Luận văn Khảo sát hoạt tính lipase và phản ứng transeste hóa xúc tác enzym callera trans ljp30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng

Tú Nhi i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm luận văn tôi đã học tập và tích lũy được nhiều kiến thức, kinh nghiệm bổ ích làm hành trang vững chắc giúp tôi bước trên con đường sắp tới. Để đạt được những kết quả như ngày hôm nay ngoài nỗ lực bản thân; tôi còn nhận được sự động viên, giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè vào những lúc khó khăn. Vì thế, tôi xin dành trang đầu tiên này để gởi lời cám ơn chân thành đến: - Cô Phan Thị Bích Trâm đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn này. - Cô Phan Thị Ngọc Mai, thầy Nguyễn Mộng Hoàng và thầy Nguyễn Điền Trung đã truyền đạt và chỉ bảo tôi nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu. - Tất cả các thầy cô Bộ môn Sư phạm Hóa học–Khoa Sư Phạm, Trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ cũng như đóng góp những ý kiến giúp luận văn của tôi được hoàn thiện hơn. - Gia đình, bạn bè luôn hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cám ơn! Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi ii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ----------  ---------- ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... ......................................................................................................................................... Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi iii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ----------  ---------- .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ...............................................................ii NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ................................................................ iii MỤC LỤC ................................................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ................................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. x Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2 Chương 2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT ................................................................................. 3 2.1 Enzym lipase ................................................................................................. 3 2.1.1 Định nghĩa ............................................................................................. 3 2.1.2 Cấu trúc lipase ....................................................................................... 3 2.1.3 Cơ chế phản ứng của lipase [14],[15] ..................................................... 4 2.1.4 Nguồn thu nhận lipase............................................................................ 4 2.1.5 Ứng dụng lipase [19] .................................................................................. 5 2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase ............................................. 6 2.1.6.1 pH ...................................................................................................... 6 2.1.6.2 Nhiệt độ ............................................................................................. 7 2.1.6.3 Chất hoạt hóa ..................................................................................... 7 2.1.6.4 Chất kìm hãm ..................................................................................... 7 2.1.6.5 Nồng độ enzym/cơ chất ...................................................................... 7 2.2 Biodiesel (BDF) ............................................................................................ 8 2.2.1 Khái niệm .............................................................................................. 8 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi v 2.2.2 Ưu và nhược điểm của BDF ................................................................... 8 2.2.3 Các phương pháp điều chế BDF ............................................................. 9 2.2.3.1 Phương pháp sấy nóng ....................................................................... 9 2.2.3.2 Phương pháp pha loãng ...................................................................... 9 2.2.3.3 Phương pháp Crackinh ..................................................................... 10 2.2.3.4 Phương pháp nhũ tương hóa ............................................................. 10 2.2.3.5 Phương pháp transester hóa .............................................................. 10 2.2.4 Các phương pháp thực hiện phản ứng transester hóa điều chế BDF ..... 11 2.2.4.1 Phương pháp hóa học (khuấy – gia nhiệt) ......................................... 11 2.2.4.2 Phương pháp siêu âm ....................................................................... 11 2.2.4.3 Phương pháp vi sóng ........................................................................ 11 2.2.4.4 Phản ứng transester hóa môi trường siêu tới hạn ............................... 12 2.2.5 Các loại xúc tác trong phản ứng transester hóa ......................................... 12 2.2.5.1 Xúc tác bazơ ..................................................................................... 12 2.2.5.2 Xúc tác axit ........................................................................................ 12 2.2.5.3 Xúc tác enzym ................................................................................... 13 2.2.5.4 Xúc tác dị thể .................................................................................... 13 2.2.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới và trong nước ...... 13 2.2.6.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trên thế giới ......................... 13 2.2.6.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BDF trong nước ........................... 14 2.3 Phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase ............................................. 14 2.3.1 Cơ chế phản ứng transester hóa ............................................................... 14 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase . ................................................................................................ 16 2.3.2.1 Nhiệt độ ........................................................................................... 16 2.3.2.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu ....................................................................... 16 2.3.2.3 Tỉ lệ enzym/cơ chất .......................................................................... 17 2.3.2.4 Hàm lượng nước ............................................................................. 17 2.3.2.5 Thời gian phản ứng .......................................................................... 17 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi vi 2.4 Dầu ăn đã qua sử dụng ................................................................................ 17 2.4.1 Nguồn thu nhận.................................................................................... 17 2.4.2 Thành phần hóa học của dầu ăn đã qua sử dụng ................................... 18 2.4.3 Tính chất của dầu ăn đã qua sử dụng .................................................... 18 2.4.4 Ưu và nhược điểm của dầu ăn đã qua sử dụng để sản xuất BDF ........... 19 2.5 Sắc ký lớp mỏng ........................................................................................ 20 Chương 3 THỰC NGHIỆM .................................................................................... 22 3.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị .......................................... 22 3.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................... 22 3.1.2 Hóa chất ............................................................................................... 22 3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................... 22 3.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu ................................................................. 22 3.2.1 Xác định chỉ số axit.............................................................................. 22 3.2.2 Xác định chỉ số xà phòng ..................................................................... 23 3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzym ............................................... 24 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym ................................................. 25 3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính lipase ................................................. 25 3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase.............................. 27 3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ........................................................................... 27 3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ..................................................................... 27 3.3.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt ............................................................... 28 3.3.2.4 Ảnh hưởng của dung môi (metanol và etanol) .................................... 28 3.4 Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase ................................... 29 3.4.1 Quy trình thực hiện .............................................................................. 29 3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transeste hóa xúc tác enzym lipase ...................................................................................................... 30 3.4.2.1 Nhiệt độ ........................................................................................... 30 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu .................................................................. 30 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi vii 3.4.2.3 Tỉ lệ mol metanol/dầu ....................................................................... 31 3.4.2.4 Thời gian phản ứng .......................................................................... 31 3.5 Kiểm tra độ sạch của BDF bằng sắc ký bản mỏng ....................................... 32 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33 4.1 Thành phần nguyên liệu .............................................................................. 33 4.1.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng .............................................................. 33 4.1.2 Hàm lượng protein của enzym ............................................................. 34 4.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase ............. 35 4.2.1 Ảnh hưởng của pH ............................................................................... 35 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ....................................................................... 36 4.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt theo thời gian .......................................... 37 4.2.4 Ảnh hưởng của metanol và etanol ........................................................ 38 4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa ......... 39 4.3.1 Nhiệt độ ............................................................................................... 39 4.3.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu .......................................................................... 40 4.3.3 Lượng enzym xúc tác .......................................................................... 42 4.3.4 Thời gian phản ứng .............................................................................. 44 4.4 Kết luận và kiến nghị .................................................................................. 46 4.4.1 Kết luận ............................................................................................... 46 4.4.2 Kiến nghị ............................................................................................. 46 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số ứng dụng của lipase ........................................................................ 5 Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn ............................................................................. 25 Bảng 4.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng của dầu ..................................................... 33 Bảng 4.2 Hàm lượng protein của enzym Callera Trans LJP30070 ........................... 34 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Mô hình enzym lipase ................................................................................... 3 Hình 2.2 Phản ứng thủy phân triglyxerit của lipase ..................................................... 4 Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp ester của lipase .............................................................. 4 Hình 2.4 Cơ chế xúc tác của enzym lipase trong phản ứng transester hóa ................. 15 Hình 3.1 Sắc ký bản mỏng mỡ cá và sắc ký bản mỏng metyl este ............................. 32 Hình 4.1 Đường chuẩn Albumin ............................................................................... 34 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase ........................ 35 Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase .......... 36 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt theo thời gian của lipase ............................... 37 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính enzym lipase .................................................................................................................................. 38 Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng ............... 39 Hình 4.7 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các nhiệt độ khác nhau ................ 40 Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ mol metanol/dầu đến hiệu suất chuyển hóa metyl este............................................................................................................ 41 Hình 4.9 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các tỉ lệ mol metanol/dầu khác nhau .................................................................................................................................. 41 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng enzym đến hiệu suất chuyển hóa ... 42 metyl este .................................................................................................................. 42 Hình 4.11 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các lượng enzym khác nhau ....... 43 Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa metyl este............................................................................................................ 44 Hình 4. 13 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các thời gian phản ứng khác nhau .............................................................................................................................................44 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Asp : Acid aspartic BDF : Biodiesel BSA : bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò) DO : diesel FAME : Fatty Acid Metyl ester (metyl este) FFA : Free Fatty Acid Glu : Glutamin acid residue Gly : Glycine residue His : Histidine residue HPLC: High Performance Liquid Chromatography ( Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao) OD : optical density (mật độ quang) Ser : Serine residue Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi xi TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI Đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác là enzym Callera Trans LJP30070. Trên cơ sở đó thực hiện phản ứng transeste hóa điều chế Biodiesel từ nguồn dầu ăn đã qua sử dụng xúc tác enzym đạt hiệu quả cao nhất. Kết quả đề tài đã xác định được enzym Callera Trans LJP30070 hoạt động tối ưu với cơ chất là nguồn dầu ăn đã qua sử dụng trong khoảng pH 7÷8, nhiệt độ tối ưu là 70oC, độ bền nhiệt trong khoảng 50÷55oC và enzym bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của cả metanol và etanol. Khi thực hiện phản ứng transeste hóa nguồn dầu ăn đã qua sử dụng với xúc tác enzym Callera Trans LJP30070 ở nhiệt độ 40oC, tỉ lệ mol metanol/dầu là 6:1, lượng enzym là 3% trong thời gian phản ứng là 36 giờ thì hiệu suất chuyển hóa metyl este khá cao và sản phẩm thu được tương đối sạch. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hóa lại thấp hơn hiệu suất ở nhiệt độ 40oC trong 24 giờ khoảng 3,98%. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 1 Chương 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Năng lượng và môi trường sống từ lâu đã trở thành một nhân tố tác động trực tiếp đến sự phát triển kinh tế và xã hội của hầu hết các quốc gia. Trong các nguồn năng lượng hiện nay thì năng lượng hóa thạch vẫn là nguồn năng lượng chủ yếu trong phát triển kinh tế xã hội loài người. Tuy nhiên, với sự phát triển ồ ạt của công nghiệp hóa, hiện đại hóa như ngày nay thì nguồn năng lượng hóa thạch sẽ ngày càng cạn kiệt. Không những thế việc khai thác và sử dụng năng lượng hóa thạch còn gây ra những tác động xấu đến môi trường như hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm môi trường Vì vậy, việc tìm ra một nguồn năng lượng mới thân thiện với môi trường để thay thế cho nguồn năng lượng hóa thạch là hết sức cần thiết.[8] Hiện nay, trên thế giới đã và đang có nhiều công trình nghiên cứu về nguồn năng lượng tái sinh như năng lượng Mặt trời, năng lượng gió, năng lượng thủy triều, năng lượng từ sinh khối để thay thế cho năng lượng hóa thạch. Trong đó đáng chú ý là nguồn năng lượng từ sinh khối mà đặc biệt là Biodiesel (BDF) hay còn gọi là diesel sinh học. Đây là một loại nhiên liệu xanh thân thiện với môi trường và có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu sẵn có như dầu thực vật, mỡ động vật, các phế phẩm nông nghiệp (rơm, cà phê,) Việt Nam là một nước nông nghiệp có nguồn sinh khối dồi dào nên các nhà khoa học nước ta đã và đang bắt tay vào việc nghiên cứu các phương pháp điều chế Biodiesel từ các nguồn nguyên liệu có sẵn này và thu được nhiều kết quả khả quan. Hơn nữa, Biodiesel có thể được điều chế từ dầu mỡ động thực vật nên nếu ta vận dụng nguồn dầu ăn đã qua sử dụng để tổng hợp BDF thì sẽ giảm được chi phí sản xuất và giảm lượng dầu thải gây ô nhiễm môi trường. Đã có nhiều công trình nghiên cứu việc điều chế biodesel từ nguồn dầu ăn đã qua sử dụng bằng nhiều phương pháp khác nhau [10]. Trong đó phương pháp được sử dung phổ biến nhất là phương pháp transester hóa với nhiều loại xúc tác như bazơ, axit, enzym Trong đó, việc thực hiện phản ứng transester hóa xúc tác enzym vẫn còn khá mới. Việc sử dụng xúc tác sinh học so với Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 2 xúc tác hóa học có nhiều ưu điểm hơn như điều kiện phản ứng ôn hòa, không có phản ứng phụ, việc tách pha và thu hồi glyxerol dễ dàng, hiệu xuất phản ứng cao, xúc tác có thể tái sử dụng nhiều lần Với những ưu điểm trên thì việc sử dụng enzym lipase để xúc tác cho phản ứng transester hóa để điều chế Biodiesel là hết sức cần thiết. Chính vì vậy mà đề tài “Khảo sát hoạt tính enzym lipase và phản ứng transester hóa với xúc tác Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng” được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài Xác định các điều kiện tối ưu về hoạt tính của enzym Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng, trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện để thực hiện phản ứng transester hóa xúc tác enzym Callera Trans LJP30070 đạt hiệu suất cao nhất. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1. Khảo sát nguồn nguyên liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase Callera Trans LJP30070 trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng. 2. Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng để điều chế Biodiesel. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 3 Chương 2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Enzym lipase 2.1.1 Định nghĩa Lipase (triacylglycerol acylhydrolase EC.3.1.1.3) là enzym xúc tác thủy phân triglyxerit thành điglyxerit, monoglyxerit hoặc glyxerol và các axit béo tiếp diện phân pha dầu nước. Chúng hiện diện rông rãi trong tự nhiên (chiếm 5% trong thị phần enzym thế giới, chỉ đứng sau rotease và cacbohydrat).[17] 2.1.2 Cấu trúc lipase Hình 2.1 Mô hình enzym lipase Cấu trúc chung enzym lipase gồm một phiến β ở giữa các nhóm serin hoạt động. Trung tâm hoạt động là bộ ba Ser, His và Asp (hoặc Glu). Trên serin là một khe kỵ nước được hình thành sau hoạt hóa. Cấu trúc ba chiều của lipase đều theo một kiểu chung, trong nếp gấp α, β của enzym có 8 liên kết β song song, chủ yếu được bao quanh bởi xoắn α. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ axit amin. Trong hầu hết cấu Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 4 trúc lipase, đầu serin hoạt động trong chuỗi pentapeptit có trình tự Gly–X1–Ser–X2 – Gly [10],[17] 2.1.3 Cơ chế phản ứng của lipase [14],[15] Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng hóa học khác nhau, trong đó được quan tâm nhiều nhất là phản ứng thủy phân và phản ứng tổng hợp este. COOR2 COOR1 COOR3 COOR2 COOH COOR3 COOH COOH COOR3 COOH COOH COOH R1COOH R2COOH R3COOH Triglyxerit Diglyxerit Monoglyxerit Glyxerol lipase lipase lipase Axit béo Axit béo Axit béo Hình 2.2 Phản ứng thủy phân triglyxerit của lipase R1COOH +R2OH R1COOR2 +H2O lipase Hình 2.3 Phản ứng tổng hợp ester của lipase Lipase không tan trong các dung môi không phân cực (dầu) mà chỉ tan trong nước và các dung môi phân cực. Do đó, lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách hai pha dầu-nước, nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính lipase. Để khắc phục hiện tượng này người ta có thể tăng diện tích tiếp xúc bằng cách tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa thích hợp. 2.1.4 Nguồn thu nhận lipase ...ới phenolphthalein làm chất chỉ thị. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 23 b) Tiến hành Dùng erlen 100ml cho vào 5ml cồn tuyệt đối + 5ml đietyl ete (tỉ lệ 1:1), cho thêm 2 – 3 giọt phenolphthalein và dùng dung dịch KOH 0,01N trong ancol để trung hòa hỗn hợp trên đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sau đó thêm vào hỗn hợp vừa trung hòa 0,5g dầu tương ứng. Tiếp tục chuẩn độ hỗn hợp này bằng dung dịch KOH 0,01N trong ancol cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong 30 giây. Đọc thể tích trên buret. Mỗi mẫu dầu 3 lần lặp lại và lấy giá trị thể tích trung bình.  Tính chỉ số axit Công thức tính chỉ số axit: a a 0,56C m   Trong đó: Ca: chỉ số axit a: thể tích KOH đọc trên buret (ml) m: khối lượng dầu đã dùng (g) 3.2.2 Xác định chỉ số xà phòng a) Nguyên tắc Dùng KOH để trung hòa lượng axit béo tự do và thủy giải ester có trong 1 gam chất béo bằng chỉ thị phenolphtalein. b) Tiến hành Cho vào erlen 100ml 0,3 gam dầu ăn đã qua sử dụng và 6ml KOH 0,5N trong etanol. Đun hoàn lưu trong 45 phút. Sau đó để nguội. Cho thêm vào mỗi erlen 2ml nước cất và 3 giọt phenolphthalein, lắc đều. Chuẩn độ erlen bằng dung dịch HCl 0,5N đến khi mất màu hồng. Tiến hành 3 lần để lấy giá trị trung bình. Tiến hành song song mẫu trắng (mẫu không có dầu) để so sánh.  Tính chỉ số xà phòng: a b x (V V ).0,28C m   Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 24 Trong đó: Cx: chỉ số xà phòng Va: thể tích KOH sử dụng ban đầu (ml) Vb: thể tích HCl đọc trên buret (ml) m: khối lượng dầu sử dụng (g) 3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzym [6] a) Nguyên tắc Hàm lượng protein trong enzym được xác định bằng phương pháp Lowry dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg protein. Phương pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc Tyrosin, Trytophan, Hystidin để tạo phức màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750 nm và dựa vào đường chuẩn Protein để xác định hàm lượng protein có trong mẫu. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein. Dựa vào hàm lượng protein có trong enzym để xác định hoạt tính riêng của enzym. b) Tiến hành  Chuẩn bị hóa chất Pha các dung dịch sau: - Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N - Dung dịch B1: CuSO4 1% - Dung dịch B2: Kali – natri tartrat 2% - Dung dịch C = B1:B2:A = 0,5:0,5:50 - Dung dịch BSA gốc 1mg/ml pha trong H2O  Xây dựng đường chuẩn BSA Xây dựng đường chuẩn với các nồng độ BSA khác nhau theo bảng sau: Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 25 Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn Nồng độ (µg/ml) 0 40 80 120 160 200 240 280 320 V BSA( µl) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 V H2O (µl) 500 480 460 440 420 400 380 360 340 V dd C (ml ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 V TT Folin 1N (µl) 250 250 250 250 250 250 250 250 250 Để yên 30 phút. Tiến hành đo các nồng độ ở bước sóng 750 nm.  Tiến hành đo mẫu phân tích. Tiến hành đo mẫu phân tích tương tự như đo các mẫu ở đường chuẩn. Phân tích kết quả dựa trên đường chuẩn đã xây dựng. Mỗi mẫu phân tích 3 lần lập lại và lấy kết quả trung bình.  Tính kết quả Công thức tính hàm lượng protein trong 1ml dung dịch enzym : P= x . k . 10-3 (mg protein/ml) Với : P : hàm lượng protein có trong 1ml dung dịch enzym mẫu (mg protein/ml). x : Nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (µg/ml). k : Hệ số pha loãng. 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 3.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính lipase a) Nguyên tắc Hoạt tính enzym lipase được xác định bằng phương pháp định lượng bằng dung dịch NaOH lượng axit béo tự do tạo ra với cơ chất là dầu ăn đã qua sử dụng được nhũ hóa . Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 26 b) Tiến hành  Chuẩn bị - Nhũ hóa dầu : Cho vào cốc thủy tinh 500ml : 10 gam dầu ăn đã qua sử dụng + 7,5 gam gum arabic + 60ml dung dịch đệm photphat. Sau đó đánh tan hỗn hợp bằng máy đồng hóa với số vòng 800÷900 vòng/phút trong 15÷20 phút. Hỗn hợp này được sử dụng khi nó không bị phân thành hai lớp sau khi bảo quản trong 1 giờ và ổn định trong 2 ngày ở nhiệt độ 5oC÷10oC. - Dung dịch enzym pha loãng trong dung dịch đệm. - Dung dịch NaOH 0,1N - Thymolphtalein 0,1%  Tiến hành Cho 5ml dầu thực vật đã được nhũ hóa vào erlen 50ml, rồi ổn định nhiệt độ dầu trong erlen trên bể điều nhiệt có gắn hệ thống lắc ở nhiệt độ thích hợp khoảng 15 phút. Sau đó thêm 1ml dung dịch enzym đã pha loãng. Lắc đều hỗn hợp trên bể điều nhiệt có gắn hệ thống lắc. Tiến hành phản ứng trong 1 giờ. Trong suốt thời gian phản ứng phải giữ cho pH môi trường luôn ổn định. Sau 1 giờ phản ứng, cho vào hỗn hợp 10ml cồn tuyệt đối để dừng phản ứng. Sau đó chuẩn độ hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị Thymolphtalein 0,1%. Tiến hành song song mẫu đối chứng (mẫu trắng).  Tính toán Một đơn vị hoạt tính lipase (U) định nghĩa là lượng enzym xúc tác để giải phóng một micromol (µmol) axit béo trong một giờ phản ứng với các điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính lipase (U/ml) được tính theo công thức : A = [(a-b) x 1000 x 0,1] (U/ml) Trong đó : A : Hoạt tính lipase (U/ml). a : thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ ở mẫu có enzym (ml). Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 27 b : thể tích NaOH 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng ( mẫu không có enzym) (ml)  Hoạt tính riêng của enzym lipase Hoạt tính riêng của enzym lipase được tính theo công thức : AR = A P (U/mg protein) Trong đó : AR : Hoạt tính riêng của enzym lipase (U/mg protein). A : Hoạt tính lipase (U/ml) P : Hàm lượng protein trong 1ml dịch enzym mẫu (mg protein/ml). 3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase 3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH a) Mục đích : Xác định giá trị pH tối ưu của enzym lipase. b) Tiến hành thí nghiệm Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym ở các mức độ pH :6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9 Mỗi giá trị pH lặp lại 3 lần. Với mỗi nghiệm thức pH, enzym được pha loãng trong dung dịch đệm ở pH tương ứng. Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym tương tự mục 3.3.1. Phản ứng được tiến hành trong 1 giờ ở 40oC. Trong suốt thời gian phản ứng giữ pH môi trường luôn ổn định ứng với giá trị pH đang khảo sát. c) Chỉ tiêu đánh giá : Đơn vị hoạt tính của lipase (U/mg protein). 3.3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ a) Mục đích : Xác định giá trị nhiệt độ tối ưu của enzym. b) Tiến hành thí nghiệm Tiến hành khảo sát hoạt tính enzym ở các giá trị nhiệt độ :35oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC, 75oC, 80oC .Mỗi nhiệt độ lặp lại 3 lần. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 28 Tiến hành khảo sát tương tự mục 3.3.1.Tuy nhiên, enzym được pha loãng trong dung dịch đệm ở pH tối ưu của enzym. Giá trị pH được chọn từ thí nghiệm 3.3.2.1 Phản ứng được tiến hành trong 1 giờ ở từng giá trị nhiệt độ khảo sát. Trong suốt thời gian phản ứng luôn giữ cho pH môi trường luôn ổn định. c) Chỉ tiêu đánh giá : Đơn vị hoạt tính của lipase (U/mg protein). 3.3.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt a) Mục đích : Khảo sát độ bền nhiệt của lipase theo thời gian. b) Tiến hành thí nghiệm : Thí nghiệm 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố 1 : nhiệt độ : 50, 55, 60, 65oC. Nhân tố 2 : thời gian 3, 5, 7, 11, 15, 24 giờ. Số nghiệm thức là 24, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tiến hành khảo sát tương tự mục 3.3.1 và giá trị pH được chọn từ thí nghiệm 3.3.2.1. Ở mỗi nhiệt độ (nhân tố 1) thì lần lượt thực hiện phản ứng trong 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 11 giờ, 15 giờ, 24 giờ trên bể điều nhiệt có gắn hệ thống lắc.Trong suốt thời gian phản ứng phải luôn giữ cho pH môi trường ổn định. c) Chỉ tiêu đánh giá : Đơn vị hoạt tính của lipase (U/mg protein). 3.3.2.4 Ảnh hưởng của dung môi (metanol và etanol) a) Mục đích : Khảo sát ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính lipase. b) Tiến hành thí nghiệm : Thí nghiệm 2 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố 1 : Dung môi metanol hay etanol. Nhân tố 2 : Tỉ lệ mol giữa dung môi và dầu : 0:1; 3:1; 4:1; 5:1; 6:1; 12:1; 14:1; 16:1 Lần lượt tiến hành các thí nghiệm : Thí nghiệm TN1 : thêm enzym trực tiếp với metanol ở các tỉ lệ mol khác nhau giữa metanol và dầu. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 29 Thí nghiệm TN2 : thêm enzym trực tiếp với etanol ở các tỉ lệ mol khác nhau giữa etanol và dầu. Thí nghiệm TN3 : enzym được ủ với metanol trong 15 phút ở các tỉ lệ mol giữa metanol và dầu khác nhau. Thí nghiệm TN4 : enzym được ủ với etanol trong 15 phút ở các tỉ lệ mol giữa etanol và dầu khác nhau. Tiến hành khảo sát tương tự mục 3.3.1 và giá trị pH được chọn từ thí nghiệm 3.3.2.1, nhiệt độ phản ứng được chọn từ thí nghiệm 3.3.2.2. Mỗi nghiệm thức thực hiện phản ứng trong 1 giờ, lặp lại 3 lần và trong suốt thời gian phản ứng luôn giữ cho pH môi trường ổn định. c) Chỉ tiêu đánh giá : Hoạt tính còn lại (%) Kết quả xác định hoạt tính còn lại (%) của các nghiệm thức có dung môi so với các nghiệm thức không bổ sung dung môi (100%) tương ứng ở từng thí nghiệm. 3.4 Khảo sát phản ứng transester hóa xúc tác enzym lipase 3.4.1 Quy trình thực hiện Bước 1 : Cân chính xác 15 gam dầu ăn đã qua sử dụng vào erlen 250ml, thêm dung dịch glyxerol 20% và một lượng enzym cần thiết vào. Đặt erlen lên bể điều nhiệt để hoạt hóa enzym khoảng 30 phút. Bước 2 : Cho tiếp vào erlen một lượng metanol thích hợp rồi đem gắn hỗn hợp phản ứng vào hệ thống đun hoàn lưu, gia nhiệt và khuấy từ trong một khoảng thời gian thích hợp. Bước 3 : Sau khi thực hiện phản ứng xong, để nguội hỗn hợp rồi cho vào bình lóng, để hỗn hợp lắng trong bình trong một khoảng thời gian (thực tế thời gian lắng khoảng 3-4 giờ). Hỗn hợp phản ứng được tách thành 3 pha : pha nhẹ nằm trên cùng là metyl este, tiếp đến là pha nhũ có chứa phần lớn enzym dư và cuối cùng là pha chứa glyxerol, metanol dư và nước. Sau đó tiến hành chiết ta thu được metyl este thô. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 30 Bước 4 : Tiến hành rửa sản phẩm nhiều lần bằng nước ấm. Sau đó làm khan nước có lẫn trong sản phẩm bằng Na2SO4 khan trong khoảng 12 giờ. Sản phẩm sau khi làm khan nước bằng Na2SO4 được tiến hành làm khô bằng silicagen để thu được metyl este tinh khiết. Bước 5 :Đánh giá độ tinh khiết của metyl este thu được bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 có kích thước hạt từ 10 - 40µm, Sbm = 200 – 400 m2/g, pha động là hệ giải ly ete dầu hỏa : triclometan = 3 :2 Chất hiện màu là hơi iốt. 3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transeste hóa xúc tác enzym lipase 3.4.2.1 Nhiệt độ Tiến hành thí nghiệm theo các bước ở mục 3.4.1 và cố định các yếu tố như sau : Các yếu tố cố định Giá trị Khối lượng dầu đã qua sử dụng 15 gam Thời gian phản ứng 24 giờ Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu 3,5% Tỉ lệ mol metanol/dầu 6 : 1 Tỉ lệ % (v/w) glyxerol/dầu 20% Tốc độ khuấy 300÷400 vòng/phút Thay đổi nhiệt độ phản ứng với các giá trị sau : 35oC, 40oC, 45oC, 50oC,55oC, 60oC. 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu Tiến hành thí nghiệm theo các bước ở mục 3.4.1 và cố định các yếu tố như sau : Các yếu tố cố định Giá trị Khối lượng dầu đã qua sử dụng 15 gam Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 31 Thời gian phản ứng 24 giờ Nhiệt độ Chọn từ thí nghiệm 3.4.2.1 Tỉ lệ mol metanol/dầu 6 : 1 Tỉ lệ % (v/w) glyxerol/dầu 20% Tốc độ khuấy 300÷400 vòng/phút Thay đổi tỉ lệ (v/w) enzym/dầu với các giá trị 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. 3.4.2.3 Tỉ lệ mol metanol/dầu Tiến hành thí nghiệm theo các bước ở mục 3.4.1 và cố định các yếu tố như sau : Các yếu tố cố định Giá trị Khối lượng dầu đã qua sử dụng 15 gam Thời gian phản ứng 24 giờ Nhiệt độ Chọn từ thí nghiệm 3.4.2.1 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu Chọn thừ thí nghiệm 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) glyxerol/dầu 20% Tốc độ khuấy 300÷400 vòng/phút Thay đổi tỉ lệ mol metanol/dầu với các tỉ lệ 3 :1 , 6 :1 , 9 :1, 12 :1. 3.4.2.4 Thời gian phản ứng Tiến hành thí nghiệm theo các bước ở mục 3.4.1 và cố định các yếu tố như sau : Các yếu tố cố định Giá trị Khối lượng dầu đã qua sử dụng 15 gam Tỉ lệ mol metanol/dầu Chọn thừ thí nghiệm 3.4.2.3 Nhiệt độ Chọn từ thí nghiệm 3.4.2.1 Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 32 Tỉ lệ % (v/w) enzym/dầu Chọn thừ thí nghiệm 3.4.2.2 Tỉ lệ % (v/w) glyxerol/dầu 20% Tốc độ khuấy 300÷400 vòng/phút Thay đổi thời gian phản ứng với các giá trị 24giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ. Chỉ tiêu đánh giá các yếu tố : Hiệu suất chuyển hóa tính từ khối lượng metyl este và độ sạch sản phẩm bằng sắc ký bản mỏng. 3.5 Kiểm tra độ sạch của BDF bằng sắc ký bản mỏng Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng để đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm với pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 có kích thước hạt từ 10 - 40µm, Sbm = 200 – 400 m2/g, pha động là hệ giải ly ete dầu hỏa : triclometan = 3 :2. Chất hiện màu là hơi iốt. Tiến hành : Cho vào cốc thủy tinh có nắp đậy hỗn hợp ete dầu hỏa và triclometan. Cho bản sắc ký đã chấm mẫu vào cốc đựng dung môi giải ly đã bão hòa. Chú ý không cho dung môi ngập điểm chấm mẫu. Khi thấy dung môi thấm gần hết bản sắc ký (cách khoảng 0,5 cm) thì lấy bản sắc ký ra sấy khô. Cho vài tinh thể iốt vào cốc 500ml có nắm đậy, đặt tấm sắc ký bản mỏng vào với mặt nhôm hướng xuống dưới. Kết quả : dầu ăn cho vệt hình oval màu vàng nâu, còn BDF cho vệt hình tròn màu vàng nâu trên bản sắc ký. Nếu vệt chấm mẫu chứa BDF kéo dài, không thành vết tròn rõ ràng chứng tỏ trong mẫu vẫn còn chứa dầu ăn, mẫu chưa sạch. Hình 3.1 Sắc ký bản mỏng mỡ cá và sắc ký bản mỏng metyl este Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 33 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thành phần nguyên liệu 4.1.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng Bảng 4.1 Chỉ số axit và chỉ số xà phòng của dầu Dầu Chỉ tiêu Chỉ số axit (mg KOH/1 gam) Chỉ số xà phòng (mg KOH/1 gam) Dầu ăn đã qua sử dụng 2,55 197,87 Dầu chợ 0,48 - - Dựa vào kết quả bảng 4.1 ta thấy chỉ số axit của dầu ăn đã qua sử dụng lớn gấp 5,3 lần chỉ số axit của dầu chợ. Điều này chứng tỏ hàm lượng axit béo tự do trong dầu ăn đã qua sử dụng khá cao. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy khi chỉ số axit của dầu dưới 5 thì ảnh hưởng của nó đến phản ứng điều chế BDF là không đáng kể. Do vậy khi sử dụng nguồn dầu ăn này không cần tiến hành các biện pháp hạ chỉ số axit. - Xác định phân tử khối trung bình của dầu ăn đã qua sử dụng. Từ chỉ số xà phòng tính được lượng KOH phản ứng với este và axit béo tự do là 197,87 mg KOH (3,53334 mmol). Từ chỉ số axit suy được lượng KOH phản ứng với axit béo tự do là 0,045 mmol. Kết hợp hai dữ kiện trên tính được số mol este là 1,1626 mmol. Từ đó tính được RM 225,52 g/mol và suy được khối lượng mol phân tử trung bình của dầu ăn đã qua sử dụng khoảng 849,56 g/mol. Dựa vào kết quả này để tính hiệu suất chuyển hóa và tỉ lệ mol giữa dầu và các dung môi trong quá trình khảo sát các thí nghiệm. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 34 4.1.2 Hàm lượng protein của enzym Hàm lượng protein trong enzym Callera Trans LJP30070 được xác định bằng phương pháp Lowry. Hàm lượng protein được suy ra từ phương trình đường chuẩn BSA với protein chuẩn là albumin huyết thanh bò. y = 0,0022x + 0,0028 R2 = 0,9986 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (µg/ml) O D 75 0 nm Hình 4.1 Đường chuẩn Albumin Đường chuẩn có hệ số gốc là 0,0022 và độ tin cậy R2 là 0,9986. Căn cứ vào đường chuẩn hàm lượng protein được suy ra từ công thức : y = 0,0022x + 0,0028 Kết quả tính nồng độ protein từ đường chuẩn được trình bày trong bảng sau. Bảng 4.2 Hàm lượng protein của enzym Callera Trans LJP30070 Mẫu OD 750 Nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ BSA trung bình (µg/ml) 1 0,347 156,455 156,606 2 0,345 155,545 3 0,350 157,818 Từ kết quả trên tính được hàm lượng protein trong enzym Callera Trans LJP30070 là 31,321 (mg protein/ml). Hàm lượng protein khá cao vì thế khi thực hiện phản ứng cần chú ý đến các yếu tố làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 35 4.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym lipase 4.2.1 Ảnh hưởng của pH pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzym. Vì thế, khi thực hiện phản ứng xúc tác enzym cần xác định giá trị pH để enzym đạt hoạt tính cao nhất (pH tối ưu). Việc khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase Callera Trans để sử dụng enzym này trong tổng hợp BDF là rất cần thiết. Kết quả khảo sát được thể hiện trong hình 4.2. 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 pH H o ạt t ín h r iê n g (U / m g p ro te in ) Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase Từ đồ thị kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH cho thấy enzym Callera Trans hoạt động tốt trong khoảng pH từ 7 đến 8 và mạnh nhất ở pH = 7,5 (1759,20 U/mg protein). Khi pH môi trường là 9 thì hoạt tính của enzym giảm 630,22 (U/mg protein). Vì thế khi thực hiện phản ứng transester tiến hành ở pH = 7,5 và chọn giá trị pH này để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác trong đề tài. Kết quả nghiên cứu của tác giả Adriano.A và cộng sự [1] cũng cho kết quả tương tự như trên. Khi khảo sát lipase từ chủng Thermomyces lanuginosus trên cơ chất dầu olive cũng có pH tối ưu thuộc khoảng 7÷8. Hay nghiên cứu của Brenda.R và cộng sự sử dụng enzym lipase từ chủng Thermomyces lanuginosus được cố định trên PVA- alginate có pH tối ưu là 7 trên cơ chất p-nitrophenol plamitic. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 36 4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ Tương tự như pH thì nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzym. Mỗi enzym có một giá trị nhiệt độ tối ưu, tại nhiệt độ này hoạt tính của enzym là cao nhất, vượt quá nhiệt độ này enzym bị biến tính, khả năng xúc tác giảm và có thể triệt tiêu. Vì thế khi thực hiện phản ứng transester hóa xúc tác enzym cần xác định được giá trị nhiệt độ tối ưu của enzym. Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzym ở các khoảng nhiệt độ từ 35oC đến 80oC để chọn nhiệt độ tối ưu của enzym. Kết quả khảo sát được trình bày trong hình 4.3. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Nhiệt độ(ºC) H oạ t tí nh r iê ng ( U / m g pr ot ei n) Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase Dựa vào đồ thị nhận thấy hoạt tính enzym tại nhiệt độ 70oC (2876,35 U/mg protein) là cao nhất. Nhưng nhìn chung thì hoạt tính của enzym khá cao trong khoảng nhiệt độ 60oC đến 75oC. So với enzym lipozyme TL100L[19] bị ức chế trong khoảng nhiệt độ 70÷75oC thì enzym Callera Trans LJP30070 hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ này. Nhận thấy enzym Callera Trans có khả năng chịu nhiệt cao, nên việc sử dụng enzym này trong việc thực hiện phản ứng transeste hóa thuận lợi hơn enzym Lipozyme TL100L. Từ kết quả trên chọn nhiệt độ 70oC làm nhiệt độ tối ưu của enzym và sử dụng để khảo sát các yếu tố còn lại. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 37 4.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt theo thời gian Ngoài giá trị nhiệt độ tối ưu thì hoạt tính của mỗi enzym còn phụ thuộc vào khả năng bền nhiệt theo thời gian. Phản ứng transester hóa xúc tác enzym để thu được hiệu suất cao thì cần thực hiện trong khoảng thời gian khá dài. Vì thế, việc khảo sát độ bền nhiệt của enzym Callera Trans để sử dụng enzym này trong tổng hợp BDF bằng phản ứng transester hóa là hết sức cần thiết. Tiến hành khảo sát độ bền nhiệt của enzym tại các nhiệt độ 50, 55, 60, 65oC vào các khoảng thời gian 3, 5, 7, 11, 15, 24 giờ. Kết quả được thể hiện ở hình 4.4 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 1 5 9 13 17 21 25 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h ri ên g (U / m g pr ot ei n) 50ºC 55ºC 60ºC 65ºC Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn độ bền nhiệt theo thời gian của lipase Dựa vào đồ thị kết quả nhận thấy khi kéo dài phản ứng đến 15 giờ thì nhìn chung ở các nhiệt độ hoạt tính của enzym đều tăng. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian phản ứng lên 24 giờ thì hoạt tính enzym ở nhiệt độ 50oC (tăng 412,33 U/mg protein) và 55oC (tăng 210,08 U/mg protein) so với hoạt tính ở 15 giờ phản ứng đều tăng, nhưng khi nhiệt độ tăng lên 60 oC (giảm 116,22 U/mg protein), 65oC (giảm 15,64 U/mg protein) thì hoạt tính enzym bắt đầu giảm. Nguyên nhân là khi kéo dài thời gian phản ứng ở nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính, các liên kết hiđro trong cấu trúc của enzym bị gãy. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 38 Nhận thấy, enzym Callera Trans hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ 70oC nhưng khi kéo dài thời gian phản ứng trong 24 giờ thì enzym lại bền và hoạt tính lại khá cao trong khoảng nhiệt độ 50 đến 55oC. Do phản ứng transester hóa xúc tác enzym Callera Trans được tiến hành trong thời gian khá dài (trên 24 giờ) nên để đạt hiệu suất phản ứng cao cần thực hiện phản ứng trong khoảng nhiệt độ 50÷55oC. 4.2.4 Ảnh hưởng của metanol và etanol Hoạt tính của enzym còn chịu ảnh hưởng bởi lượng metanol và etanol. Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của hai dung môi này đến hoạt tính enzym lipase trong quá trình thực hiện phản ứng transester hoá cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính lipase. Kết quả khảo sát được trình bày ở hình 4.5 0 20 40 60 80 100 120 0:1 3:1 4:1 5:1 6:1 12:1 14:1 16:1 Tỉ lệ mol dung môi/ dầu H oạ t t ín h lip as e (% ) TN1 TN2 TN3 TN4 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của metanol và etanol đến hoạt tính enzym Dựa vào đồ thị nhận thấy rằng khi ủ enzym (TN3 và TN4) trước khi thực hiện phản ứng thì hoạt tính enzym thấp hơn so với thực hiện phản ứng trực tiếp (TN1 và TN2). Mặt khác, etanol làm giảm hoạt tính của enzym hơn metanol và khi tỉ lệ dung môi/dầu trên 5 :1 thì hoạt tính enzym bắt đầu giảm. Kết quả này cũng khá giống với nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Lê Sỹ Thanh và Quyền Đình Thi khi khảo sát ảnh hưởng của metanol và etanol lên hoạt tính lipase chủng Geotrichum sp.DTQ – 26.3. Vì thế, khi thực hiện phản ứng transester hoá xúc tác enzym thì không nên ủ enzym trước khi cho phản ứng và sử dụng metanol thì hoạt tính enzym cao hơn đồng thời nên chia nhỏ lượng metanol thêm vào phản ứng để không làm bất hoạt enzym. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 39 4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng transester hóa 4.3.1 Nhiệt độ Dù ta đã xác định được nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của enzym nhưng khi thực hiện phản ứng transester hóa cần khảo sát lại ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng. Vì trong quá trình thực hiện phản ứng hoạt tính enzym chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác. Tiến hành thực hiện phản ứng transester hóa ở các nhiệt độ khác nhau để xác định nhiệt độ mà hiệu suất phản ứng là cao nhất. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 4.6 và 4.7 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Nhiệt độ(ºC) H oạ t tí nh r iê ng ( U / m g pr ot ei n) Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 40 Hình 4. 7 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các nhiệt độ khác nhau Từ số liệu thực nghiệm thu được kết hợp với hình 4.6 và 4.7 nhận thấy hiệu suất phản ứng tại 40 oC (43,4%) và 45oC (41,14%) khá cao và sản phẩm thu được cũng khá sạch. Tuy nhiên, khi nâng dần nhiệt độ phản ứng lên khoảng 50, 55 hay 60oC thì hiệu suất phản ứng giảm dần và thấp nhất ở 60oC (9,49%). Nguyên nhân có thể giải thích là do khi nhiệt độ phản ứng cao làm biến tính enzym nên hiệu suất phản ứng thấp. Đồng thời ở nhiệt độ quá cao metanol dễ bay hơi, nếu quá trình làm lạnh và ngưng tụ không tốt sẽ làm thất thoát metanol làm giảm hiệu suất phản ứng. Mặc khác, dựa vào bản sắc ký nhận thấy sản phẩm thu được ở 40 và 45oC đều sạch. Nhưng do hiệu suất chuyển hóa ở 40oC cao hơn so với 45oC (khoảng 3%) nên chọn 40oC là nhiệt độ tối ưu để thực hiện phản ứng transeste hóa xúc tác enzym Callera Trans trên nguồn dầu ăn đã qua sử dụng. 4.3.2 Tỉ lệ mol metanol/dầu Tỉ lệ mol metanol/dầu ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phản ứng transeste hóa xúc tác enzym. Do metanol là dung môi chính được sử dụng và enzym bị biến tính khi lượng metanol quá nhiều. Vì thế, khi thực hiện phản ứng transeste hóa xúc tác enzym sử dụng dung môi metanol thì cần chọn tỉ lệ mol metanol/dầu sau cho phù hợp để hiệu suất phản ứng là cao nhất. Thí nghiệm khảo sát được tiến hành ở các tỉ lệ mol metanol/dầu khác nhau. Kết quả khảo sát được ghi nhận ở hình 4.8 và 4.9. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 41 0 10 20 30 40 50 60 3:1 6:1 9:1 12:1 Tỉ lệ mol metanol/dầu H iệ u s u ất c h u yể n h ó a( % ) Hình 4. 8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ mol metanol/dầu đến hiệu suất chuyển hóa metyl este Hình 4.9 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các tỉ lệ mol metanol/dầu khác nhau Căn cứ vào hình 4.8 và 4.9 trên ta nhận thấy: Khi tăng dần tỉ lệ mol metanol/dầu thì hiệu suất phản ứng giảm dần. Mặc dù, ở tỉ lệ mol 3:1 hiệu suất phản ứng là cao nhất (52,49%) nhưng bản sắc ký lại cho thấy sản phẩm thu được không sạch. Có thể giải thích là do lượng metanol không đủ để chuyển hóa lượng dầu có trong mẫu. Phản ứng transeste hóa là phản ứng thuận nghịch và nhiệt độ phản ứng khá cao nên cần sử dụng lượng dư metanol để tăng hiệu suất phản ứng. Tuy nhiên, khi tăng dần tỉ lệ metanol thì hiệu suất phản ứng ở các tỉ lệ 6:1 (37,89%), 9:1 (23,76%) và Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 42 12:1 (20,7%) giảm dần. Nguyên nhân là do khi lượng metanol quá nhiều, khả năng tiếp xúc trực tiếp của enzym với metanol càng lớn enzym càng dễ bị mất hoạt tính xúc tác, làm giảm hiệu suất phản ứng. Vì thế cần chọn tỉ lệ mol metanol/dầu sao cho hiệu suất phản ứng cao nhất và có tính kinh tế. Dựa vào đồ thị và kết quả bản sắc ký đề tài quyết định chọn tỉ lệ là 6:1 là tỉ lệ mol metanol/dầu tối ưu để thực hiện phản ứng transeste hóa. 4.3.3 Lượng enzym xúc tác Một yếu tố ảnh hưởng không chỉ đến hiệu suất phản ứng transeste hóa mà còn có giá thành của sản phẩm chính là lượng enzym xúc tác. Do vậy cần tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lượng enzym xúc tác đến hiệu suất phản ứng transeste hóa. Kết quả ghi nhận ở hình 4.10 và 4.11 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 5 Tỉ lệ enzym (v/w ) H iệ u su ất c hu yể n h ó a (% ) Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng enzym đến hiệu suất chuyển hóa metyl este Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 43 Hình 4.11 Sắc ký bản mỏng sản phẩm metyl este ở các lượng enzym khác nhau Căn cứ vào hình 4.10 và 4.11 trên nhận thấy hiệu suất chuyển hóa với lượng enzym là 1% (8,96%) và 2% (13,93%) thấp, phản ứng xảy ra không hiệu quả. Khi tăng dần lượng enzym xúc tác 3÷5% thì hiệu suất phản ứng tăng và đạt cực đại tại 3% (39,42%). Hiệu suất phản ứng tại 4%(37,29%) và 5% (38,75%) khá cao nhưng thấp hơn so với 3%. Nguyên nhân có thể giải thích do hàm lượng nước sử dụng không đủ để hòa tan enzym, làm lượng enzym trong dung dịch cao khi tiếp xúc với metanol dễ bị mất hoạt tính, làm giảm hiệu suất phản ứng. Nên chọn lượng enzym là 3% là lượng enzym tối ưu để thực hiện phản ứng transeste hóa. So với enzym Lipozyme TL100L[19], để đạt được hiệu suất chuyển hóa khoảng 39% thì lượng enzym lipozyme cần dùng là 6% trong khi enzym Callera Trans chỉ cần khoảng 3%. Như vậy việc sử dụng enzym Callera Trans có hiệu quả kinh tế cao hơn. Tuy nhiên cần tiến hành các biện pháp nhằm năng cao hiệu suất phản ứng để hiệu quả sử dụng là tốt nhất. Một số nghiên cứu gần đây cho biết khi tiến hành phản ứng với xúc tác enzym để hiệu suất phản ứng là cao nhất cần cố định enzym trên chất mang thích hợp. Vì khi ở dạng tự do thì bề mặt tiếp xúc của enzym và cơ chất chưa tốt đồng thời ở dạng tự do enzym dễ dàng bị mất hoạt tính do tiếp xúc trực tiếp với metanol. Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Phan Thị Bích Trâm SVTH: Võ Thị Tú Nhi 44 4.3.4 Thời gian phản ứng Thời gian phản ứng là một yếu tố khá quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Để hiệu suất phản ứng transeste hóa cao cần thực hiện trong thời gian dài. Tuy nhiên do thời gian thí nghiệm có giới hạn nên đề tài chỉ tiến hành khảo sát phản ứng đến 36 giờ. Kết quả khảo sát được ghi nhận ở hình 4.12 và 4.13 36 37 38 39 40 24 28 32 36 H iệ u s u ất c hu yể n hó a (% ) Thời gian phản ứng (giờ) Hình 4.11 Đồ thị bi