 : theå tích enzym duøng ñeå coá ñònh (ml). Ef : hoaït tính cuûa enzyme protease coù trong theå tích sau khi coá ñònh (U/ml). Vf : toång theå tích cuûa phaàn nöôùc loïc (ml). 3.3.5.2 Xaùc ñònh haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang gaén enzyme coá ñònh Haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang gaén enzyme coá ñònh ñöôïc xaùc ñònh bôûi coâng thöùc sau: (C0V0 - CfVf) P = x 1/1000 (mg/g) Wg Trong ñoù: P : haøm löôïng protein C0 : noàng ñoä protein cuûa dung dòch enzyme protease tröôùc khi coá ñònh (µg/ml). Cf : noàng ñoä protein cuûa dung dòch enzyme protease sau khi coá ñònh (µg/ml). V0 : theå tích enzyme tröôùc khi coá ñònh (ml). Vf : theå tích enzyme sau khi coá ñònh (ml). Wg: troïng löôïng cuûa chaát mang gaén enzyme coá ñònh (g) 3.3.5.3 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Cheá phaåm enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñöôïc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính protease baèng phöông phaùp ñaõ Amano. tuy nhieân chuùng toâi giöõ nguyeân giaù trò pH vaø noàng ñoä cô chaát casein 1%, chæ thay ñoåi giaù trò nhieät ñoä töø 30 – 800C, moãi giaù trò caùch nhau 100C. töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø protease coá ñònh ñeå tìm ra nhieät ñoä toái öu cho hoaït ñoäng xuùc taùc thuyû phaân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh. 3.3.5.4 Khaûo saùt ñoä beàn nhieät ñoái vôùi hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Cheá phaåm enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñöôïc khaûo saùt ñoä beàn nhieät leân hoaït tính protease baèng phöông phaùp Amano. tuy nhieân chuùng toâi tieán haønh uû enzyme ôû nhieät ñoä 600C trong caùc khoaûng thôøi gian 0 phuùt, 10 phuùt, 20 phuùt, .. .., 100 phuùt. Ôû moãi khoaûng thôøi gian chuùng toâi ñem ra laøm nguoäi vaø xaùc ñònh hoaït tính theo phöông phaùp Amano. Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñeå xem aûnh höôûng cuûa thôøi gian uû leân hoaït ñoäng xuùc taùc thuyû phaân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme coá ñònh. 3.3.5.5 Khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh baèng phöông phaùp nhoát Sau khi xaùc ñònh ñöôïc nhieät ñoä vaø pH toái öu cuûa protease coá ñònh, ta tieán haønh khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa protease ñaõ ñöôïc coá ñònh, thoâng qua vieäc xaùc ñònh hoaït tính theo phöông phaùp Amano. khi keát thuùc thí nghieäm xaùc ñònh hoaït tính laàn 1, röûa laïi baèng nöôùc caát vaø tieáp tuïc khaûo saùt hoaït tính laàn 2, cöù tieáp tuïc nhö theá cho ñeán khi hoaït tính enzyme protease coá ñònh giaûm xuoáng 50% Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease coá ñònh theo soá laàn taùi söû duïng, vaø cuõng xaùc ñònh ñöôïc khi naøo hoaït tính cuûa enzyme protease coá ñònh giaûm ñi moät nöõa so vôùi hoaït tính enzyme ban ñaàu. Chöông 4 KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 4.1 Keát quaû phaàn khaûo saùt enzyme Haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa dòch chieát enzyme: Baûng 4.1 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa dòch chieát enzyme Haøm löôïng proteine (mg/ml) Hoaït tính protease (U/ml) Hoaït tính rieâng (U/mg) 12.852 46.072 3.58 Haøm löôïng vaø hoaït tính cheá phaåm enzyme tuûa baèng coàn 960C: Baûng 4.2 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa cheá phaåm enzyme khi tuûa coàn Tyû leä tuûa (dòch chieát: coàn 960C 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Haøm löôïng proteine (mg/g) 93.24 104.02 105.56 114.49 101.42 70.36 Hoaït tính protease (U/g) 236.27 291.77 437.43 496.63 430.32 240.13 Nhaän xeùt: Theo baûng 4.2 ta thaáy tyû leä tuûa coàn 1 : 4 laø cho keát quaû haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme laø cao nhaát, vì vaäy ta seõ choïn tyû leä 1 : 4 tuûa dòch chieát enzyme, taïo cheá phaåm enzyme ñeå laøm nguyeân lieäu cho caùc thí nghieäm sau. Khi tyû leä coàn cao thì khaû naêng tuûa proteine caøng cao, tuy nhieân neáu tyû leä coàn quaù cao coù theå laøm giaûm khaû naêng keát tuûa. Ban ñaàu khi löôïng dung moâi caøng taêng, enzyme ñöôïc keát tuûa do maát lôùp aùo nöôùc beân ngoaøi neân hoaït tính caøng taêng. Nhöng neáu tieáp tuïc taêng löôïng dung moâi, haèng soá ñieän moâi giaûm, phaân töû proteine coù theå töï thaùo gôõ vaø trôû thaønh daïng khoâng hoaït ñoäng, do ñoù hoaït tính giaûm (ôû tyû leä 1 : 5, 1 : 6). Coøn ôû tyû leä coàn quaù thaáp (tyû leä 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3) do chöa ñuû löôïng dung moâi neân khoâng keát tuûa ñöôïc heát löôïng proteine, hoaït tính thaáp. Haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme: Baûng 4.3 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa cheá phaåm enzyme Haøm löôïng proteine (mg/g) Hoaït tính protease (U/g) Hoaït tính rieâng (U/mg) 37.53 134.60 3.58 4.2 Keát quaû phaàn khaûo saùt voû toâm Baûng 4.4 keát quaû kieåm tra nguyeân lieäu ban ñaàu Ñoä aåm (%) Haøm löôïng tro (%) Haøm löôïng Ca (%) Haøm löôïng P (%) Toång haøm löôïng proteine (%) 12.58 10.27 8.96 1.13 17.62 4.3 Ñoäng hoïc cuûa quaù trình thuyû phaân protein trong voû toâm baèng enyzme protease ôû caùc noàng ñoä 5%, 7%, 9% 4.3.1 Keát quaû ño haøm löôïng protein cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân (mg/g) 4.3.1.1 Ôû noàng ñoä enzyme 5% Baûng 4.5 keát quaû haøm löôïng proteine coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 3.81 7.85 7.19 6.08 3.82 1.51 1.38 1.30 1.19 0.97 0.89 50 6.85 5.52 3.79 2.29 1.14 0.95 0.87 0.93 0.81 0.90 60 7.24 6.11 4.86 3.82 2.53 1.97 2.09 2.03 1.90 1.80 Hình 4.1 ñoä thò bieåu dieãn haøm löôïng proteine coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuûy phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Nhaän xeùt: Döïa vaøo ñoà thò treân ta thaáy ôû nhieät ñoä 500C, haøm löôïng proteine hoaø tan coøn laïi trong dòch sau thuyû phaân enzyme thuyû phaân cho ra keát quaû toát nhaát, baèngchöùng laø haøm löôïng protein hoaø tan trung bình taïi 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (2.54<3.27<3.47). Haøm löôïng proteine haøo tan coøn laïi trong dòch thuyû phaân ôû caùc thôøi gian khaùc nhau coù söï khaùc bieät veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Cuï theå laø haøm löôïng protein trung bình cao nhaát ôû maãu 2 giôø (7.31), thaáp nhaát ôû maãu 10 giôø (1.72) vaø caùc maãu sau 10 giôø khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi maãu 10 giôø. Coù theå giaûi thích nhö sau: thôøi gian ñaàu (0 giôø), voû toâm chöa bò enzyme thuyû phaân neân haøm löôïng protein hoaø tan trong dòch loïc chæ laø haøm löôïng cuûa dòch chieát enzyme, haøm löôïng ño ñöôïc thaáp. Thôøi gian tieáp theo (2 giôø) haøm löôïng protein taêng vaø ñaït cöïc ñaïi, do voû toâm khoâ luùc naøy baét ñaàu bò röûa ra vaø hoaø vaøo dòch thuyû phaân, ñoàng thôøi ôû gian ñoaïn naøy coù theå enzyme chöa thuyû phaân hoaëc chæ thuyû phaân moät phaàn protein cuûa voû toâm, neân haøm löôïng protein ôû giai ñoaïn naøy cao nhaát (bao goàm protein cuûa dòch chieát enzyme vaø protein coøn laïi cuûa voû toâm). Töø 2 giôø trôû ñi thì haøm löôïng protein baét ñaàu giaûm maïnh. Ñieàu naøy laø do enzyme ñaõ thuyû phaân voû toâm taïo ra amino acid laøm cho haøm löôïng caùc chaát hoaø tan trong dòch loïc giaûm xuoáng vaø thôøi gian caøng daøi thì amino acid ñöôïc taïo ra caøng nhieàu, haøm löôïng protein hoaø tan caøng giaûm. Nhöng töø thôøi gian 10 giôø trôû ñi haøm löôïng protein hoaø tan khoâng giaûm nöõa, caùc giaù trò thôøi gian tieáp theo sau 10 giôø chæ coù haøm löôïng protein hoaø tan saáp xæ khoaûng 10 giôø vì luùc naøy protein trong voû toâm ñaõ heát, haøm löôïng protein ño ñöôïc luùc naøy chæ laø haøm löôïng protein coøn laïi cuûa enzyme sau khi thuyû phaân. Cuõng coù theå laø do tôùi thôøi gian 10 giôø thì hoaït tính cuûa enzyme baét ñaàu giaûm vaø maát haún neân khoâng thuyû phaân heát löôïng protein coøn laïi trong voû toâm. Nhö vaäy ôû noàng ñoä 5%, nhieät ñoä 500C, thôøi gian enzyme thuyû phaân toát nhaát laø 10 giôø. 4.3.1.2 Ôû noàng ñoä enzyme 7% Baûng 4.6 keát quaû haøm löôïng protein coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoân enzyme 7% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 5.46 9.95 7.50 6.07 4.81 1.37 0.97 0.89 0.92 1.02 0.81 50 9.32 7.72 5.01 1.03 0.45 0.39 0.37 0.38 0.22 0.22 60 10.11 8.03 7.10 6.03 2.59 2.09 1.89 1.75 1.79 1.72 Hình 4.2 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò treân noàng ñoä 7% vaø 5% thì keát quaû thuyû phaân 500C laø toát nhaát vì haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ôû 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (2.78<3.62<4.42) Haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ôû maãu 10 giôø cuõng thaáp nhaát (1.47) vaø caùc maãu sau 10 giôø khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi maãu 10 giôø xeùt veà phöông dieän thoâng keâ hoïc. Nhö vaäy, noàng ñoä enzyme laø 7% thì nhieät ñoä vaø thôøi gian toái öu cho söï thuyû phaân cuõng laø 500C vaø 10 giôø. 4.3.1.3 Ở noàng ñoä enzyme 9% Baûng 4.7 keát quaû haøm löôïng protein coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Thôøi gian Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 5.77 10.36 8.61 6.90 5.01 2.13 1.95 1.52 1.67 1.83 1.76 50 9.76 7.33 4.71 1.08 0.37 0.39 0.35 0.26 0.21 0.22 60 10.55 7.19 6.03 3.30 2.16 1.97 2.05 2.19 2.13 1.97 Hình 4.3 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta thaáy cuõng töông töï nhö ôû hai noàng ñoä 5% vaø 7% nhieät ñoä 500C vaø thôøi gian 10 giôø vaãn laø ñieàu kieän toái öu cho söï thuûy phaân enzyme. Nhaän xeùt chung: quaû 3 bieåu ñoà treân ta thaáy nhieät ñoä toái öu cho söï thuyû phaân laø 500C , thôøi gian thuyû phaân laø 10 giôø Haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ô caùc noàng ñoä enzyme khaùc nhau 5%, 7%, 9% khoâng coù söï khaùc bieät xeùt veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Tuy nhieân neáu so saùnh veà nhieät ñoä vaø thôøi gian toái öu cho thuyû phaân thì ta thaáy haøm löôïng protein hoaø tan coøn laïi trong dòch sau thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% thaáp hôn 5% vaø 9% neân ta coù theå choïn 7% laø noàng ñoä thích hôïp thaáp hôn 5% vaø 9% neân ta coù theå choïn 7% laø noàng ñoä thích hôïp cho thuyû phaân. Neáu ta taêng noàng ñoä enzyme vöôït quaù möùc toái thích thì toác ñoä phaûn öùng cuõng khoâng taêng, ñoâi khi coøn kieàm haõm toác ñoä phaûn öùng. Keát luaän: Töø nhöõng keát quaû treân ta thaáy. Ñeå quaù trình thuyû phaân ñaït cöïc ñaïi vaø ñeå tieát kieäm thôøi gian, enzyme ta seõ tieán haønh thuyû phaân ôû 500C, trong 10 giôø vôùi noàng ñoä enzyme laø 7%. 4.4 Keát quaû ño haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau caùc thôøi gian thuyû phaân (%) Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ñieàu kieän thích hôïp cho quaù trình thuyû phaân (nhieät ñoä 500C thôøi gian 10 giôø vaø noàng ñoä enzyme 7%) nhöng ñeå khaúng ñònh ñöôïc keát quaû treân ta tieán haønh xaùc ñònh haøm löôïng protein coøn laïi trong xaùc voû toâm sau khi thuyû phaân. 4.4.1 ÔÛ noàng ñoä enzyme 5% Baûng 4.8 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 17.07 15.60 13.13 10.84 6.17 2.84 2.61 2.55 2.47 2.37 2.38 50 14.23 11.16 7.71 4.87 1.52 1.45 1.38 1.41 1.36 1.30 60 16.38 14.12 11.44 9.37 8.07 5.58 5.26 5.23 5.13 5.02 Hình 4.4 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Nhaän xeùt: döïa treân ñoà thò ta thaáy haøm löôïng protein toång soá trung bình ôû giaù trò nhieät ñoä 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (5.77<7.09<9.34). Haøm löôïng protein toång soá giaûm daàn theo thôøi gian ôû caû 3 nhieät ñoä 40,50,600C vaø thôøi ñieåm 10 giôø thì ngöng laïi khoâng giaûm nöõa. Vì luùc ñaàu (0 giôø) enzyme chöa kòp thuyû phaân neân haøm löôïng protein toång soá trong voû toâm coøn nhieàu. Khi ta keùo daøi thôøi gian thuyû phaân (töø 2 -10 giôø) thì löôïng protein toång soá trong voû toâm cuõng giaûm ñi. Vaø töø 10 giôø trôû ñi thì löôïng N toång soá khoâng giaûm nöõa do hoaït tính thuyû phaân cuûa enzyme ñaõ giaûm. Neáu ta vaãn tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian thì haøm löôïng protein coøn laïi vaãn khoâng ñoåi. Nhö vaäy ôû nhieät ñoä 500C trong thôøi gian 10 giôø thì hoaït tính thuyû phaân cuûa enzyme ñaït giaù trò cao nhaát. 4.4.2 ÔÛ noàng ñoä 7% Baûng 4.9 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 16.96 14.47 12.60 9.82 5.16 1.97 1.71 1.83 1.72 1.79 1.91 50 13.55 10.23 5.95 1.88 1.76 1.63 1.71 1.81 1.44 1.55 60 15.16 13.98 11.8 9.58 5.28 4.99 5.02 4.73 4.86 4.48 Hình 4.5 đồ thị biểu diễn hàm lượng protein tổng số của mẫu vỏ toâm sau khi thủy phaân ở nồng độ 7% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò cuõng töông töï ôû noàng ñoä 5% vaø 7% haøm löôïng protein coøn laïi ôû 500C thaáp hôn so vôùi 400C vaø 600C vaø giaûm daàn theo thôøi gian nhöng sau thôøi ñieåm 10 giôø thì haøm löôïng protein khoâng giaûm nöõa. Nhö vaäy, ôû noàng ñoä enzyme laø 7% thì ñieàu kieän thích hôïp cho thuyû phaân laø 500C vaø 10 giôø 4.4.3 ÔÛ noàng ñoä 9% Baûng 4.10 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme laø 9% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 16.74 15.81 13.59 10.79 7.23 2.70 2.49 2.36 2.38 2.27 2.53 50 14.19 11.48 7.48 2.03 1.30 1.19 1.27 1.71 1.03 1.45 60 15.63 14.23 12.52 9.77 7.03 5.58 5.47 5.44 5.19 5.26 Hình 4.6 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta thaáy cuõng töông töï 2 noàng ñoä tröôùc, ôû noàng ñoä 9% ñieàu kieän thuyû phaân toát nhaát laø 500C, 10 giôø. Nhaän xeùt chung: haøm löôïng protein toång soá trung bình coøn laïi trong voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% thaáp hôn 5% vaø 9% Haøm löôïng protein toång soá trung bình coøn laïi trong voû toâm sau thuyû phaân ôû nhieät ñoä 500C thaáp hôn 40 0C vaø 600C Haøm löôïng protein trung bình coøn laïi trong voû toâm sau khi thuyû phaân ôû giaù trò thôøi gian laø 10 giôø laø thaáp nhaát vaø caùc giaù trò sau 10 giôø thì khoâng coù söï khaùc bieät veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Keát luaän Nhö vaäy keát quaû thí nghieäm ño haøm löôïng protein coøn laïi trong voû toâm sau thuyû phaân cho keát quaû hoaøn toaøn truøng khôùp vôùi keát quaû xaùc ñònh noàng ñoä protein hoaø tan protein coøn laïi trong dòch loïc sau thuyû phaân. Vì vaäy ta coù theå khaúng ñònh raèng ñieàu kieän toái öu cho söï thuyû phaân voû toâm baèng enzyme protease laø 500C thôøi gian laø 10 giôø vôi noàng ñoä enzyme laø 7% vaø seõ tieán haønh thuyû phaân voû toâm ñeå saûn xuaát chitosan vôùi caùc ñieàu kieän toái öu naøy. 4.5 Keát quaû cuûa saûn phaåm chitosan 4.5.1 Hieäu suaát thu hoài saûn phaåm Sau khi thuyû phaân 100g voû toâm, ta thu ñöôïc 20g chitosan Vaäy hieäu suaát (%) = 20% 4.5.2 Ñònh tính Caân 0.5g maãu hoaø trong 100ml dung dòch acid acetic 1%, sau ñoù laáy ra 10ml dung dòch vaø cho thuoác thöû KMnO4 vaøo, ta thaáy dung dòch chuyeån töø maøu tím sang maøu vaøng nhaït. Vaäy maãu thí nghieäm chính laø chitosan. 4.5.3 Caùc tính chaát lyù hoaù cuûa saûn phaåm chitosan Baûng 4.11 keát quaû kieåm tra saûn phaåm chitosan thu ñöôïc Maøu saéc Maøu traéng ngaø Ñoä aåm (%) 13.16 Ñoä hoaø tan (%) 80.46 Ñoä nhôùt (Pa.s) 0.57 Haøm löôïng tro (%) 1.63 Ñoä deacetyl hoaù (%) 80.56 Hình 4.7 chitosan ñöôïc thuyû phaân töø enzyme protease Nhaän xeùt: chaát löôïng cuûa chitin – chitosan ñöôïc ñaùnh giaù thoâng qua chaát löôïng chitosan cuûa coâng ty Protan – Biopolymer, laø moät trong nhöõng coâng ty lôùn treân theá giôùi (theo tpaï chí khoa hoïc vaø coâng ngheä thuyû saûn soá 2 – 1992) goàm caùc chæ tieâu sau: Ñoä aåm: 10% Ñoä tan: 100% Haøm löôïng tro: 15% Ñoä nhôùt: 0.2 Pa.s Hieäu suaát deacetyl: >80% Chitosan thu ñöôïc trong thí nghieäm treân coù keát quaû töông ñöông vôùi chaát löôïng chitosan cuûa coâng ty Protan – Biopolymer. Vì vaäy ta coù theå söû duïng chitosan naøy ñeå duøng trong vieäc khaûo saùt coá ñònh enzyme vaøo saûn phaåm. 4.6 Keát quaû cuûa quaù trình coá ñònh enzyme protease vaøo chaát mang chitosan baèng phöông phaùp nhoát 4.6.1 hieäu suaát coá ñònh Baûng 4.12 keát quaû kieåm tra haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Haøm löôïng enzyme tröôùc coá ñònh (mg/g) Haøm löôïng enzyme sau coá ñònh (U/g) Hoaït tính enyzme tröôùc coá ñònh (mg/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (mg/g) Hoaït tính rieâng tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính rieâng sau coá ñònh (U/g) 37.53 24.79 134.60 81.45 3.58 3.03 Hieäu suaát coá ñònh haøm löôïng protein (%) 66 Hieäu suaát coá ñònh hoaït tính enzyme protease 60 Haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang (mg/g) 10.91 Hình 4.8 enzyme protease ñöôïc coá ñònh trong gel chitosan 4.6.2 Aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh Baûng 4.13 keát quaû aûnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh pH Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) 6 67.22 42.73 7 81.05 39.12 8 73.08 53.01 9 43.91 54.95 10 40.98 51.63 Hình 4.9 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo pH nhaän xeùt: hoaït tính cuûa enzyme tröôùc coá ñònh cao nhaát ôû pH 7 vaø giaûm daàn ôû pH trung tính (8,9,10). Coøn ñoái vôùi enzyme sau coá ñònh ta thaáy hoaït tính cuûa enzyme taêng daàn tôùi pH 9 môùi baét ñaàu giaûm xuoáng. pH toái thích cuûa enzyme sau coá ñònh coù xu höôùng chuyeån dòch veà phía pH kieàm (pH = 9). Vieäc naøy coù theå laø enzyme nhoát trong gel chitosan ñöôïc baûo veä bôûi lôùp maøng bao beân ngoaøi neân caáu truùc cuûa enzyme ít bò aûnh höôûng, vaû laïi baûn chaát cuûa enzyme ban ñaàu ñaõ hoaït ñoäng toát trong khoaûng pH kieàm neân enzyme sau coá ñònh coù xu höôùng chuyeån pH toái thích sang kieàm. 4.6.3 Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh Baûng 4.14 keát quaû aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) 30 40.58 15.08 40 61.41 26.63 50 99.08 38.70 60 69.91 53.62 70 45.09 38.28 80 22.55 18.29 Hình 4.10 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo nhieät ñoä Nhaän xeùt: ñoái vôùi enzyme tröôùc coá ñònh ta coù theå thaáy hoaït tính cuûa enzyme chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi nhieät ñoä. Töø 30 – 500C thì hoaït tính cuûa enzyme taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi ôû 500C, ñeàu naøy phuø hôïp vôùi quy luaät nhieät ñoä caøng taêng thì hoaït tính cuûa enzyme caøng taêng. Tuy nhieân töø 500C trôû ñi thì hoaït tính cuûa enzyme giaûm maïnh vaø giaûm raát nhanh. Ôû ñaây maëc duø nhieät ñoä taêng nhöng hoaït tính cuûa enzyme khoâng taêng nöõa maø laïi giaûm vì ôû nhieät ñoä > 500C vöôït quaù nhieät ñoä tôùi haïn cuûa enzyme neân toác ñoä phaûn öùng giaûm. Nhö vaäy chöùng toû enzyme protease ban ñaàu hoaït ñoäng raát keùm ôû nhieät ñoä cao. Ñoái vôùi enzyme coá ñònh thì hoaït tính cuûa enzyme cuõng taêng daàn töû 300C vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi ôû 600C. tuy nhieân töø 60 – 800C thì hoaït tính cuûa enzyme laïi giaûm maïnh. Ta coù theå deã daøng nhaän thaáy nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme coá ñònh laø 600C cao hôn nhieät ñoä toái öu cuûa enyzme ban ñaàu laø 500C. ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do khi ta coá ñònh baèng phöông phaùp nhoát trong gel chitosan thì enzyme ñöôïc baûo veä bôûi heä gel cho neân enzyme coù khaû naêng beàn nhieät vaø chòu nhieät cao hôn. Tuy nhieân neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä thì laøm cho lôùp gel chitosan bò bieán tính vaø laøm aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc baûo veä beân trong neân hoaït tính luùc naøy cuûa enzyme giaûm maïnh. 4.6.4 Aûnh höôûng cuûa ñoä beàn nhieät ñeán enzyme tröôùc va sau coá ñònh Baûng 4.15 keát quaû aûnh höôûng cuûa ñoä beà nhieät leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Thôøi gian (phuùt) Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme protease coøn laïi tröôùc coá ñònh (%) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme protease coøn laïi sau coá ñònh (%) 0 105.85 100 89.90 100 10 88.47 83.58 76.55 85.15 20 80.11 75.68 74.94 83.35 30 60.89 59.98 60.48 67.27 40 42.57 40.22 49.21 54.74 50 30.77 29.07 45.65 50.78 60 24.01 22.68 44.29 49.27 70 13.37 12.64 41.76 46.45 80 9.97 9.42 37.16 41.33 Hình 4.11 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo ñoä beàn nhieät Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta coù theå thaáy hoaït tính cuûa enzyme protease giaûm daàn gaàn nhö tuyeán tính theo thôøi gian uû. Nhö vaäy thôøi gian caøng keùo daøi thì hoaït tính cuûa enzyme caøng giaûm. Ñoái vôùi enzyme coá ñònh, ôû 2 laàn uû ñaàu tieân (10 – 20 phuùt) hoaït tính cuûa enzyme vaãn coøn giöõ laïi raát cao. Tuy nhieân ôû caùc laàn uû tieáp theo thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh laïi giaûm nhanh choùng. Hình 4.12 ñöôøng so saùnh phaàn traêm hoaït tính coøn laïi cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo ñoä beàn nhieät Nhaän xeùt: theo ñoà thò vaø baûng keát quaû treân ta thaáy hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme protease tröôùc coá ñònh seõ giaûm daàn theo thôøi gian uû ôû 600C vaø giaûm hôn 50% so vôùi hoaït tính ban ñaàu ôû thôøi gian uû 40 phuùt. Neáu uû tieáp ôû thôøi gian 80 phuùt, hoaït tính seõ giaûm raát nhieàu vaø chæ giöõ laïi ñöôïc 9.42% so vôùi hoaït tính ban ñaàu. Nhö ôû phaàn khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme thì enzyme tröôùc coá ñònh hoaït ñoäng keùm ôû nhieät ñoä cao, vaø döïa vaøo keát quaû khaûo saùt ñoä beàn nhieät thì ta coù theå keát luaän raèng khaû naêng duy trì hoaït tính cuûa enzyme tröôùc coá ñònh ôû nhieät ñoä cao laø raát keùm. Coøn ñoái vôùi enzyme sau coá ñònh thì hoaït tính cuûa enzyme cuõng giaûm nhanh theo thôøi gian uû ôû 600C nhöng giaûm chaäm hôn so vôùi enzyme tröôùc coá ñònh. Ôû thôøi gian uû 60 phuùt thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ñaõ giaûm hôn moät nöõa (chæ coøn 49.27%) so vôùi hoaït tính ban ñaàu. Vaø thôøi gian uû tôùi 80 phuùt thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh chæ coøn laïi 41.33%. nhö vaäy ôû gian ñoaïn ñaàu thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaãn coøn cao, ñieàu naøy coù theå laø do lôùp chaát mang chitosan beân ngoaøi ñaõ baûo veä enzyme traùnh khoûi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä, nhöng thôøi gian uû keùo daøi laøm cho lôùp chitosan bò meàm ra neân khoâng coøn baûo veä ñöôïc enzyme laøm cho hoaït tính cuûa enzyme sau coá ñònh giaûm daàn theo thôøi gian uû. 4.7 keát quaû soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh Baûng 4.16 keát quaû khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh Soá laàn taùi söû duïng Hoaït tính enzyme protease (U/g) Phaàn traêm coøn laïi (%) 1 55.16 100 2 54.23 98.3 3 38.65 91.09 4 34.51 81.34 5 27.83 65.6 6 18.16 42.8 7 15.56 36.68 Hình 4.13 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính enzyme protease theo soá laàn taùi söû duïng Hình 4.14 ñoà thò bieåu dieãn phaàn traêm hoaït tính enzyme protease coøn laïi theo soá laàn taùi söû duïng Nhaän xeùt: vieäc taùi söû duïng nhieàu laàn cuûa enzyme sau coá ñònh laø moät öu ñieåm raát coù giaù trò veà maët kinh teá cuûa enzyme coá ñònh. Tuy nhieân sau moãi laàn taùi söû duïng thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm vaø vieäc giaûm nhieàu hay ít laø vaán ñeà quan troïng haøng ñaàu. Döïa treân keát quaû khaûo saùt ta coù theå nhaän thaáy vieäc coá ñònh enzyme baèng gel chitosan cho hieäu suaát taùi söû duïng raát cao, tôùi laàn thöù 6 thì hoaït tính môùi giaûm hôn 50% ñieàu naøy chöùng toû laø lôùp gel chitosan raát vöõng chaéc, truøng khôùp vôùi keát quaû khaûo saùt ñoä beàn nhieät vaø keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzyme sau coá ñònh cho thaáy vieäc baûo veä enzyme cuûa chitosan raát toát. Nhìn chung vieäc söû duïng chitosan laøm chaát gel ñeå nhoát enzyme cho keát quaû khaù toát neân coù theå aùp duïng trong thöïc teá coá ñònh enzyme hay teá baøo. Chöông 5 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 5.1 keát luaän Vôùi keát quaû thu ñöôïc ta coù theå ñöa ra caùc keát luaän sau: Cheá phaåm enzyme thu ñöôïc coù hoaït tính vaø haøm löôïng cao nhaát khi tuûa baèng coàn 960 vôùi tyû leä theå tích dòch chieát enzyme : theå tích coàn = 1:4. Enzym protease cho keát quaû thuyû phaân trong ñieàu kieän: nhieät ñoä 500C, thôøi gian 10 giôø vôùi noàng ñoä enzyme 7%. Chitosan thu ñöôïc baèng phöông phaùp thuyû phaân protease töø naám moác Aspergillus oryzae coù chaát löôïng töông ñöông vôùi chitosan thöông maïi. Enzyme protease ñöôïc coá ñònh treân chaát mang baèng phöông phaùp nhoát: Hieäu suaát coá ñònh haøm löôïng protein (%): 66 Hieäu suaát coá ñònh hoaït tính protease (%): 60 Haøm löôïng protease coù trong 1g chaát mang (mg/g): 10.91 Hoaït tính rieâng (U/g): 3.03 5.2 Ñeà nghò Qua quaù trình thöïc hieän ñeà taøi chuùng toâi coù moät soá kieân nghò sau: Toái öu hoaù quaû trình thuyû phaân ñeå taêng hieäu suaát thu hoài saûn phaåm. Nghieân cöùu öùng duïng chitosan laøm giaù theå coá ñònh caùc loaïi enyzme khaùc. Töø ñoù ñeå hieåu roõ hôn veà khaû naêng coá ñònh enzyme cuûa chitosan. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi lieäu tieáng vieät Döông Thò Höông Giang, Leâ Thanh Huøng, Voõ Vaên Song Toaøn, Sonia Beeckmans, Edibert Van Driesche vaø Traàn Phöôùc Ñöôøng. “Ñaùnh giaù caùc phöông phaùp ly trích enzyme bromelaine töø nöôùc khoùm khoâ”. Tuyeån taäp caùc coâng trình nghieân cöùu khoa hoïc, Tröôøng Ñaïi Hoïc Caàn Thô. Döông Thò Höông Giang. 2004. “Giaùo trình thöïc taäp coâng ngheä enzyme”. Tröôøng Ñaïi Hoïc Caàn Thô. Dieäp Quyønh Nhö, Nguyeãn Dieân Sanh. “Taøi lieäu thöïc taäp coâng ngheä enzyme vaø protein”. Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi. Nguyeãn Ñöùc Löôïng. 2004. “Coâng ngheä enzyme”. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Tp.HCM Nguyeãn Tieán Thaéng. 2003. “Moät soá kó thuaät phoøng thí nghieäm sinh hoïc”. Tuû saùch Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi. Nguyeãn Tieán Thaéng. 2004. “Giaùo trình coâng ngheä enzyme”. Tuû saùch Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp.HCM. Phaïm Thò Aùnh Hoàng. 2003. Kyõ thuaät sinh hoùa. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Tp.HCM. Phaïm Leâ Duõng, Trònh Bình, Laïi Thu Hieàn vaø cuøng caùc coäng söï. 1997. “Vaät lieäu sinh hoïc töø chitin”. Vieän Hoaù Hoïc – Vieän Coâng Ngheä Sinh Hoïc, Trung taâm khoa hoïc vaø Coâng ngheä quoác gia Haø Noäi. Tröông Vónh. “Xaùc ñònh ñoä aåm vaø ñoä nhôùt”. Thöïc taäp moân hoïc: caùc quaù trình cô hoïc tuû saùch Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp.HCM. Taøi lieäu tieáng Anh Tan et al.,”The chitosan yield .. .” Carbohydrate Polymers, 30:239-242,1996. Fortin et al.,“Elucidation of the Mechanism Involved... .” Biotechnology Letters, 12(12):913-918,1990 kubo et al., “Effects of the Cultivation .. .”Nippon Nogeikagaku kaishi, 66(11):1641-1643, 1992, English Abstract Only. McGahren et al., “ Chitosan by Fermentation,” Process Biochemistry, 19:88-90,1984 Rane et al., “Production of chitosan .. .” Food Biotechnology,7(1):11-33,1993 YoKoi et al.,”Chitosan Production from . ..”Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(2):246-249,1998 Shapiro et al., “Biochemical and Biophysical Research Communications” 28(5):815-820 (1967) Yokoi, Haruhiko et al., “Chitosan Production from Shochu Distillery Wastewater by Funguses,” Journal of Fermention and Bioengineering, vol.85, No. 2, pp. 246-249, 1998 Zetelaki-Horvath, K. et al., “Kinetic Analysis of Protein Synthesis in Fungi, “ Acta Alimentaria, vol. 4, No.2, pp 181-188,1975 Yao Kangde, Yin Yuji, Cheng Guoxian, Zhou Jun. “Biomedical develoments in Chitosan – based polymers”. C.A, vol 130, No 13, pp 1052(172813, China),1999 Inui Hiroshi Appl. Biol. Sci., vol 2, No 2, pp 55-65, 1997 ._.