Luận văn Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của begomovirus hại ớt

ình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Hà Thị Thủy LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, khuyến khích em nỗ lực trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm. Em xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Hà Thị Thủy MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxynucleoside triphosphate dsDNA Double strand DNA E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Itergenic region Kb Kilo base LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RCA Rolling circle amplification RE Restriction enzyme Rep Replication protein RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SsDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic Vir Virulence region β- ME Beta- Mercaptoethanol ChiVMV Chilli veinal mottle virus CMV Cucumber mosaic virus PMMoV Pepper mild mottle virus PepMoV Pepper mottle virus PVMV Pepper veinal mottle virus PepYMV Pepper yellow mottle virus TMV Tobacco mosaic virus TYLCTHV Tomato yellow leaf curl Thailand virus TYLCVs Tomato yellow leaf curl viruses DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Diện tích, năng suất ớt trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 6 Bảng 1.2. Sản lượng ớt ở một số nước trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 6 Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus ớt (Viện DSMZ) 33 Bảng 4.1. Triệu chứng virus trên ớt. 36 Bảng 4.2. Mức độ xuất hiện các triệu chứng virus trên ớt ở các giai đoạn khác nhau ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017 38 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA 41 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 42 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 43 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 44 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 45 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 46 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 47 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA 49 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 50 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 51 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 52 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 53 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 54 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA 56 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 57 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 59 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 60 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) 60 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA 62 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp) 63 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp) 64 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp) 65 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp) 66 Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1 68 Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1 70 Bảng 4.11. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cây cà chua và thuốc lá cảnh N. benthamiana 75 Bảng 4.12. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cà chua và thuốc lá N. benthamiana 76 Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra các mẫu cà pháo nguồn bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu VNP93–A-F1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B–F1/R2 77 Bảng 4.14. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên ớt, cà chua và một số cây chỉ thị 77 Bảng 4.15. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào XL1 Blue bằng xung điện 78 Bảng 4.16. Kết quả giải trình tự bổ sung mẫu PepYLCVNV (VNP1500) 79 Bảng 4.17. Đặc điểm phân tử DNA-A của mẫu PepYLCVNV VNP1500 83 Bảng 4.18. Đặc điểm phân tử DNA-B của mẫu PepYLCVNV VNP1500 84 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái phân tử geminiviruses 14 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus 15 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của begomovirus 16 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của begomovirus 16 Hình 2.5. Khối u do A.tumerfaciens gây ra 24 Hình 2.6. Quá trình lây nhiễm của Ti Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây 24 Hình 3.1. Nuôi bọ phấn trong lồng cách lilồng cách li chế tạo từ chai cocacola 32 Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh virus trên ớt tại các điểm điều tra 36 Hình 4.2. Kiểm tra Elisa trên các mẫu ớt thu thập từ trước và các mẫu mới thu thập trong năm 2017 39 Hình 4.3. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA 48 Hình 4.4. Phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA 54 Hình 4.5. Triệu chứng của CMV trên ớt (Cerkauskas, 2004). 55 Hình 4.6. Phát hiện TYLCVs trên ớt bằng DAS-ELISA 67 Hình 4.7. Triệu chứng begomovirus trên ớt 69 Hình 4.8. Hình ảnh PCR kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1 69 Hình 4.9. PCR phát hiện TYLCKaV trên mẫu ớt và cà chua (dương tính với begomovirus) bằng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1 71 Hình 4.10. PCR phát hiện PepYLCVNV trên mẫu ớt và cà chua (dương tính với begomovirus) bằng cặp mồi đặc hiệu DNA-A (VNP93–A-F1/VNP1500–A-R1) và đặc hiệu DNA-B (VNP1500–B–F1/R2) 72 Hình 4.11. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường LB-Agar sau 3 ngày nuôi cấy 74 Hình 4.12. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá 75 Hình 4.13. Số khuẩn lạc thu được sau lần biến nạp đầu tiên 79 Hình 4.14. Tổ chức bộ gen của mẫu PepYLCVNV VNP1500 84 Hình 4.15. Vùng chung CR của mẫu PepYLCVNV VNP1500 với cấu trúc thứ cấp chứa điểm khởi đầu tái bản bộ gen được chỉ rõ 84 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Thị Thủy Tên Luận văn: Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 8.62.01.12 Tên cơ sở đào tạo: Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mục đích nghiên cứu Xác định sự có mặt của Begomovirus trên các mẫu ớt thu thập tại miền Bắc, xác định đặc điểm sinh học và đánh giá tính gây bệnh của virus. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại ớt được thu thập tại các vùng trồng ớt tại Hà Nội, sau đó được làm khô bằng hạt silicagelkít. Các mẫu được kiểm tra ELISA phát hiện virus bằng các kit ELISA do Viện DSMZ của Đức cung cấp. Các mẫu có triệu chứng đặc trưng được kiểm tra PCR. Sử dụng cặp mồi chung BegoA Rev/For phát hiện begomovirus. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/VNP1500-A-R1 và VNP1500-B-F1/VNP1500-B-R2 để phát hiện đặc hiệu PepYLCVN. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) và lây nhiễm bằng bọ phấn nhằm đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVN trên cà chua và một số cây chỉ thị. Kết quả chính và kết luận 1. Đã điều tra và thu thập các mẫu bệnh begomovirus trên ớt tại Hà Nội năm 2017 với các loại hình triệu chứng . Dạng triệu chứng điển hình là triệu chứng khảm lá. Tỉ lệ nhiễm virus cao nhất tại huyện Thạch Thất trong giai đoạn quả chín đạt 43,2%. 2. Đã kiểm tra ELISA trên 81 mẫu ớt thu thập khắp cả nước, phát hiện 2 mẫu phản ứng dương tính ChiVMV, 5 mẫu phản ứng dương tính PMMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepYMV và 1 mẫu phản ứng dương tính TYLCVs. 3. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi chung BegoA-F1 và BegoA-R1 trên 14 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 6 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng dương. 4. Kiểm tra PCR phát hiện TYLCKaV bằng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1 trên 5 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 1 mẫu cà chua có phản ứng dương. 5. Kiểm tra PCR phát hiện PepYLCVNV bằng cặp mồi đặc hiệu VNP93–A-F1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B–F1/R2 trên 9 mẫu (5 ớt và 4 mẫu cà chua). Kết quả kiểm tra cho thấy có 4 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng dương với cả DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV. 6. Đã giải trình tự bổ sung và nhận được trình tự đầy đủ bộ gen mẫu PepYLCVNV VNP1500 từ 2 cấu trúc xâm nhiễm. Phân tích bộ gen cho thấy bộ gen của virus trên cấu trúc xâm nhiễm là hoàn chỉnh, đảm bảo sự xâm nhiễm hệ thống của virus trong cây. Kết hợp kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân tích trình tự đã gợi ý có lẽ xuất hiện đột biến của virus trên cấu trúc xâm nhiễm liên quan cảm ứng triệu chứng. THESIS ABSTRACT Master candidate: Ha Thi Thuy Thesis title: Diagnosis and Biological Characteristics of Pepper Begomovirus Major: Plant Protection Code: 60.62.01.12 Educational organization: Vietnam Academy of Agriculture Sciences (VAAS); Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Materials and Methods: The viral symptomatic samples were collected on the pepper fields in Ha Noi, then were dried by silicagel. The samples were tested for the presence of viruses by ELISA using kits provided by the DSMZ Institute (Germany). PCR tests to detect begomovirus were carried out using universal and specific primers. An agro-inoculation method using Agrobacterium tumerfaciens cells harboring infectious structures and infected with Bemisia tabaci of PepYLCVNV were used to investigate the pathogenicity of these two geminivirses on pepper. Main findings and conclusions: Investigated and collected begomovirus-infected samples of peppers in Hanoi in 2017 with different types of symptoms. The most typical symptom was leaf mosaic. The highest infection rate in Thach That district during ripening was 43.2%. ELISA tests on 81 symptomatic pepper samples showed 2 samples positive to ChiVMV, 5 samples positive to PMMoV infection, 1 samples positive to PepMoV infection, 1 samples positive to PepYMV, 1 samples positive to PepYMV and 1 samples positive to TYLCVs. PCR detection of begomovirus was carried out with begoA-F1 and BegoA-R1 primers on 14 peppers and 4 tomato samples. The results showed that there were 6 samples of pepper and 4 samples of tomato were positive to begomovirus. PCR detection of TYLCKaV by specific primers TYKa-A-F1/R1 on 5 samples of pepper and 4 tomato samples. The results showed that there were 1 tomato sample were positive to TYLCKaV. PCR detection of PepYLCVNV with specific primers VNP93-A-F1/VNP1500-A-R1 and 1500-B-F1/R2 primers on 9 samples (5 chili and 4 tomato samples). Four samples of pepper and 4 tomato samples showed that positive results for both DNA-A and B-DNA of PepYLCVNV. Extra sequencing and complete sequencing of the PepYLCVNV VNP1500 genome from two infecting structures were performed. Genome analysis reveals that the viral genome on the infectious structure is complete, ensuring systematic viral infection in the plant. Incorporation of the results of infection and sequencing suggested the emergence of mutations in the invasive structure associated with symptomatic induction. PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. GIỚI THIỆU Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài (Fauquet and Stanley, 2005). Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet and Stanley, 2005). Các begomovirus không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Picó at al., 1996). Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh xoăn vàng lá cà chua–một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới. Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lá hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử (Moriones and Navas-Castillo, 2000). Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại (Green et al., 2001; Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Học viện nông nghiệp Việt Nam) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). Do begomovirus hại ớt là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu. Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt ” 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu (i) Xác định được sự có mặt của begomovirus trên các mẫu ớt thu thập được tại Hà Nội; (ii) Đánh giá được tính gây bệnh của một begomovirus mới phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) bằng lây nhiễm nhân tạo. 1.2.2. Yêu cầu 1. Điều tra đồng ruộng bệnh virus trên ớt - Điều tra bệnh; thu thập mới các mẫu cây ớt biểu hiện triệu chứng. 2. Phát hiện các virus trên ớt bằng ELISA 3. Phát hiện các begomovirus và PepYLCVNV bằng PCR - Phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi chung - Phát hiện TYLCKaV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu - Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu 4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm đã được xây dựng từ trước và bọ phấn 5. Đặc trưng phân tử của PepYLCVNV - Hoàn thiện giải trình tự bộ gen mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 được xây dựng trên cấu trúc xâm nhiễm 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Đã xác định được thành phần virus nói chung và begomovirus nói riêng trên số lượng lớn mẫu ớt thu thập tại miền Bắc. - Đã cung cấp thông tin và định hướng nghiên cứu tiếp về tính gây bệnh của một begomovirus phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl VietNam virus (PepYLCVNV). 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xác định sự phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của begomovirus đã xác định được. - Góp phần đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do begomovirus hại ớt một cách hợp lý, an toàn với con người và môi trường. - Cung cấp dẫn liệu cho đào tạo và giảng dạy về phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của PepYLCVNV. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ỚT 2.1.1. Nguồn gốc Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7500 năm trước Công nguyên. Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước (Perry et al., 2007), và là một trong những loại cây trồng đầu tiên ở châu Mỹ. Người ta cho rằng ớt đã được thuần hóa ít nhất năm lần bởi những cư dân tiền sử ở các khu vực khác nhau của Nam và Bắc Mỹ, từ Peru ở phía nam đến Mexico ở phía bắc và một số vùng của các bang Colorado và New Mexico bởi các dân tộc Pueblo Cổ đại (Bosland, 1996). Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2012) cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới. Diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng 1.914.685 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 31.171.567 tấn. Các nước nhập khẩu và xuất khẩu quan trọng nhất bao gồm: Ấn Độ, Mexico, Trung Quốc, Pakistan, Thổ Nhĩ Kỳ (Than et al., 2008). Cây ớt có mặt ở nước ta, được du nhập từ Trung Quốc, Ấn Độ. Diện tích phân bố khá rộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phân tán. 2.1.2. Phân loại Chi Capsicum có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Hoa Kỳ và đã có mặt khắp thế giới bao gồm các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và các vùng khí hậu ôn đới (Pickersgill, 1997). Theo Bosland and Votava (2000) cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), chi Capsicum. Hiện nay có ít nhất 25 loài hoang dại được biết đến và 5 loài được thuần hóa bao gồm: - Capsicum frutescens, bao gồm cả ớt Tabasco - Capsicum chinense, bao gồm cả loài ớt cay nhất như naga, habanero và Scotch bonnet - Capsicum pubescens, bao gồm cả ớt rocoto Nam Mỹ - Capsicum baccatum, bao gồm cả ớt cay Nam Mỹ - Capsicum annuum, bao gồm nhiều loại khác nhau như Bell pepper, Paprika, Cayenne, Jalapexnos và Chiltepin. Các loài cây trồng trong chi Capsicum thường được phân biệt theo đặc điểm hoa và quả (Lipert et al., 1996). 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo Mai Thị Phương Anh (1999): Thân: ớt là cây thân bụi 2 lá mầm, thân thường mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng (giống) có thân bụi, nhiều cành, chiều cao trung bình 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc cây lâu năm nhưng thường được gieo trồng là cây hàng năm. Rễ: Ban đầu ớt có rễ cọc phát triển mạnh với rất nhiều rễ phụ, rễ cọc chính đứt, một hệ rễ chùm phát triển mạnh, vì thế nhiều khi lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm. Lá: Thường ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính, lá có nhiều hình dạng khác nhau, nhưng thường gặp nhất là dạng lá móc, trứng ngược, mép lá hình răng cưa. Mặt trên lá phụ thuộc vào các loài khác nhau, một số có mùi thơm. Lá thường mỏng có kích thước trung bình 1,5-12,0cm x 0,5-7,5cm. Quả: Thuộc loại quả mọng có rất nhiều hạt với nhiều thịt quả nhăn và chia làm 2 ngăn. Các giống khác nhau có kích thước quả, hình dạng, độ nhọn, màu sắc, độ cay (hăng) và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chưa chín có màu xanh, khi chín chuyển thành màu vàng, hoặc đỏ. Hạt: Hạt có dạng thận và màu vàng rơm, chỉ có hạt của C.pubescens có màu đen. Hạt có chiều dài khoảng 3-5mm. Một gam hạt ớt cay có khoảng 220 hạt. 2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới Trong các cây họ Cà Solanaceae, ớt được coi là cây có tầm quan trọng thứ hai chỉ sau cây cà chua (Yoon et al., 1990). Châu Á được coi là vùng đất gia vị của thế giới, được biết đến bởi nguồn gốc xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu hàng đầu của hầu hết các loại gia vị. Trên thế giới có khoảng 70 loài cây trồng làm gia vị thì đều được trồng chủ yếu ở Châu Á nổi tiếng với các nước như Ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, v.v(Chomchalow, 2001). Bảng 1.1. Diện tích, năng suất ớt trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 Các châu Diện tích (ha) Năng suất (kg/ha) 2010 2011 2012 2010 2011 2012 Thế giới 1.827.229 1.865.626 1.914.685 15.998 16.114 16.280 Châu Phi 301.182 321.053 363.937 8.726 7.866 7.929 Châu Mỹ 218.976 217.917 212.670 17.627 16.939 19.009 Châu Á 1.181.726 1.205.453 1.218.792 16.767 17.364 17.522 Châu Âu 122.620 118.497 116.545 23.427 24.115 24.279 Châu Đại Dương 2.726 2.706 2.741 20.798 20.959 20.943 Nguồn: FAO STAT Database (2014) Bảng 1.2. Sản lượng ớt ở một số nước trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 Đơn vị tính: Tấn STT Nước 2010 2011 2012 1 Trung Quốc 15.001.503 15.541.611 16.023.500 2 Mexico 2.335.562 2.131.740 2.379.736 3 Indonesia 1.332.356 1.903.229 1.656.615 4 Thổ Nhĩ Kỳ 1.986.700 1.975.269 2.072.132 5 Tây Ban Nha 875.657 921.089 1.023.700 6 Mỹ 932.580 991.370 1.064.800 7 Nigeria 500.000 449.594 500.000 8 Ai Cập 655.841 670.434 650.054 9 Romania 243.493 253.505 207.072 Nguồn: FAO STAT Database (2014) Một số nước có sản lượng ớt cao như: Trung Quốc, Mexico, Indonexia, Thổ Nhĩ Kỳ. Trong đó Trung Quốc là nước có sản lượng ớt cao nhất thế giới, sản lượng ớt hàng năm của nước này chiếm khoảng 30% sản lượng ớt của thế giới. Hiện nay, Ấn Độ là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới chiếm 25% tổng sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Trung Quốc 24%, Tây Ban Nha 17%, Mexico 8%. Các nước nhập khẩu lớn nhất thế giới là các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống Nhất (UAE), liên minh Châu Âu (EU), Sri Lanca, Nhật Bản, Hàn Quốc. Trao đổi thương mại về ớt chiếm gần 16% tổng sản phẩm gia vị, đứng vị trí thứ hai sau hồ tiêu (Bùi Thị Oanh, 2010). Nhìn chung, ớt được thương mại hóa trên toàn thế giới, đối với các nước đang phát triển thì mặc dù ớt chiếm tỷ trọng nhỏ trong sản xuất hàng hóa nhưng là nguồn thu nhập đáng kể (Bosland and Votava, 2000). 2.1.5. Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam Ở nước ta, ớt là một loại gia vị rất phổ biến, ở nông thôn được trồng trong vườn gia đình người ta thường trồng một vài cây ớt thường dùng trong bữa ăn hàng ngày, vừa để làm cảnh. Ngoài lượng ớt trồng để sử dụng trong nước, hàng năm hàng trăm tấn ớt được xuất khẩu sang nhiều nước. Hiện nay diện tích trồng ớt của nước ta còn manh mún chưa được quy hoạch. Cây ớt được coi là cây trồng hàng hóa có giá trị kinh tế cao và đã bắt đầu hình thành các vùng sản xuất ớt tập trung như: xã Nhân Lý huyện Chi Lăng, xã Tân Liên huyện Cao Lộc Tuy nhiên, diện tích, sản lượng ớt trồng còn khá khiêm tốn chưa tương xứng với tiềm năng của tỉnh cũng như chưa đủ đáp ứng với nhu cầu của thị trường trong nước và xuất khẩu. Nguyên nhân do tính tự phát, thị trường tiêu thụ bấp bênh, kỹ thuật canh tác theo kinh nghiệm cổ truyền, sử dụng giống chưa rõ nguồn gốc làm ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và giá thành sản phẩm (Bùi Bách Tuyến, 1998). 2.1.6. Lợi ích đối với sức khỏe Nghiên cứu trên thế giới: Theo Bosland and Votava (2000) quả ớt có nhiều lợi thế trong việc nấu nướng, trong quả ớt chứa nhiều chất hóa học bao gồm các chất dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoit, carotenoit, vitamin, protein, chất sợi và các nguyên tố khoáng chất. Nhiều thành phần trong quảớt có giá trị dinh dưỡng quan trọng, làm gia vị, mùi thơm và màu sắc. Trong quả ớt chứa rất nhiều vitamin đặc biệt là vitamin C và provitamin A (carotene), ngoài ra còn có vitamin B1, B2, PP Quả ớt giúp làm giảm nhiễm sạ và cholesterol. Giàu vitamin A và C, nhiều khoáng kali, acid folic và vitamin E. Trong quả ớt tươi có nhiều vitamin C hơn so với quả thuộc họ cây có múi và chứa nhiều vitamin A hơn so với củ cà rốt. Hai nhóm chất hóa học quan trọng trong ớt là capsaicinoit và carotenoit. Capsaicinoit là alkaloit tạo vị cay cho ớt, capsaicinoit (C9H14O2) có nhiều công dụng trị bệnh được dùng trong y học.Theo các nhà khoa học Trung Quốc, capsaicinoit có tác dụng kích thích não bộ sản xuất ra chất endorphin, một chất morphin nội sinh có đặc tính như thuốc giảm đau, đặc biệt có ích cho những bệnh nhân bị viêm khớp mãn tính và các bệnh ung thư. Một số lượng lớn carotenoid cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho ớt (Britton and Hornero-Méndez, 1997; Hornero-Méndez et al., 2002;Pérez-Gálvez et al., 2003). Nghiên cứu tại Việt Nam: Ớt là loại cây trồng vừa được sử dụng như rau tươi, vừa được dùng làm gia vị vì có giá trị vitamin cao trong các loại rau nhất là vitamin C và provitamin A (Caroten), theo một số tài liệu thì hàm lượng vitamin C ở một số giống ớt là 340mg/100g quả tươi, ngoài ra còn chưa một số vitamin như B1, B2, P, E... và khoáng chất (Mai Thị Phương Anh và cs., 1996; Mai Thị Phương Anh, 1999). Quả ớt được sử dụng dưới dạng ăn tươi, muối chua, nước ép, nước sốt, tương, chế xuất dầu, sấy khô hoặc làm bột.Trong ớt cay còn có chất capsicin là một loại alcaloid có vị cay, gây cảm giác ngon miệng khi ăn, khích thích quá trình tiêu hóa. Chất này có nhiều trong thành giá noãn và biểu bì của hạt (trong 1kg có chứa tới 1,2g). Hoạt chất capsicin giúp cơ thể phòng được sự hình thành của các cục máu đông, giảm đau trong nhiều trứng viêm do ức chế các yếu tố P trong cơ thể, gần đây người ta còn chứng minh được vai trò của ớt trong ngăn cản các chất gây ung thư. Nhìn chung, vai trò của ớt ngày nay đã được khẳng định, ngoài sử dụng như một loại thực phẩm, gia vị, y học... ớt còn được sử dụng như một loại cây cảnh dùng để trang trí trong gia đình (Mai Thị Phương Anh, 1999). 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 2.2.1. Một số nghiên cứu về virus hại ớt Trên ớt có nhiều sâu nhện hại, như nhện trắng, rệp muội, bọ trĩ còn là các vector lan truyền bệnh virus, ngoài ra còn có nhiều bệnh hại quan trọng khác như bệnh héo xanh do vi khuẩn do nấm Phytophthora sp., bệnh thán thư hại quả, đặc biệt là các bệnh do virus được coi là tác nhân chính, là trở ngại lớn nhất gây cản trở sản xuất ớt, làm giảm năng suất từ 60 - 100% (Yoon et al., 1990; Green, 1992a, 1993). Theo Green and Kim (1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt, cho đến năm 2001 thì đã có tới hơn 65 loài virus khác nhau đã được phát hiện. Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được phát hiện thêm. Riêng trên cây ớt có hơn 10 loài thuộc chi Potyvius khác nhau gây hại. Potato virus Y (PVY) phân bố rộng rãi trên toàn thế giới và là loài virus duy nhất thuộc chi Potyvirus gây hại trên ớt ở các nước thuộc Châu Âu. Chilli veinal mottle virus (ChiVMV), chilli ringspot virus (ChiRSV) (Ha et al., 2008) phân bố ở Châu Á. Pepper veinal mottle virus (PVMV) phân bố ở Châu Phi (Brunt and Kenten, 1972; Wijs, 1973). PVMV cũng được phát hiện ở Ấn Độ (Ravi et al., 1997), ở Afghanistan (Cerkauskas, 2004). Tobacco etch virus (TEV) (Purcifull và Hiebert, 1982), Pepper yellow mosaic virus (PepYMV) (Inoue et al., 2002) và Ecuadorian rocoto virus (ERV) (Bérenger et al., 2008) phân bố chủ yếu ở Châu Mỹ. Theo Green (1992b and 1993), tính đến năm 1991, trong tổng số hơn 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Các loài phổ biến và quan trọng nhất là Cucumber mosaic virus (CMV), Chilli veinal mottle virus (CVMV), Potato virus Y (PVY) và các virus thuộc chi Tobamovirus. Các loài ít quan trọng hơn là Broad bean wilt virus (BBWV), Alfalfa mosaic virus (AMV) và Potato virus X (PVX). Alfalfa mosaic virus (AMV) xuất hiện trên ớt trồng ở các vùng lạnh như Hàn Quốc, Nhật Bản và các cao nguyên ở Indonesia và Philippines. Broad bean wilt virus (BBWV) thông báo được phát hiện thấy ở Trung Quốc và Nhật Bản. Hợp phần các virus gây cuốn lá được coi là virus quan trọng tiềm tàng gây hại trên ớt ở những vùng đất thấp nơi mà mật độ bọ phấn tăng cao và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác. Cũng có các công bố đã phát hiện thấy Tobacco etch virus (TEV), Tobacco rattle virus (TRV), Tomato spotted wilt virus (TSWV) và Pepper mottle virus (PepMoV) gây hại trên ớt ở Châu Á. Theo Galanihe et al. (2005), bệnh do virus làm giảm năng suất ớt hơn 53%. Từ đó, các tác giả đã đánh giá và chọn lọc được nhiều dòng, giống ớt kháng với CMV và CVMV ở Sri Lanka. Theo Moury et al. (2005), các isolate của PVMV và ChiVMV được sắp xếp vào kiểu hình 2 và 3 nằm trong các mối liên quan đến các kiểu gen của ớt có mang các kiểu gen kháng khác nhau. Tính kháng đặc hiệu chỉ liên quan đến sự đa dạng phân tử của các isolate này. Chỉ có duy nhất một isolate PVMV gây hại trên các cánh đồng ớt có các gen lặn pvr6 và pvr22, tuy nhiên các kiểu gen này không bị PVMV gây hại trên các cánh đồng ớt ở Senegal mặc dù có sự xuất hiện của PVMV xung quanh các ruộng ớt. Ở Đài Loan, từ năm 1990 đến năm 2005, trong tổng số 1824 mẫu lá nhiễm virus thu thập tại các vùng khác nhau của Đài Loan chỉ có 37% số mẫu nhiễm ChiVMV, 32% nhiễm CMV, 15% nhiễm PYV, 14% nhiễm PMMoV và 6% nhiễm ToMV, cũng không phát hiện thấy PVMV và virus thuộc chi Begomovirus (Green, 1992a; Zhang et al., 2006) Ở Trung Quốc, trong tổng số 762 mẫu lá virus hại ớt thu thập tại các vùng trồng ớt ở nước này từ năm 1999 đến năm 2005 được kiểm tra bằng phương pháp ELISA và PCR đã xác định được tỷ lệ nhiễm các virus ChiVMV, CMV, PMMoV, ToMV và PVY lần lượt là 32%, 26%, 23%, 9% và 3%, trong các mẫu thử không có mẫu nào nhiễm PVMV và không nhiễm bất cứ một loại virus nào thuộc chi Begomovirus (Zhang et al., 2006). ChiVMV và CMV được coi là những virus phổ biến gây hại trên ớt ở Trung Quốc và Đài Loan. Các kết quả thực nhiệm đã chỉ ra rằng, các loài thuộc chi Begomovirus không gây hại ở hai nước này mặc dù trước đó đã có các báo cáo công bố có hơn 9 loài virus thuộc chi Begomovirus gây hại trên các cây trồng khác ở Trung Quốc và Đài Loan (Stanley et al., 2005). Ở Nepal, bệnh virus trên ớt ngọt thường ở dạng hỗn hợp, phổ biến là các loài virus CMV và ChiVMV với tỷ lệ bệnh từ 30-90% tùy theo từng địa phương khác nhau (Rashid et al., 2007). 2.2.2. Một số begomovirus hại cà chua Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà c...* ~1.2 Phát hiện DNA-A của Begomovirus 6 BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* 7 TYKa-A –F1 CCTTTTCCAGAGAGTTTGCAC ~0.7 Phát hiện DNA-A củaTYYLCKa 8 TYKa-A –R1 GATGCTGAGAAACGATGAAGC . 3.3.2.4. Chất kháng sinh Các kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Rifampicin, kanamycin, streptomycin. Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu – 200C, trong đó rifampicin và kanamycin được bọc kín bằng giấy bạc. 3.3.2.5. Hóa chất, dung dịch đệm Đệm điện di agarose (1X TAE): 10 mM Tris-acetate, 0.5 mM EDTA. Đệm CTAB: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinylpyrrolidone), 100 mM Tris-HCl pH 8.0 và 25 mM EDTA Đệm TE, pH8: 10 mM Tris-Cl and 1 mM EDTA Beta-mercaptoethanol (β-ME) Đệm chiết Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) Cồn tuyệt đối Agarose 3.3.2.6.Vi khuẩn sử dụng - E.coli chủng XL1Blue. 3.3.2.7. Kit thương mại Kít PCR: GoTaq Green (hãng Promega) chứa sẵn đệm phản ứng, Taq polymerase, dNTPs. 3.3.2.8. Môi trường Môi trường LB lỏng (1L): 10 g Bacto®-tryptone, 5 g Bacto®-yeast extract và 5 g NaCl. Hấp khử trùng 121oC 20 phút. Các kháng sinh cho vào môi trường đang ấm khoảng 55oC trước khi sử dụng. Môi trường LB agar: Thành phần giống môi trường LB lỏng nhưng chứa 15g agar/L. Các kháng sinh cho vào môi trường đang ấm khoảng 55oC trước khi rót ra đĩa petri. 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Điều tra đồng ruộng để xác định sự có mặt của begomovirus trên ớt ở các địa điểm tại Hà Nội năm 2017. - Phát hiện các virus trên ớt bằng phương pháp ELISA - Phát hiện các begomovirus và PepYLCVNV bằng PCR - Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo. 3.5. PHƯƠNG PHÁP 3.5.1. Điều tra đồng ruộng - Điều tra tỉ lệ cây mang triệu chứng bệnh do begomovirus trên ruộng trong thời điểm thu mẫu. Áp dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện bảo vệ thực vật (2000). - Mỗi điểm trồng ớt điều tra 3 ruộng đại diện cho mỗi giống. Đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây. Điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc (cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra 50 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ. - Tính tỉ lệ bệnh theo công thức Trong đó TLB (%): Tỷ lệ bệnh tính bằng % A: Tổng số cây bị nhiễm bệnh do begomovirus gây ra. B: Tổng số cây điều tra 3.5.2. Thu mẫu Tại mỗi điểm trồng ớt, thu 3 mẫu/giống với triệu chứng điển hình. Các mẫu được số liệu hóa (thời gian, địa điểm, triệu chứng, giai đoạn sinh trưởng) và được xử lý khô bằng silicagel tự chỉ thị để bảo quản lâu dài. 3.5.3. Chiết DNA tổng số DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp: + Phương pháp chiết nhanh nhanh bằng NaOH (Wang et al., 1993; Wang et al., 1994) Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1,5 mL, cho tiếp 500 µl dung dịch NaOH 0,5 M vào tube 1,5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền nhuyễn mẫu lá. Lấy 100 µl dung dịch đệm Tris 0,1 M, pH = 8 vào tube 1,5mL, sau khi nghiền mẫu xong lấy 2 µl dịch nghiền cho vào tube 1,5mL chứa dung dịch đệm Tris 0,1M, pH = 8. Dịch hòa loãng này được dùng để chạy PCR. + Phương pháp chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB (Cetryl Ammonium Bromide) theo mô tả của (Doyle, 1987) như sau: Nghiền khoảng 0.1g mẫu tươi trong 500µl đệm CTAB (đã bổ sung Beta- mercaptalthanol). Sau đó, dung dịch mẫu được chiết 2 lần bằng hỗn hợp Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1. DNA tổng số được kết tủa bằng Propanol 100%, rửa cặn DNA 2 lần bằng 700µl Etanol 70% và để khô cặn DNA trong không khí ít nhất 30 phút. Hoà tan DNA trong 100µl nước cất hai lần đã hấp vô trùng, bảo quản DNA ở -200C. 3.5.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Chu trình phản ứng PCR kiểm tra DNA-A của begomovirus, sử dụng cặp mồi chung BegoA Rev và BegoA For (Ha et al., 2008): Các phản ứng PCR được thực hiện trong tube 0,5 µl với tổng thể tích là 15 µl, thành phần của mỗi phản ứng PCR. Thành phần Thể tích (µl) H2O 6.4 GoTaq Master mix (2x) 7.5 BegoA For 1 0.3 BegoA Rev 1 0.3 DNA 0.5 Tổng thể tích 15 + Quy trình thực hiện phản ứng PCR 94oC 2 phút x 1 94oC 20 giây 52oC 20 giây x 35 72oC 4 phút 72oC 2 phút X 1 25oC 10 phút x 1 3.5.5. Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100V trong 30-40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp chuyên dụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số. 3.5.6. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells) Tế bào A. tumefaciens khả biến được chuẩn bị theo các bước: Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 28oC trong tủ nuôi cấy có lắc (250rpm). Bước 2: Chuyển 2ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50ml môi trường LB lỏng đựng trong lọ định mức ở 500 ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm/28oC) cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5-1,0. Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000g trong vòng 5 phút ở 4oC. Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa (dùng pipes hút hết dịch trên tủa). Hoà cặn vi khuẩn với 1ml dung dịch CaCl2 20mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó phân phối cứ 0,1ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu –80oC. 3.5.7. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5ml môi trường LB lỏng, để qua đêm ở nhiệt độ 370C trong tủ nuôi cấy có lắc (250rpm). Bước 2: Chuyển 2 ml dịch vi khuẩn ở bước 1 sang 50 ml môi trường LB lỏng đựng trong lọ định mức ở 500ml. Ủ trong tủ nuôi cấy có lắc (250rpm/370C) cho tới khi mật độ quang OD600 đạt 0,5-1,0. Bước 3: Làm lạnh vi khuẩn bằng để bình trong đá khoảng 5 phút. Cho toàn bộ dung dịch chứa vi khuẩn ly tâm với tốc độ 3000 g trong vòng 5 phút ở 4 0C. Bước 4: Loại bỏ dịch trên tủa. Hoà cặn vi khuẩn với 1 ml dung dịch CaCl2 100mM đã được làm lạnh trước trong đá. Sau đó phân phối cứ 0,1 ml dịch vi khuẩn thì cho vào 1 tube Eppendorf loại 1,5ml được làm lạnh trước trong đá. Hoá đông vi khuẩn khả biến và bảo quản trong tủ lạnh sâu - 800C. 3.5.8. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp xung điện Bước 1. Lấy vi khuẩn E.coli chủng XL1Blue khả biến đổ vào tube 1.5ml li tâm thu cặn vi khuẩn. Li tâm cho đến hết lượng dịch vi khuẩn đã nuôi trong 1-2 phút (8000rpm). Bước 2. Cặn vi khuẩn thu được sau đó được rửa bằng nước cất vô trùng 2-3 lần (cho nước cất vào tube, búng tube nhẹ nhàng để hòa cặn khuẩn sau đó li tâm 8000rpm trong 1-2 phút. Rửa tiếp 1-2 lần nữa). Bước 3. Sau khi rửa bằng nước, chia đều dịch khuẩn ( đã thêm 98µl H2O) vào từng tube 1.5 sạch bổ sung thêm 2 µl sản phẩm ligation sau đó trộn đều. Bước 4. Chuyển hỗn hợp đã trộn vào cuvet để cho vào máy xung điện (Multiporator) để chuyển gen. Hiệu điện thế được set ở 1400 V và thời gian được set ở 5ms. Bước 5. Lấy cuver ra khỏi máy cho vào box bổ sung thêm 150µl SOC sau đó chuyển ra tube. Bước 6. Li tâm các ống tube trong 3-4 phút (8000rpm) sau đó hút bỏ bớt dịch bên trên để lại một ít để hòa tan cặn khuẩn (làm đặc dịch vi khuẩn). Bước 7. Hút hết dịch đó vào đĩa môi trường LB agar đã bổ sung kháng sinh tet+kan sau đó cấy chang trên đĩa. Bước 8. Nuôi đĩa vi khuẩn đã được biến nạp trong tủ nuôi 37ºC. 3.5.9. Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation Sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào cây (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991). Các bước thực hiện như sau: Cấy lại 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm trên đĩa môi trường LB agar chứa 3 kháng sinh streptomicin 200μg/mL, rifampicin 34μg/mL và kanamycin 100 μg/mL (cấy ria 1 chiều). Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày. Ly tâm dịch vi khuẩn rồi hòa cặn vi khuẩn với 5ml đệm MgCl2 10 mM. Sử dụng 1 xylanh y tế loại 1mL để tiêm dịch vi khuẩn vào thân và 3 nách lá tiếp theo. Mỗi vị trí tiêm 10µl. Trong các công thức lây nhiễm hỗn hợp, hai dòng vi khuẩn sẽ được trộn với thể tích tương đương. Điều kiện nhiệt độ trong quá trình chuẩn bị dịch vi khuẩn lây nhiễm, lây nhiễm và trong vòng 2 ngày sau lây nhiễm phải duy trì <30oC. Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn 3-4 lá thật, được bảo quản trong điều kiện cách ly bọ phấn và được chăm sóc trong toàn bộ thời gian thí nghiệm. 3.5.10. Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn Bọ phấn sạch được nuôi trên cây bông trong lồng nuôi bọ phấn cách ly qua ít nhất 5 thế hệ. Lây nhiễm được thực hiện dùng bọ phấn trưởng thành theo mô tả của Pico et al. (1996). 3.5.10.1. Chuẩn bị cây nguồn bệnh Cây nguồn bệnh ban đầu là cây đã được lây nhiễm bằng Agroinoculation. Cây nguồn bệnh là cây đã được lây nhiễm bằng bọ phấn từ cây nguồn bệnh cấp 1. Cây nguồn bệnh được thay mới 3 tuần/lần bằng lây nhiễm bọ phấn. Duy trì 20 cây nguồn bệnh ở trạng thái triệu chứng điển hình, sinh trưởng tốt. Tất cả cây nguồn bệnh được duy trì trong lồng nuôi bọ phấn. 3.5.10.2. Chuẩn bị cây thí nghiệm Hạt cây thí nghiệm được xử lý thuốc trừ bệnh (Daconil hoặc Mancozeb). Sau khi xử lý, hạt được cho nảy mầm trước trong đĩa petri có lót giấy ẩm. Hạt nảy mầm được trồng vào chậu nhựa chứa giá thể sạch. Cây lây nhiễm là cây con ở giai đoạn 3-4 lá thật. Cây luôn được giữ trong điều kiện cách ly trong toàn bộ thời gian thí nghiệm. 3.5.10.3 Lây nhiễm bằng bọ phấn Các cây thí nghiệm được chụp bằng lồng cách ly (chế tạo từ chai coca cola nhựa loại 1L). Hình 3.1. Nuôi bọ phấn trong lồng cách li (trái) và lồng cách li chế tạo từ chai cocacola (phải) Bọ phấn trưởng thành nuôi trên cây nguồn bệnh trong lồng cách ly bọ phấn được chuyển sang cây thí nghiệm. Thả 10 bọ phấn/cây và cho bọ phấn chích hút trong thời gian 2 ngày. Sau khi lây nhiễm, tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ côn trùng chích hút. Cây lây nhiễm được để trong điều kiện cách ly, phun thuốc trừ côn trùng định kỳ 7 ngày/lần. 3.5.11. Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA Sử dụng các kít ELISA phát hiện virus cây họ đậu do Viện DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) cung cấp. Các kít và phương pháp thử ELISA trình bày ở Bảng 3.1 Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus ớt (Viện DSMZ) STT Virus Viết tắt Phương pháp Mã kít 1 Chilli veinal mottle virus ChiVMV DAS-ELISA AS-0122 2 Cucumber mosaic virus CMV DAS-ELISA AS-0929 3 Pepper mild mottle virus PMMoV DAS-ELISA AS-0018 4 Pepper mottle virus PepMoV DAS-ELISA AS-0186 5 Pepper veinal mottle virus PVMV DAS-ELISA AS-0123 6 Pepper yellow mottle virus PepYMV DAS-ELISA AS-1027 7 Tobacco mosaic virus TMV DAS-ELISA AS-0041 8 Tomato yellow leaf curl Thailand virus TYLCTHV TAS-ELISA AS-0952-0952/2 9 Tomato yellow leaf curl viruses TYLCVs TAS-ELISA AS-0588-0546/2 Sử dụng kỹ thuật ELISA (TAS-ELISA và DAS-ELISA) theo tài liệu mô tả của viện DSMZ. 3.5.11.1. Kỹ thuật DAS – ELISA (ELISA trực tiếp) Phản ứng DAS – ELISA (Doube anibody sandwich – ELISA) hay còn gọi là Direct-ELISA được thực hiện theo trình tự như sau: Bước 1: Cố định IgG. IgG được pha vào đệm Carbonate pH = 9.6. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ở 37oC trong vòng 2-4 giờ. Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa PBS-1 (rửa mỗi lần 3 phút). Bước 2: Cố định dịch cây. Nghiền mẫu cây trong đệm nghiền mẫu. Tỉ lệ nghiền cho mẫu cây tươi và đệm là 1/10-1/20, mẫu cây khô là 1/100-1/200. Đệm dùng để chiết mẫu là đệm PBST-2%PVP. Nhỏ 100µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 4oC qua đêm. Rửa bản ELISA như bước 1. Bước 3: Cố định IgG-AP. Hòa IgG-AP trong đệm PBST-2%PVP-OVA. Nhỏ 100µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1. Bước 4: Đánh giá kết quả. Hòa chất nền NPP (Nitrophenyl Phosphate) trong đệm chất nền. Nhỏ 100µl/ giếng. Để bản ELISA trong tối và kiểm tra sau 30 phút, 1 giờ. Nếu phản ứng quá chậm, có thể để qua đêm để đánh giá. Đánh giá bằng đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đọc ELISA. Có thể dừng phản ứng bằng NaOH 3M (nhỏ 50µl/ giếng). 3.5.11.2. Kỹ thuật TAS-ELISA (Triple antibody sandwich -ELISA) Bước 1: Cố định IgG đa dòng đặc hiệu virus. IgG đa dòng được pha trong đệm carbonate pH = 9.6. Nhỏ 100µl/ giếng. Ủ bản ở 37oC trong vòng 2-4 giờ. Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa (rửa mỗi lần 3 phút). Bước 2: Khóa bản. Nhỏ100 µl/ giếng dung dịch skim milk 2%. Ủ bản 30 phút ở 37oC. Đổ sạch dịch skim milk (không cần rửa). Bước 3: Cố định dịch cây. Nghiền mẫu cây trong đệm nghiền mẫu. Tỉ lệ nghiền cho mẫu cây tươi và đệm là 1/10-1/20, mẫu cây khô là 1/100-1/200. Đệm dùng để chiết mẫu là đệm PBST-2%PVP. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 4oC qua đêm. Rửa bản ELISA như bước 1. Bước 4: Cố định IgG đơn dòng đặc hiệu virus. Hòa IgG đơn dòng trong đệm PBST-2%PVP-OVA . Nhỏ 100µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1. Bước 5: Cố định IgG thứ cấp liên kết AP đặc hiệu kháng thể IgG đơn dòng (RAM-AP). Hòa RAM-AP trong đệm conjugate. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1. Bước 6: Đánh giá kết quả. Hòa chất nền NPP (Nitrophenyl Phosphate) trong đệm chất nền. Nhỏ 100µl/ giếng. Để bản ELISA trong tối và kiểm tra sau 30 phút, 1 giờ. Nếu phản ứng quá chậm, có thể để qua đêm để đánh giá. Đánh giá bằng đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đọc ELISA. Có thể dừng phản ứng bằng NaOH 3M (nhỏ 50µl/ giếng). Kiểm tra kết quả bằng máy đọc ELISA (máy so màu vi phiến). Phản ứng ELISA (+) là phản ứng có trị số mật độ quang học đo được lớn hơn X + 2SD. Trong đó X là giá trị trung bình đối chứng âm và SD là độ lệch chuẩn của các mẫu đối chứng (mẫu khỏe không có triệu chứng bệnh). 3.5.12. Giải trình tự Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng bằng điện di agarose với lượng DNA tham khảo là 2µl, 1µl, 0.5µl tương ứng với 1µg, 0.5µg, 0.25µg DNA (marker GeneRuler, Fermantas). Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều bằng mồi PCR tại Viện Công nghệ sinh học (Hà Nội). PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐIỀU TRA BỆNH HẠI ỚT TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN 4.1.1. Triệu chứng bệnh virus trên ớt Mục tiêu của phần thí nghiệm này là xác định begomovirus gây hại trên ớt tại Hà Nội. Các mẫu ớt được thu thập có triệu chứng đặc trưng của bệnh xoăn vàng lá (hình 4.1) tại một số huyện của Hà Nội. Bảng 4.1. Triệu chứng bệnh virus trên ớt. STT Triệu chứng Điểm phát hiện 1 Khảm vàng, xoăn lá Tất cả các điểm điều tra 2 Khảm, phiến lá dài Phúc Thọ - Cổ Nhuế 2– Hoài Đức 3 Chùn ngọn, khảm và đốm vàng Thạch Thất - Phúc Thọ – Hoài Đức 4 Khảm xanh (Khảm ChiVMV) Tất cả các điểm điều tra 5 Khảm vàng Cổ Nhuế 2– Hà Nội Triệu chứng khảm vàng, xoăn lá Triệu chứng khảm, phiến lá dài Khảm vàng Triệu chứng chùn ngọn, khảm và đốm vàng Triệu chứng khảm xanh Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh virus trên ớt tại các điểm điều tra Khảm vàng, xoăn lá: lá bị khảm, có hiện tượng xoăn lá nhẹ. Triệu chứng này xuất hiện khá phổ biến. Khảm, phiến lá dài: Triệu chứng này gần giống với triệu chứng do nhện nhỏ hại gây nên,cây còi cọ không ra hoa đậu quả. Một số địa điểm điều tra có thấy triệu chứng này như Phúc Thọ-Cổ Nhuế 2-Hoài Đức Chùn ngọn, khảm và đốm vàng:lá khảm, có đốm vàng. Cây chùn ngọn, cây còi cọc không ra hoa, ra hoa nhưng không đậu quả. Triệu chứng này xuất hiện ở 1 vài điểm điều tra như Thạch Thất - Phúc Thọ-Hoài Đức. Khảm xanh: lá khảm xanh toàn cây. Triệu chứng này có trường hợp xuất hiện cùng với triệu chứng nhăn gân, có trường hợp không. Triệu chứng này xuất hiện ở tất cả các điểm điều tra Khảm vàng:lá khảm vàng. Cây cây còi cọc không ra hoa, ra hoa nhưng không đậu quả. Triệu chứng này xuất hiện ở Cổ Nhuế 2 - Hà Nội. 4.1.2. Điều tra bệnh virus trên ớt ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017 Việc tìm thấy nhiều loại triệu chứng trên cùng một cây là phổ biến. Đó là do một cây có thể nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Triệu chứng do virus gây nên trên ớt dễ bị nhầm lẫn với triệu chứng do nhện hại gây nên, hoặc triệu chứng thiếu dinh dưỡng, triệu chứng sốc thuốc trừ bệnh, trừ sâu. Bởi vì triệu chứng virus dễ bị nhẫm lẫn với những triệu chứng do các nguyên nhân khác nói chung và triệu chứng do begomovirus gây ra cũng khó phân biệt nói riêng nên chúng tôi điều tra tỉ lệ bệnh dựa theo triệu chứng. Chúng tôi tiến hành điều tra tỉ lệ bệnh dựa trên 4 triệu chứng phổ biến nhất đó là: 1) Xoăn lá, khảm vàng; 2) Khảm, phiến lá dài; 3) Chùn ngọn, khảm và đốm vàng; 4, Khảm xanh. Số liệu điều tra được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Mức độ xuất hiện các triệu chứng virus trên ớt ở các giai đoạn khác nhau ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017 STT Giai đoạn Ngày Địa Điểm Triệu chứng Tổng tỉ lệ bệnh (%) Xoăn lá, khảm vàng Khảm xanh (Khảm ChiVMV) Khảm vàng Khảm, phiến lá dài Chùn ngọn, khảm, đốm vàng 1 Giai đoạn cây ra hoa và đậu quả 20/08 Thạch Thất - HN 0.5 7.9 0.0 1.6 0.0 10.0 20/08 Phúc Thọ - HN 3.1 8.1 0.0 3.3 0.0 14.5 18/08 Cổ Nhuế - HN 3.8 7.2 0.1 0.0 6.2 17.2 20/08 Hoài Đức - HN 1.7 2.5 0.0 3.7 5.1 13.0 2 Giai đoạn quả chín 30/09 Thạch Thất - HN 2.0 8.7 0.0 5.7 0.0 16.3 30/09 Phúc Thọ - HN 6.6 28.5 0.0 3.4 4.7 43.2 30/09 Cổ Nhuế - HN 5.6 8.0 0.1 0.0 6.6 20.3 01/10 Hoài Đức - HN 1.7 2.9 0.0 4.1 7.7 16.5 Ghi chú: HN: Hà Nội; Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên ớt tại Hà Nội năm 2017 cho thấy tỷ lệ bệnh tương đối cao trong khoảng từ 10,0-43,2%. Tỷ lệ bệnh cao nhất tại huyện Phúc Thọ vào giai đoạn quả chín. Cây càng về già tỉ lệ bệnh cao hơn nhiều (giai đoạn quả chín tỷ lệ bệnh cao hơn giai đoạn cây ra hoa và đậu quả). Trong quá trình điều tra triệu chứng bệnh khảm xanh (khảm ChiVMV) có tỷ lệ bệnh cao nhất. Toàn bộ mẫu sau khi thu về được chúng tôi ký hiệu cẩn thận để tránh nhầm lẫn và cho vào tủ sấy với nhiệt độ 40oC trong khoảng 24-36 giờ, đến khi kiểm tra thấy mẫu khô giòn sẽ cho vào túi nilon dày có chứa silicagel để bảo quản. Các mẫu đã thu thập và xử lý các mẫu ớt, tất cả đều được bảo quản cẩn thận ở -250C . 4.2. PHÁT HIỆN CÁC VIRUS TRÊN ỚT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA Nhằm xác định nguyên nhân gây bệnh do virus gây hại trên ớt, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra. Điều kiện bảo quản mẫu: Tất cả các mẫu đã thu thập được làm khô bảo quản ở -25oC. Các mẫu bệnh được kiểm tra là các mẫu được thu thập từ trước (miền Trung và miền Nam trong giai đoạn 2012-2013) tại trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới và các mẫu được thu thập mới ở các huyện thuộc Hà Nội trong năm 2017. Kiểm tra ELISA phát hiện virus được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới (Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam). Quy trình thực hiện phản ứng ELISA (gồm 2 kỹ thuật TAS-ELISA và DAS-ELISA) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hình 4.2. Kiểm tra Elisa các mẫu ớt thu thập trước và trong năm 2017 4.2.1. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA Chi Potyvirus là một trong những chi lớn nhất trong các chi virus thực vật và là chi lớn nhất trong họ Potyviridae. Tất cả các thành viên chi Potyvirus có virion dạng sợi mềm, lan truyền nhờ rệp muội họ Aphididae, còn một số lan truyền thông qua hạt giống và qua vết thương cơ giới. Họ Potyviridae có 8 chi, trong đó chi Potyvirus là chi lớn nhất có 143 loài trong tổng số 170 loài virus thuộc họ Potyviridae (Gibbs et al., 2008). Trong số các virus hại cây ớt, các potyvirus được xem là nhóm quan trọng nhất. Các kít Elisa của DSMZ (DAS-ELISA) đã được sử dụng để phát hiện sự có mặt của các potyvirus trên các mẫu ớt thu thập được. ChiVMV, PepMoV, PVMV, PepYMV đều là những potyvirus đã được xác định gây hại trên ớt khắp thế giới. Trong số 4 virus này, ChiVMV là virus được xem là phổ biến nhất trên ớt ở khu vực Đông Nam Á (Green 1992b, 1993). Tổng số mẫu ớt thử là 81 mẫu với nhiều triệu chứng khác nhau được thu thập tại Việt Nam, gồm 61 mẫu thu tại miền Trung và Miền Nam giai đoạn 2012-2013 nhưng chưa kiểm tra và 20 mẫu mới thu tại các huyện thuộc Hà Nội năm 2017. Kết quả bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy: Phản ứng ELISA ChiVMV cho kết quả 2 mẫu dương tính (chiếm 2,47%); các mẫu nhiễm bệnh ở miền Trung và miền Nam của Việt Nam. Phản ứng ELISA PepMoV đã cho kết quả dương tính với chỉ 1 mẫu ớt chỉ thiên có triệu chứng cuốn lá (mẫu ớt TH14 thu tại Thạch Thất – Hà Nội) trong tổng số 81 mẫu được kiểm tra (tỉ lệ nhiễm chiếm 1,23%). Kết quả kiểm tra ELISA phát hiện PVMV đều cho kết quả âm tính trên các mẫu thử. Như vậy tính tới thời điểm hiện tại qua các mẫu kiểm tra chưa phát hiện được bệnh PVMV trên cây ớt. Phản ứng ELISA PepYMV đã cho kết quả dương tính với chỉ 1 mẫu ớt có triệu chứng cuốn lá nhẹ (mẫu ớt VNP461 thu tại Hưng Hòa – Đà Lạt). Như vậy trong số 4 virus thuộc chi Potyvirus được kiểm tra thì ChiVMV chiếm tỷ lệ bệnh cao nhất (2,47%); tiếp đến là virus PepMoV và PepYMV đều đạt tỉ lệ nhiễm là 1,43% và chưa có mẫu bệnh nào được kiểm tra có phản ứng dương với PVMV. Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA STT Mã mẫu Giống Triệu chứng Giai đoạn Địa điểm Năm thu ChiVMV PepMoV PVMV PepYMV OD KL OD KL OD KL OD KL 1 VNP93 Chỉ thiên Biến vàng từ cuống ra hoa Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.250 - 0.161 - 0.260 - 0.194 - 2 VNP94 Chỉ thiên Biến vàng từ cuống ra hoa Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.240 - 0.160 - 0.254 - 0.200 - 3 VNP96 Chỉ thiên Cuốn lá ra hoa Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.262 - 0.158 - 0.708 - 0.169 - 4 VNP116 Chỉ thiên Cuốn lá ra hoa Duy Tiên - Hà Nam 2012 0.184 - 0.155 - 0.257 - 0.185 - 5 VNP119 Chỉ thiên Cuốn lá ra hoa Thái Thụy - Thái Bình 2012 0.227 - 0.152 - 0.270 - 0.190 - 6 VNP268 Chỉ thiên Vàng lá ra hoa Đoan Hùng - Phú Thọ 2012 0.267 - 0.168 - 0.206 - 0.190 - 7 VNP287 Chỉ thiên Vàng lá ra hoa Vĩnh Tường - Vĩnh Phúc 2012 0.220 - 0.168 - 0.233 - 0.175 - 8 VNP313 Chỉ thiên Khảm lá cây con Châu Thành - An Giang 2012 0.226 - 0.150 - 0.269 - 0.169 - 9 VNP319 Chỉ thiên Cuốn lá cây con Châu Thành - An Giang 2012 0.227 - 0.160 - 0.232 - 0.195 - 10 VNP320 Chỉ thiên Cuốn lá cây con Châu Thành - An Giang 2012 0.202 - 0.151 - 0.217 - 0.189 - 11 VNP323 Chỉ thiên Cuốn lá cây con Châu Thành - An Giang 2012 0.190 - 0.149 - 0.196 - 0.185 - 12 VNP336 Chỉ thiên Cuốn lá cây con Yên Thế - Bắc Giang 2012 0.198 - 0.151 - 0.176 - 0.171 - 13 VNP416 Chỉ thiên Cuốn lá nhẹ cây con Hưng Hòa - Đà Lạt 2012 0.200 - 0.157 - 0.186 - 0.357 + 14 VNP624 Chỉ địa Kiểu giống begomovirus cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.190 - 0.168 - 0.318 - 0.175 - 15 VNP625 Chỉ địa Khảm lá cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.195 - 0.152 - 0.249 - 0.197 - OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh; KL: Kết luận. Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) STT Mã mẫu Giống Triệu chứng Giai đoạn Địa điểm Năm thu ChiVMV PepMoV PVMV PepYMV OD KL OD KL OD KL OD KL 16 VNP626 Chỉ thiên Khảm lá vàng cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.573 + 0.160 - 0.253 - 0.196 - 17 VNP627 Chỉ thiên Một nhánh cuốn cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2012 0.239 - 0.151 - 0.214 - 0.187 - 18 VNP628 Chỉ thiên Kiểu giống begomovirus cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.394 - 0.151 - 0.235 - 0.193 - 19 VNP632 Chỉ thiên Khảm lá vàng cây con Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.229 - 0.173 - 0.227 - 0.183 - 20 VNP634 Chỉ địa Quả biến dạng cây con Điện Bàn - Quảng Nam 2013 0,198 - 0,160 - 0,179 - 0,173 - 21 VNP635 India Begomovirus nhẹ cây con Điện Bàn - Quảng Nam 2013 0.208 - 0.164 - 0.382 - 0.198 - 22 VNP636 India Begomovirus nhẹ cây con Điện Bàn - Quảng Nam 2013 0.190 - 0.160 - 0.247 - 0.183 - 23 VNP641 Chỉ địa Lá nhỏ cuốn cây con Phú Mỹ - Bình Định 2013 0.273 - 0.186 - 0.229 - 0.195 - 24 VNP642 Chỉ địa Lá nhỏ cuốn cây con Phú Mỹ - Bình Định 2013 0.190 - 0.155 - 0.209 - 0.185 - 25 VNP643 Chỉ địa Begomovirus? cây con Phú Mỹ - Bình Định 2013 0.247 - 0.155 - 0.230 - 0.188 - 26 VNP646 Chỉ địa Begomovirus? cây con Phù Cát - Bình Định 2013 0.266 - 0.187 - 0.248 - 0.225 - 27 VNP647 Chỉ địa Begomovirus? cây con Phù Cát - Bình Định 2013 0.217 - 0.169 - 0.217 - 0.192 - 28 VNP648 Chỉ địa Begomovirus? cây con Phù Cát - Bình Định 2013 0.357 - 0.156 - 0.254 - 0.185 - 29 VNP650 Chỉ địa Begomovirus? cây con Phù Cát - Bình Định 2013 0.227 - 0.156 - 0.244 - 0.189 - 30 VNP673 Chỉ thiên Begomovirus? cây con Châu Thành - An Giang 2013 0.256 - 0.167 - 0.394 - 0.195 - OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh; KL: Kết luận. Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) STT Mã mẫu Giống Triệu chứng Giai đoạn Địa điểm Năm thu ChiVMV PepMoV PVMV PepYMV OD KL OD KL OD KL OD KL 31 VNP674 Chỉ thiên Begomovirus? cây con Châu Thành - An Giang 2013 0.329 - 0.154 - 0.235 - 0.190 - 32 VNP675 Chỉ thiên Begomovirus? cây con Cao Lãnh - Đồng Tháp 2013 0.213 - 0.163 - 0.212 - 0.184 - 33 VNP678 Chỉ thiên Vàng lá cây con Cao Lãnh - Đồng Tháp 2013 0.206 - 0.152 - 0.195 - 0.186 - 34 VNP683 Chỉ thiên Khảm lá cây con Thanh Bình - Đồng Tháp 2013 0.278 - 0.151 - 0.185 - 0.183 - 35 VNP684 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Thanh Bình - Đồng Tháp 2013 0.229 - 0.155 - 0.196 - 0.180 - 36 VNP688 2 mũi tên Vàng lá thu quả Thanh Bình - Đồng Tháp 2013 0.212 - 0.175 - 0.232 - 0.207 - 37 VNP698 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Thanh Bình -Đồng Tháp 2013 0.212 - 0.156 - 0.200 - 0.182 - 38 VNP699 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Thanh Bình -Đồng Tháp 2013 0.252 - 0.192 - 0.233 - 0.190 - 39 VNP700 2 mũi tên Khảm lá thu quả Châu Thành - An Giang 2013 0.221 - 0.159 - 0.216 - 0.179 - 40 VNP701 2 mũi tên Vàng lá thu quả Châu Thành - An Giang 2013 0.295 - 0.170 - 0.219 - 0.189 - 41 VNP702 2 mũi tên Khảm lá thu quả Châu Thành - An Giang 2013 0.193 - 0.159 - 0.240 - 0.218 - 42 VNP704 2 mũi tên Khảm lá thu quả Châu Thành - An Giang 2013 0.215 - 0.170 - 0.351 - 0.182 - 43 VNP717 Chỉ thiên Lá nhỏ, cứng, vàng thu quả Bình Thủy- Cần Thơ 2013 0.230 - 0.159 - 0.218 - 0.193 - OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh; KL: Kết luận. Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) STT Mã mẫu Giống Triệu chứng Giai đoạn Địa điểm Năm thu ChiVMV PepMoV PVMV PepYMV OD KL OD KL OD KL OD KL 44 VNP718 Chỉ địa Xoăn vàng lá điển hình thu quả Ô Môn - Cần Thơ 2013 0.218 - 0.169 - 0.217 - 0.179 - 45 VNP721 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Bình Thủy - Cần Thơ 2013 0.237 - 0.185 - 0.208 - 0.189 - 46 VNP722 Chỉ thiên Cuốn lá ngọn thu quả Vinh - Nghệ An 2013 0.304 - 0.161 - 0.260 - 0.187 - 47 VNP741 Chỉ thiên Khảm lá, nhăn lá thu quả Khánh Hòa - Hoài Đức 2013 0.193 - 0.159 - 0.197 - 0.190 - 48 VNP768 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Kong Choro - Gia Lai 2013 0.187 - 0.153 - 0.302 - 0.173 - 49 VNP770 Chỉ thiên Khảm lá thu quả Cư An – Gia Lai 2013 0.258 - 0.157 - 0.219 - 0.181 - 50 VNP826 Chỉ thiên Khảm lá nặng thu quả Đơn Dương - Lâm Đồng 2013 0.263 - 0.171 - 0.199 - 0.191 - 52 VNP831 Chỉ thiên Khảm lá, lá nhỏ thu quả Đơn Dương - Lâm Đồng 2013 0.509 + 0.180 - 0.294 - 0.191 - 53 VNP838 Chỉ thiên Lá hơi nhăn thu quả Đơn Dương - Lâm Đồng 2013 0.230 - 0.178 - 0.VNP1500 - 0.204 - 54 VNP839 Chỉ thiên Lá với ngọn xoăn nhỏ thu quả Đan Dương- Lâm Đồng 2013 0.191 - 0.170 - 0.305 - 0.167 - 55 VNP841 Chỉ thiên Lá khảm vàng, cong thu quả Đơn Dương - Lâm Đồng 2013 0.234 - 0.153 - 0.270 - 0.181 - OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; ( -) : Cây không nhiễm bệnh; (+): Cây nhiễm bệnh; KL: Kết luận. Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp) STT Mã mẫu Giống Triệu chứng Giai đoạn Địa điểm Năm thu ChiVMV PepMoV PVMV PepYMV OD KL OD KL OD KL OD KL 56 VNP854 2mũi tên Cuốn lá thu quả An Phú - Pleiku 2013 0.267 - 0.218 - 0.244 - 0.191 - 57 VNP856 2mũi tên Cuốn lá thu quả An Phú - Pleiku 2013 0.206 - 0.183 - 0.250 - 0.209 - 58 VNP867 31-4 Cuốn lá thu quả Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.317 - 0.170 - 0.237 - 0.185 - 59 VNP907 Chỉ thiên Khảm vàng thu quả Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.262 - 0.156 - 0.214 - 0.179 - 60 VNP910 Chỉ thiên Khảm, xoăn lá thu quả Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.369 - 0.186 - 0.212 - 0.188 - 61 VNP911 Chỉ thiên Khảm, xoắn lá thu quả Túy Loan - Đà Nẵng 2013 0.306 - 0.161 - 0.209 - 0.177 - 62 TH01 Chỉ thiên Khảm lá ra hoa, đậu quả Thạch Thất - Hà Nội 2017 0.182 - 0.152 - 0.220 - 0.200 - 63 TH02 Chỉ thiên Khảm lá ra hoa, đậu quả Hoài Đức - Hà Nội 2017 0.318 - 0.158 - 0.229 - 0.192 - 64 TH03 Chỉ thiên Chùn ngọn, đốm vàng ra hoa, đậu quả Thạch Thất - Hà Nội 2017 0.255 - 0.162 - 0.205 - 0.188 - 65 TH04 Chỉ thiên Chùn ngọn, đốm vàng quả chín Cổ Nhuế 2 - Hà Nội 2017 0.194 - 0.201 - 0.197 - 0.186 - 66 TH05 Chỉ thiên Chùn ngọn, khảm quả chín Hoài Đức - Hà Nội 2017 0.178 - 0.156 - 0.184 - 0.176 - 67 TH06 Ớt ngọt Xoăn lá, khảm vàng ra hoa, đậu quả Cổ Nhuế 2 - Hà Nội 2017 0.186 - 0.176 - 0.194 - 0.186 - OD: Mật độ quang học đo bước sóng 405 nm; ( -) : Cây k...quá trình xây dựng cấu trúc. Điều này chỉ có thể có thể được xác định khi giải trình tự toàn bộ bộ gen virus trên cấu trúc xâm nhiễm. 4.5 ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ CỦA PEPYLCVNV MẪU VNP1500 4.5.1. Hoàn thiện giải trình tự mẫu PepYLCVNV (VNP1500) Mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 đã được xây dựng cấu trúc xâm nhiễm trên vector pCAMBIA2300. Tuy nhiên trình tự đầy đủ của cả 2 thành phần DNA-A và DNA-B của mẫu virus vẫn chưa hoàn thiện. Trên cấu trúc VNP1500-1 (DNA-A), có 2 đoạn chất lượng kém hoặc chưa giải trình tự là đoạn 550-1050 và đoạn 2170-2400. Trên cấu trúc VNP1500-20, có 1 đoạn chất lượng kém là đoạn 2430-2650. Mục tiêu của phần nghiên cứu này là giải trình tự bổ sung các đoạn còn thiếu và qua đó có thể giải thích kết quả nghiên cứu về lây nhiễm nhân tạo. 4.5.1.1. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp xung điện Để tạo đủ nguồn plasmid cho giải trình tự bổ sung, 2 plasmid tái tổ hợp, VNP1500-1 (DNA-A) và VNP1500-20 (DNA-B), đã được biến nạp vào tế bào E. coli chủng XL1 Blue bằng phương pháp xung điện bằng máy máy điện xung Multiporator hãng Eppendorf. Kết quả biến nạp (bảng 4.15, hình 4.13) cho thấy cả 2 mẫu đều hình thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc với số lượng khoảng 1000 khuẩn lạc/đĩa. Bảng 4.15. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào XL1 Blue bằng xung điện STT Plasmid Điện thế (V) sau xung điện Thời gian xung điện (ms) Số khuẩn lạc hình thành 1 VNP1500-1 1335 5.0 ~1000 2 VNP1500-20 1342 5.0 ~1000 Ghi chú: Hiệu điện thế được set ở 1400 V và thời gian được set ở 5 ms. Hình 4.13. Số khuẩn lạc thu được sau lần biến nạp đầu tiên 4.5.1.2. Giải trình tự bổ sung mẫu PepYLCVNV VNP1500 Từ 2 đĩa khuẩn lạc bạn đầu chọn mỗi đĩa 3 khuẩn lạc, đồng thời nuôi lỏng trong ống LB lỏng (6 ống) có bổ sung tetracyline và kanamycine. Lấy đồng thời khuẩn lạc trên đĩa cấy dùng chung đầu côn (dùng banh) thả vào ống nghiệm. Nuôi trong tủ ấm có lắc 350C/250rpm để qua đêm. Từ vi khuẩn nuôi cấy, plasmid tái tổ hợp được tinh chiết dùng kít thương mại miniprep của hãng Bioneer. Plasmid tinh chiết được gửi giải trình tự tại hãng First Base (Singapore). Kết quả giải trình tự cho thấy chất lượng trình tự tốt (Bảng 4.16) Bảng 4.16. Kết quả giải trình tự bổ sung mẫu PepYLCVNV (VNP1500) Plasmid Đoạn cần giải trình tự (vị trí trên bộ gen)* Mồi giải trình tự** Chất lượng trình tự VNP1500-1 (DNA-A) 550-1050 BegoCP-R1 Tốt 2170-2400 BegoRep-F1 Tốt VNP1500-20 (DNA-B) 2430-2650 BegoIR-R1 Tốt * Vị trí trên bộ gen được tham khảo từ trình tự đầy đủ mẫu VN93. ** Trình tự 3 mồi: BegoCP-F1 GTATATGGCATGTACTCATGC BegoRep-F1 ACGTCATCAATGACGTTRTACCA BegoIR-R1 CGGTAATATTATACGGATGG > VNP1500-1 (DNA-A) ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTCAAGTGGTCCCCGCACGCATGCCTGTCCAATCCTGGCCACTCCTCAAAGCTTAATTATTTATGTGGTCCCCTATATAACTTAGTCTCCAAGTACCCACATCAAAACATGTGGGATCCTTTACTAAACGAGTTTCCTGAAACCGTACATGGTTTTAGGTGTATGTTAGCTATTAAGTATTTGCAAGTAGTAGAAAATACATACTCTCCCGATACACTAGGCTACGATCTAATACGTGATCTTATCCTGGTGATTCGTGCTAGGGATTATGGCGAAGCGTCCCGCAGATATAGTCATTTCCACTCCCGCCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATATCTCAGCCGTGCTGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAAAAAGAGGTCGTGGGCCAATCGGCCCATGTACAGAAAGCCCAGGATATACAGGATGTACAAAAGCCCTGATGTTCCGCGGGGCTGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAGTCCTATGAACAACGGCATGATGTAGCCCATGTAGGTAAGGTAATATGTGTCTCTGATGTCACTCGAGGTAATGGGCTGACACATCGTGTTGGTAAGAGGTTCTGTATCAAGTCTGTCTATGTACTGGGCAAAATCTGGATGGATGAGAATATTAAGACGAAGAACCATACCAATACTGTCATGTTCTTTTTAGTTCGTGATAGGAGACCATTTGGCACGCCACAGGATTTTGGTCAAGTGTTCAACATGTATGATAATGAGCCCAGTACTGCCACTGTGAAGAACGACAACAGAGATCGATTCCAAGTTCTTCGTCGTTTTCAGGCAACTGTGACAGGTGGTCAATATGCAAGCAAGGAACAAGCCATAGTTAGGAAATTTATGAAGGTCAACAATCATGTGACCTACAACCATCAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACGGAGAATGCTCTTTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCAGTGTATGCGACCTTGAAGATCAGAATCTATTTCTATGATTCGGTTCAAATTAATAAATATTGAATTTTATTATATCCGAAAGATGAGCATCAATTGTGCCCTCAAGTACATTGTACAATACATGTCTAATTGCCCTAATAACGTTGTTGATACTAATAACTCCTAAATGGTCTAAATACTTTATACATTGGTATCTAAATACTCTTAAGAAACGCGAGGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGCAGATTAGATAGCATTGGTGTAGTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATCTGCACTGTGATCATGTCGTGGTTCATCATGAATGGTCTCTCGCGGTGGTGGGTTATGTTGAAATAGAGGGGATTGTTGACCGTCCAGATATACACGCCATTCTCTGCCTGAGCTGCAGTGATGCGTTCCCCTGTGCGTGAATCCATGGTTGTGGCAACCTAGAGCGACGAAGTACGAACAACCACAAGGGAGATCAATTCTTCTCCTTCTATTGGTCTTCTTGGCGATTCGGTGTTGCACCTTGATTGGTACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCATTTTTTAAAGCCCAATGTTTAAGTGCGGTGTTCTTTTCCTCTTCCAAGAACTCTTTATAGCTGGAATGTGGTCCTGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATCCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTCCCGTACTTGGTGTTGCTTTGCCAGTCTCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGCTTTAGATAATGCGGATCGACGTCATCAATGACGTTATACCAAGCAGCATTATTGAACACTTTAGGACTTAAGTCTAAATGCCCACATAAGTAGTTATGTGGGCCCAATGACCTGGCCCACATTGTCTTCCCTGTACGACTATCGCCCTCTAACACAATGCTTATCGGTCTTAATGGCCGCGCAGCGGCACTAACAACGTTTCCGGCAACCCATTCATCAAGTTCCTCGGGGACTTGGTCAAAAGAAGAAGACAAGAAAGGACAAACAAAAACCTCTAAAGGAGGTGCAAAAATCCTATCTAAATTACTATGTAAATTATGAAACTGTAAAACAAAATCTTTGGGGGCCTTCTCCTTTAATATATTGAGGGCCGCTGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGATCGGCAACCTCCTCTAGCTGATCTTCCATCGATCTGGAAAACTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTTTCCATGTATGCTTTAACATCTGACGAGCTCTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATCTGAGGTCGAAGAACCTTTGATTTTTGCATTGGAATTTACCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTGAGGAGTCCCATCTTCGTGCAATTCCCTGCAAATCCTGATAAACAGTTTATTTGTTGGTGTTTCTATGGCTTGAATTTGGGAAAGTGCCTCTTCTTTGGTGAGAGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAGTTTTTAGCATTTATTCTGAATTTGCTTGGGGGAGCCATTGACCGGTCAATCGGTGTCTCTCAACTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGGAGACCCTAAATGGCAATATTGTAATTTCTTAAAGAAATTTAAATTCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATT >VNP1500-20 (DNA-B) ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTTTTACGTGGTCCCCGCACGCGTTTCTGACATTTGTGTCCATTCGATCAATCCCACCCATTGAAACTGAACACGTGTTACCATCTTAAGTCAGGGATGTTTCCACGTCTGTTTTCTATATATTGGTCCTATTCATCTCCTCTCTCATTTGTAAATAAAAATGAGAGTTCCAATCCGGAGGAATTCAGGCGTCAATTCTGATCGTCGTCCTTCCAATGGGTCAATCCACCGGTGGAACTACCCATATTCCAACTATTTTGGGAGGAGGATTGGCAACCGTGTATACGGCATGCCATTCGGAAACCAACAAGTGCAACGACGTGAGTTTAAGCAAACTCAACGTCTTACCAAGTCTGCTGAGCAGGTTTCATGTAGGAGGAAGTCTATGAAGACGGTTGAGGAAATACACGATGGCACTGACTACTTGCTGTGCAGTAACATGTCTAAGGTGTCGTATATTAGCTACCCGCCTCTATCCGGCACTGAATATGGTAGTAGAGCTGAGTCCTATATCAAAGTCTTGGGAGTCACTGTATCTGGGTCTGCTGTGCTGAAGCAGACGGGCATGCGTGAAGCAGATGGGTCTCAAGGAATTCATGGGATATTTACTACAGTACTTGTTCGTGACAAGAGACCATGTCAGTTCTCTGCCGTGGATCCGATCATCCCATTTGCGGAGCTGTTTGGACAAGAGAAGAGAGCATGCTCCTCATTACGTGTTAGAGATTCTTATAAGAATCGATTTAGTGTTGTCTACCAGAAGAAGCATGTAGTAAATAGTGCTCTATCAACACATGTATTTAGGTATAATTTTAATGTGAAATTCTCTAGATTTCCTTTCTGGGTGTCTTTCAAAGACACCTCCAACGCAGAGCCTACTGGGCGATATTCTAATGTGTCGAAGAACGCATTGGTTGTGTACTATGTTTGGCTATGTGATTCAAATGTAACAGCCGAAGTGCACGTGCAATATGATTTGAACTACATTGGATAAATAAAATCATATTTTTTTTACATTCGAGGAGACATTACTCCCCTCCATACATAGCTCAACAGTTTTTTTAATAATATTAATTACATCGTCATTTACTTTGTTGCTA CCTGCAACAACTTCCGACGCCGAAGGGCCTGGATCTAGGGTTCCATCTTGCAGCCGATGTAAATGTCTATATGGGTGCTCCTCTATGTCGTTGTTCTCCACTGTGCTGGCTGAAGCCCAAGTATGCCCCTGTGGAATGGCATTTGTAGTGTATCTGGAAGACTGTGACCTCATGTGTGTTAGGGCTTGTACTGGTTTTCTTGATACAGTTGATTGAGGCACATGCCAGAAATCTATGTGGTTCATGTTATACGCCTTTGATAGTATTTCAATCTTAGGGGACCGAAATGATATCTCGGAGGACTGTTTTGCAGAGGACATTTTTAACTTCCCTTGCATCCTGCAGAAGTGAACACCATTGATCACGTTAGTGTCTTCCACCCTGTACAACACCCTCCATGGGTTTGGGTCCTTGGGGGAGAAGTATGAGGATGAGTAGTAGTGTATATTACAGTTGCACCCTATGGGTATTGTGAACTCAGCCTGTTTTGAGTCCCCTTCGTGCAACCTTGTGTCGTGCATCTCTATGACCACATGACCAGTTGCATTTCCAGGTACTTGGTTCCGGTACTGGAGGATGACATGGTCAATCCTGAGACACTTTCCCAGAAGCATCGATAATTTTTGGTCGACGGTTGAGGGAAATAACAGAGTTACTTCTGTCTTCTCATTTGATAACTGAAATTCAGTCCTACCCGACGTCGTATAGGCAATATTGTTATTGCTGGACTCCATTATTGAATCTGCCAATACAATAATAGTAATTTAGCTTTTTATAGACTTTTCAGAGTCTGTCAGGATATTGGAATGTGACTAGCTGGGTCTTTGCATTTAAATTCCACTATATCAAAGGACCAACGAGATACTTCCACGTATGTACTTGACCTGAGAAGAGATAAGGTTATATACTTGGATGTGGTTCAGCCACGTCGCCAATTAGATAATGGACGACAGCTGTCGTCCACTATCAGGTCATTGATAGTTTCCAATATTAATAATTTAATTAACAGTTAAATTAAATGGAAACATATATTTGTATACGGTAGCAGCACAAGTTAACCGCTAAGCAGGACAAGATATCTTCTTCAAATAAACAATTATTTGTTAATCCCTACGAGTTG TCGTGGAATCGACAACCTAGTCTAATATTTAACTGATCCAACAATCGAATTATGAGCAAACACACACACTTGAACATACTAATCTTGAGAAAATCAGGCCGCGCAGCGGCTATGTGTCGAAATGTATCTACTATTCCGGAAGTGTTAACCCAGATTTATTATATGTAAATCTAAAAGAAAGCATATGAATTGTGTATTAGTGAAGGAATTGCAGAAGTTGTAGCTGACCTTGTTAGAGGGGAGCAAAACCAATGCAATATAATTATTGCATATGTTAATTAAATATTTCGAATTAAATTGTTGTAGAGAGAGAAAGTCTAGAGAGAAGGCAGAGCAATTGACCGGTCAATTGGTGTCTCTCAACTTGGGCTATGTAATTGGTGTCTGGGGTCTTATTTATATGGAGACCCTAAATGGCATTATTGTAATTTCTTAAAGAAATTAAAATTCCAAAAGCGGCCATCCGTATAATATT 4.5.1.3. Tổ chức bộ gen của mẫu PepYLCVNV (mẫu VNP1500) PepYLCVNV là một begomovirus có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử genome là DNA-A và DNA-B. Sơ đồ minh họa tổ chức bộ gen gồm cả DNA-A và DNA-B của mẫu virus PepYLCVNV được xác định bằng phần mềm Vector NTI Suite 7 được trình bày ở hình 4.14, bảng 4.17 và bảng 4.18. DNA-A ( Bảng 4.17) DNA-A của PepYLCVNV VNP1500 có kích thước, cấu trúc tương tự như các virus thuộc chi Begomovirus - nhóm Cựu thế giới. Toàn bộ phân tử DNA-A có kích thước 2733 nt. Trên DNA-A, chúng tôi đã xác định được 6 ORF (open reading frame, khung dịch mã, là trình tự DNA được bắt đầu bằng mã khởi đầu ATG và kết thúc bằng mã kết thúc TAA hoặc TGA hoặc TAG) đặc trưng của các begomovirus, gồm 2 ORF trên sợi virus (AV2, AV1, cùng chiều kim đồng hồ) và 4 ORF trên sợi bổ sung với sợi virus (AC4, AC1, AC2, AC3, ngược chiều kim đồng hồ). Trên sợi virus, ORF AV2 (mã hóa cho protein AV2 có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus) có kích thước 348 nt. Phía đầu 3’ của ORF AV2 là ORF AV1 (mã hóa cho protein vỏ CP) có kích thước 790 nt (263 aa). Tương tự như các begomovirus khác, trên sợi bổ sung, ORF lớn nhất là ORF AC1 (mã hóa protein Rep là protein có chức năng tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào), có kích thước 1068 nt, ORF nhỏ nhất là ORF AC4 (mã hóa protein AC4 có chức năng cảm ứng triệu chứng và di chuyển hệ thống) có kích thước 291 nt. Hai ORF còn lại là AC2 (mã hóa protein TrAP có chức năng hoạt hóa phiên mã và ức chế phản ứng phòng thủ của cây) có kích thước 402 nt và AC3 có kích thước 402 nt (mã hóa protein REn). Cũng giống như tất cả các beomovirus, ORF AC4 và ORF AC2 luôn nằm trên một khung đọc mã (c3). DNA-A có một vùng liên gen không phiên mã (IR, Intergenic Region) kích thước khoảng 266 nt có vị trí tính từ đầu 5’ của ORF AC1 tới đầu 5’ của ORF AV2 tương tự như IR của các begomovirus khác. Giống như các begomovirrus có bộ gen kép khác, trên vùng IR của DNA-A chứa một vùng chung CR có trình tự giống như vùng tương ứng trên DNA-B. Vùng này của DNA-A của PepYLCVNV VNP1500 dài 174 nts và chứa nguồn gốc tái bản (ori, origin of replication) với nhiều dấu hiệu quan trọng. Bảng 4.17. Đặc điểm phân tử DNA-A của mẫu PepYLCVNV VNP1500 Vị trí (từ nt đến nt) Kích thước (nt) DNA-A Toàn bộ phân tử 2733 Vùng liên gen IR 2597 – 129 266 Vùng chung CR 2601-41 174 AV1(CP) 290-1069 790 AV2 (AV2) 130-477 348 AC1(Rep) 1529-2596 1068 AC2 (TrAP) 1207-1608 402 AC3 (REn) 1062-1463 402 AC4 (AC4) 2149-2439 291 Ghi chú: CP (coat protein), IR (intergenic region), CR (common region), Rep (replication associated protein), TrAP (transcriptional activator protein), REn (replication enhancer), nt là nucleotide DNA-B (Bảng 4.18) DNA-B của PepYLCVNV VNP1500 có kích thước 2715 nt và chỉ chứa 2 ORF tương tự như DNA-B của các begomo có bộ gen kép khác. Trên sợi virus (chiều kim đồng hồ) là ORF BV1 mã hóa protein vận chuyển MP, có kích thước 831 nt. Trên sợi bổ sung, DNA-B chứa 1 ORF là BC1 mã hóa protein nhập nhân (NSP) với kích thước 831 nt. DNA-B chứa một vùng liên gen không phiên mã IR lớn, có kích thước 1041 nts. Tương tự DNA-A, vùng này chứa một đoạn ngắn dài 175 nt gọi là vùng chung (common region, CR) có trình tự bảo thủ cao với vùng chung CR của DNA-A. Mức độ đồng nhất giữa vùng chung CR của 2 thành phần tới 96.6% (Hình 4.15) và do đó cũng chứng tỏ 2 thành phần này thuộc cùng 1 virus. Vì trình tự vùng chung này giống với của DNA-A nên protein Rep được mã hóa trên DNA-A có thể nhận biết để khởi đầu quá trình tái sinh của DNA-B. Bảng 4.18. Đặc điểm phân tử DNA-B của mẫu PepYLCVNV VNP1500 Vị trí (từ nt đến nt) Kích thước (nt) DNA-B Toàn bộ phân tử 2715 Vùng liên gen IR 1855-180 1041 Vùng chung CR 2583-42 175 BV1 (MP) 181-1011 831 BC1 (NSP) 1024-1854 831 Hình 4.14. Tổ chức bộ gen của mẫu PepYLCVNV VNP1500 Hình 4.15. Vùng chung CR của mẫu PepYLCVNV VNP1500 với cấu trúc thứ cấp chứa điểm khởi đầu tái bản bộ gen được chỉ rõ Nhận xét: Phân tích đặc điểm phân tử của mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 chứng tỏ cấu trúc xâm nhiễm dựa trên mẫu virus này có bộ gen hoàn chỉnh. Ngoài ra, cây nguồn cà pháo được lây nhiễm bằng agroinoculation có phản ứng PCR dương tính với cả 2 thành phần chứng tỏ virus đã có thể tái sinh và di chuyển hệ thống trong cây. Vì các mô tiph chức năng liên quan tới cảm ứng triệu chứng của begomovirus khá đa dạng và nằm trên tất cả các gen nên chúng tôi đã không thể xác định được các đột biến này chỉ dựa trên phân tích phân tử. Thiết kế lại cấu trúc có lẽ cần thiết để nghiên cứu đặc điểm sinh học của virus PepYLCVNV. PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN - Đã điều tra và thu thập các mẫu triệu chứng bệnh begomovirus trên ớt tại Hà Nội năm 2017. Dạng triệu chứng điển hình là triệu chứng khảm lá. Tỉ lệ nhiễm virus cao nhất tại huyện Thạch Thất vào giai đoạn quả chín đạt 43,2%. - Đã kiểm tra ELISA trên 81 mẫu ớt thu thập khắp cả nước, phát hiện 2 mẫu phản ứng dương tính ChiVMV, 5 mẫu phản ứng dương tính PMMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepYMV và 1 mẫu phản ứng dương tính TYLCVs. - Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi chung BegoA-F1 và BegoA-R1 trên 14 ớt và 4 mẫu cà chua, kết quả kiểm tra cho thấy có 6 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua thu tại miền Trung và miền Nam có phản ứng dương. - Dùng mồi đặc hiệu để kiểm tra 9 mẫu dương tính với begomovirus, kết quả kiểm tra PCR cho thấy chỉ có 1 mẫu cà chua thu tại An Giang có phản ứng dương với Tomato yellow leaf curl Kachanaburi virus  (TYLCKaV), có 8/9 mẫu nhiễm với cả DNA-A và DNA-B của Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). - Đã giải trình tự bổ sung và nhận được trình tự đầy đủ bộ gen mẫu PepYLCVNV VNP1500 từ 2 cấu trúc xâm nhiễm. Phân tích bộ gen cho thấy bộ gen của virus trên cấu trúc xâm nhiễm là hoàn chỉnh, đảm bảo sự xâm nhiễm hệ thống của virus trong cây. Kết hợp kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân tích trình tự đã gợi ý có lẽ xuất hiện đột biến của virus trên cấu trúc xâm nhiễm liên quan cảm ứng triệu chứng. 5.2. KIẾN NGHỊ - Tiếp tục xác định thành phần loài virus trên cây ớt tại Hà Nội - Nghiên cứu sâu hơn về đặc trưng sinh học, phân bố của PepYLCVNV. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT: Bùi Bách Tuyến (1998). Bệnh hại cây ớt. Tài liệu hướng dẫn đồng ruộng (bản dịch tiếng việt). Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC). Bùi Thị Oanh (2010). Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp kỹ thuật đến khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của giống ớt lai số 03 năm 2009 - 2010 tại huyện Nam Đàn - Nghệ An. tr. 5-22. Hà Viết Cường (2010). Bài giảng Công nghệ sinh học trong bệnh cây. Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Hà Viết Cường (2011).Virus thực vật, phytoplasma và viroid. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1999). Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Mai Thị Phương Anh, Trần Văn Lài, Trần Khắc Thi (1996). Rau và trồng rau- giáo trình cao học nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. Mai Thị Phương Anh (1999). Kỹ thuật trồng một số loại rau cao cấp. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Thị Hà Uyên (2012). Xác định và đánh giá khả năng gây bệnh của một số begomovirus trên cây cà chua bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Văn Viên (1999). Nghiên cứu tình hình phát sinh phát triển và biện pháp phòng trừ một số bệnh nghiên cứu và bệnh xoăn lá hại cà chua vùng Hà Nội và phụ cận. Luận án Tiến sĩ nông nghiệp. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề chủ biên (2001). Giáo trình Bệnh cây Nông Nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội . Viện Bảo vệ thực vật (2000). Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.Tập 03. tr. 60-61. TIẾNG ANH: Avgelis A. D. (1986). A pepper strain of TMV who is new in Crete (Greece). Phytopathologia Mediterranea. 25(1-3). pp. 33-38. Bérenger J., M. F. Fabre, A. Palloix and B. Moury (2008). Charactezation of a new potyvirus infecting pepper crops in Ecuador, Brief report. Archives of Virology 153(1). pp. 1543-1548. Boulton M. I. (1995). Agrobacterium-mediated transfer of geminiviruses to plant tissues. Methods Mol Biol. 49(1). pp. 77-93. Bosland P.W. (1996). Capsicums: Innovative uses of an ancient crop. In: J. Janick (ed.), Progress in new crops. ASHS Press, Arlington, VA. pp. 479-487. Bosland P.W. and Votava 2000. Pepper: Vegetable and spice Capsicums. CABI Publishing. pp. 230. Briddon R., J. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini, X. Zhou and C. Fauquet (2008). Recommendations for the classification and nomenclature of the DNA-β satellites of begomoviruses. Archives of virology. 153(4). pp. 763. Briddon R. W. (2003). Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex. Molecular Plant Pathology. 4(1). pp. 427-434. Britton G. and D. Hornero-Méndez (1997). Carotenoids and Colour in Fruits and Vegetables. In: Tomás-Barberán FA, Robins RJ, editors. Photochemistry of Fruits and Vegetables. Oxford, England: Clarendon Press. pp. 11–28. Brunt A. A, K. Crabtree, M. J. Dallwitz, A. J. Gibbs, L. Watson (1996). Viruses of Plants: Descriptions and Lists from the VIDE Database. C.A.B. International, U.K. pp. 148. Brunt A.A. and R.H. Kenten (1972). Pepper veinal mottle virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 104/1972. Dowload date 15/11/2017 from Cerkauskas R. (2004). Pepper diseases, In the Fact Sheet, Asian Vegetable Research and Development Center. AVRDC Publication 04. pp. 586-596. Chakraborty S., P. Pandey, M. Banerjee, G. Kalloo and C. Fauquet (2003). Tomato leaf curl Gujarat virus, a new begomovirus species causing a severe leaf curl disease of tomato in Varanasi, India. Phytopathology. 93(12). pp. 1485. Chomchalow N. (2001). Spice production in Asia - An overview. AU journal of Technology. Vol 5, no 2. pp. 1. Doyle J. J. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem bull. Vol. 19 (1987). pp. 11-15. FAO (2012). Ngày truy cập 17/12/2018 tại FAO (2014). Ngày truy cập 20/12/2018 tại Fauquet C. M. & Stanley J. (2003). Geminivirus classification and nomenclature: progress and problems. Annals of Applied Biology. 142(2). pp. 165-189. Fauquet C. M., R. W. Briddon, J. K. Brown, E. Moriones, J. Stanley, M. Zerbini, X. Zhou (2008). Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Arch Virol. 153(4). pp. 783-821. Fauquet and Stanley (2005). Revising the way we conceive and name viruses below the species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new standardized isolate descriptors. Archives of virology. 150(10). pp. 2151-2179. Pickersgill B (1997). Genetic resources and breeding of Capsicum spp. Euphytica. 96(1). pp. 129-133. Gafni and Yedidya (2003). Tomato yellow leaf curl virus, the intracellular dynamics of a plant DNA virus. Molecular plant pathology. 4(1). pp. 9-15. Galanihe L. D., M. G. D. L. Priyantha, D. R. Yapa, H. M. S. Bandara, J. A. D. A. R. Ranasinghe (2004). Insect pest and disease incidences of exotic hybrids chilli pepper varieties grown in the low country dry zone of Sri Lanka. Annals of Sri Lanka Department of Agriculture. 6(1). pp. 99-106. Ghanim and Czosnek (2000). Tomato yellow leaf curl geminivirus (TYLCV-Is) is transmitted among whiteflies (Bemisia tabaci) in a sex-related manner. Journal of Virology. 74(10). pp. 4738-4745. Gibbs A. J., Trueman J. W. H., Gibbs M. J. (2008). The bean common mosaic virus lineage of potyviruses: where did it arise and when?. Arch Virol 153. pp. 2177–2187. Green S.K. and J.S. Kim (1991). Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center, Technical Bulletin. AVRDC Publication. No. 18. Green S.K. (1992a). Integrated control of diseases of vegetables in Taiwan, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan. AVRDC Publication. pp. 35-68. Green S.K. (1992b). Virus in Asia Pacific region. In the Proceedings of the Coference on chilli pepper production in the tropics, 13-14 October, 1992, Kuala Lumpua, Malaisia. pp. 99-129. Green S. K. (1993). Pepper virus research in Taiwan and other Asian countries. In the Proceedings of the Symposium on Plant viruses and Virus – like diseasea, Council of Agriculture Plant Protection. AVRDC Publication. Series No.1. pp. 213 – 243. Green S., W. Tsai, S. Shih, L. Black, A. Rezaian, M. Rashid, M. Roff, Y. Myint and L. Hong (2001). Molecular characterization of begomoviruses associated with leafcurl diseases of tomato in Bangladesh, Laos, Malaysia, Myanmar, and Vietnam. Plant Disease. 85(2). pp. 1286-1286. Gutierrez C., E. RamirezParra, M. Mar Castellano, A. P. Sanz-Burgos, A. Luque, and R. Missich (2004). Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary microbiology. 98(2). pp. 111-119. Ha C. (2007). Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam. A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy to the Queensland University of Technology. pp. 203-215. Ha C., S. Coombs, P. Revill, R. Harding, M. Vu and J. Dale (2008). Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation. Journal of General Virology. 89(1). pp. 312-326. Harrison and Robinson (2005). Another quarter century of great progress in understanding the biological properties of plant viruses. Annals of applied biology. 146(1). pp. 15-37. Hellens R., P. Mullineaux and H. Klee (2000). Technical Focus:a guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant. Sci 5. pp. 446-451. Hornero-Méndez D., J. Costa-García , M. I. Mínguez-Mosquera (2002). Characterization of carotenoids high-producing Capsicum annuum cultivars selected for paprika production. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50(20). pp. 5711–5716. Hussain M., S. Mansoor, S. Iram, Y. Zafar, R. W. Briddon (2004). First report of Tomato leaf curl New Delhi virus affecting chilli pepper in Pakistan. Plant Pathology. 53(1). pp. 794. Inoue N. A. K., M. E. N. Fonseca, R. O. Resend, L. S. Boiteux, D. C. Monte, A. N. Dusi, A. C. de Avila and R. A. A. vanderVlugt(2002). Pepper yellow mosaic virus, a new potyvirus in sweet pepper Capsicum annuum. Brief report, Archives of Virolog. 147(4). pp. 849-855. Jones D. R. (2003). Plant viruses transmitted by whiteflies. European Journal of Plant Pathology. 109(3). pp. 195. Than Po Po , Haryudian Prihastuti, Sitthisack Phoulivong, Paul, W.J. Taylor and Kevin D. Hyde (2008). Chilli anthracnose disease caused by Colletotrium species. J Zhejiang Univ Sci B. pp. 764-778. Tsai W. S., S. L. Shih, S. K. Green, A. Rauf, S. H. Hidayat, F. J. Jan (2006). Molecular characterization of Pepper yellow leaf curl Indonesia virus in leaf curl and yellowing diseased tomato and pepper in Indonesia. Plant Disease. 90(1). pp. 247. Jacquemond M. (2012). Cucumber mosaic virus. Adv Virus Res. Vol 84. pp. 439-504. Khan M. S., S. K. Raj, R. Singh (2006). First report of Tomato leaf curl New Delhi virus infecting chilli in India. Plant Pathology. 55(1). pp. 289. Kheyr-Pour A., M. Bendahmane, V. Matzeit, G. P. Accotto, S. Crespi and B. Gronenborn (1991). Tomato yellow leaf curl virus from sardinia is a whitefly-transmitted monoparatite geminivirus. Nucleic Acids Research. 19(24). pp. 6763-6769. Lipert L. F., P. G. Smith and B. O. Bergh (1996). Cytogenertics of thevegetable crops. Garden pepper, Capsicum ssp. Botanical Rev. 32(1). pp. 24-55. Markham P., I. Bedford, S. Liu, D. Frolich, R. Rosell and J. Brown (1996). Transmission of geminiviruses by biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius). Bemisia: 1995, taxonomy, biology, damage, control and management. pp. 69-75. Martínez Y., M. Quiñones, D. Fonseca, J. Potter J, D. P. Maxwell (2002). First report of Tomato yellow leaf curl virus infecting bean (Phaseolus vulgaris) in Cuba. Plant Disease. 86(7). pp. 814. Martínez‐Ayala A., S. Sánchez‐Campos, F. Cáceres, J. Navas‐Castill,  E. Moriones (2013). Characterisation and genetic diversity of pepper leafroll virus, a new bipartite begomovirus infecting pepper, bean and tomato in Peru. Annals of Applied Biology. 164 (1). pp. 62-72. Moury B., A. Palloix, C. Caranta, P. Gognalons, S. Souche, S. K. Gebre and G. Marchoux (2005). Serological, molercular and pathotype diversity of Pepper veinal mottle virus and Chilli veinal mottle virus. Phythopathology. 95(1). pp. 227-232. Moriones E. and J. Navas-Castillo (2000). Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71(1-2). pp. 123-134. Murugan and Uthamasamy (2001). Dispersal behaviour of cotton whitefly Bemisia tabaci (Genn.) under cotton based gardenland agro ecosystem of Coimbatore, Tamil Nadu. Madras agricultural journal. 88(1/3) . pp. 1-6. Navas Castillo J., G. P. Accotto, E. Noris, E. Moriones and D. Louro (2000). Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe. European Journal of Plant Pathology. 106(2). pp. 179-186. Navot N., E. Pichersky, M. Zeidan, D. Zamir and H. Czosnek (1991). Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology 185(1). pp. 151-161. Padidam M., S. Stanley and C. M. Fauquet (1999). Possible emergence of new geminiviruses by frequent recombination. Virology 265(2). pp.: 218-225. Perry L., S. Zamillo, Host, D. M. Pearsall, D. R. Pipemo and M. J. Berman (2007). Starch fossils and the domestication and dispersal of chili peppers (Capsicum spp. L.) in the Americas. Science. 315(5814). pp. 986-988. Pérez-Gálvez A., H. D. Martin, H. Sies, W. Stahl (2003). Incorporation of carotenoids from paprika oleoresin into human chylomicron. British Journal of Nutrition. 89(6) . pp. 787–793. Picó B., Díez M. J. and F. Nuez (1996). Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus-a review. Scientia Horticulturae. 67(3-4). pp. 151-196. Purcifull D.E. and E. Hiebert (1982). Tobacco etch virus. Descriptions of Plant Viruses. Retrieved on 10 November 2017 at Quiñones M., D. Fonseca, G. P. Acotto, Y. Martínez (2002). Viral infection associated with the presence of Begomoviruses in pepper plants in Cuba. Plant Disease. 86(2). pp. 73. Rashid M. H., K. M. Khalequzzaman, M. S. Alam, S. A. Uddin and S. K. Greenn (2007). Screening of different sweet pepper lines against Cucumber mosaic virus and Chili veinal mottle virus, Int. J. Sustain. Crop Prod. 2(3). pp. 1-4. Ravi K. S., J. Joseph, N. Nagaraju, P. S. Krishna, H. R. Reddy and H. S. Savithri (1997). Characterization of Pepper vein banding virus from chili pepper in India. Plant Disease. 81(6). pp. 673 - 676. Rochester D. E., W. Kositratana and R. N. Beachy (1990). Systemic movement and symptom production following agroinoculation with a single DNA of tomato yellow leaf curl geminivirus (Thailand). Virology 178. . pp. 520-526. Rybicki (1994). A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae."Archives of Virology . 139(1-2). pp. 49-77. Sarkar K. and K. Kulshreshtha (1978). Crotalaria striata DC. a new natural host of bean common mosaic virus. Current Science. 47(7). pp. 241. Shih S. L., W. S. Tsai, S. K. Green (2003). Molecular characterization of tomato and chilli leaf curl begomoviruses from Pakistan. Plant Disease 87. pp. 200. Shih S. L., W. S. Tsai, L. M. Lee, J. T. Wang, S. K. Green, and L. Kenyon (2010). First Report of Tomato yellow leaf curl Thailand virus Associated with Pepper Leaf Curl Disease in Taiwan. First Report of Tomato yellow leaf curl Thailand virus Associated with Pepper Leaf Curl Disease in Taiwan. Volume 94, Number 5. pp. 637. Stanley J., D. M. Bisaro, R. W. Briddon, J. K. Brown, C. M. Fauquet, B. D. Harrison, E. P. Rybicki and D. C. Stenger (2005). Geminiviridae. In: Virus Taxonomy. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. (C.M. Fauquet, M.A Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger and L.A. Ball, eds). London, UK: Elsevier/Academic Press. pp. 301 - 326. Varma A. and V. G. Malathi (2003). Emerging geminivirus problems: A serious threat to crop production. Annals of Applied Biology. 142(2). pp. 145-164. Wang M. Qi and A. J. Cutler (1993). A simple method of preparing plant samples for PCR. Nucleic Acids Research. 21(17). pp. 4153-4154. Wang T. C., R. D. Cardiff, L. Zukerberg, E. Lees , A. Arnold and E. V. Schmidt (1994). Mammary hyperplasia and carcinoma in MMTV-cyclin D1 transgenic mice. US National Library of MedicineNational Institutes of Health. 369 (6482). pp. 669-671. Wetter C., M. Conti, D. Altschuh, R. Tabillion, M. H. V. Regenmortel (1984). Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Phytopathology. 74(4). pp. 405-410. Wijs J. (1973). Pepper veinal mottle virus in Irovy Coast. Netherlands Journal of Plant Pathology.79(5). pp. 189 – 193. Yoon J. Y., S. K. Green, A. T. Tschanz, S. C. S. Tson and L. C. Chang (1990). Pepper improvement for the tropics: problems and the AVRDC approach, In: Tomato and Pepper production in the tropics. Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan. pp. 86-98. Zhang C., Wege and H. Jeske (2001). Movement proteins (BC1 and BV1) of Abutilon mosaic geminivirus are cotransported in and between cells of sink but not of source leaves as detected by green fluorescent protein tagging. Virology. 290(2) . pp. 249-260. Zhang D. Y., Y. Liu, C. R. Zhuang, W. S. Tsai, S. L. Shih, L. M. Lee, J. T. Wang and S. K. Green (2006). Survey for viruses-particularly begomovirses infecting pepper crops in China. Agricultural Science and Technology. 7(4). pp. 24.