Kiểm nghiệm vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí

toàn trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Đức Vinh LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể. Qua đây cho tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới: TS. Trần Thị Liên – Xí nghiệp thuốc thú y TW – Hoài Đức – Hà Nội. PGS.TS. Trương Quang – Khoa Thú y - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Những người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ long biết ơn tới Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; Viện đào tạo Sau đại học; Khoa thú y; Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm – Khoa thú y; Xí nghiệp thuốc thú y TW; Phòng Kiểm nghiệm vacxin, Tổ Vi trùng 2 – Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 23 tháng 9 năm 2009 Tác giả Nguyễn Đức Vinh MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn i Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CĐ: Cường độc Ig: Immuloglobulin KT: Kiểm tra MLD: Minimum Lethal Dose (Liều gây chết tối thiểu) OIE: Office International des Epizootie (Tổ chức dịch tễ Thế giới) TB: Trâu bò TCN: Tiêu chuẩn ngành THT: Tụ huyết trùng TK: Thuần khiết TL: Tỷ lệ VK: Vi khuẩn DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Sản lượng vacxin tiêu thụ của Xí nghiệp so với số lượng đàn trâu bò cả nước trong 5 năm trở lại đây 41 4.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết của 5 lô giống THT trâu bò sản xuất vacxin 45 4.3 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn THT trâu bò giống trong môi trường tăng sinh 46 4.4 Kết quả kiểm tra thuần khiết giống sau khi nhân giống lần 1 48 4.5 Kết quả đếm số lượng vi khuẩn giống sau khi nhân giống lần 1 49 4.6 Kết quả kiểm tra thuần khiết sau khi nhân giống lần 2 51 4.7 Kết quả đếm số vi khuẩn sau khi nhân giống lần 2 51 4.8 Kết quả kiểm tra vô trùng canh trùng sau khi vô hoạt bằng formol 53 4.9 Kết quả kiểm tra vô trùng bán thành phẩm sau khi hấp phụ keo phèn 54 4.10 Kết quả kiểm tra vô trùng của 5 lô vacxin vô hoạt THT trâu bò 56 4.11 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ 57 4.12 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với chuột bạch 58 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ 60 4.14 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với chuột bạch 62 4.16 Kết quả kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 6 tháng 65 4.17 Kết quả kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 9 tháng 66 4.18 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 1 tháng bảo quản 70 4.19 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 3 tháng bảo quản 70 4.20 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 6 tháng bảo quản 71 4.21 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 9 tháng bảo quản 72 4.22 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 12 tháng bảo quản 72 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1: Nhuộm gram vi khuẩn P.multocida 3 4.1. Đường biểu diễn độ dài miễn dịch của các lô vacxin 68 4.2. Đường biểu diễn độ dài bảo quản của các lô vacxin 73 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chăn nuôi trâu bò ở Việt Nam trong những năm qua đã và đang có những bước phát triển đáng kể nhằm cung cấp thịt sữa, sức kéo, nguyên vật liệu cho công nghiệp chế biến, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội. Trong sự phát triển đó, chúng ta luôn phải đối mặt với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, trong đó có bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò là một bệnh truyền nhiễm cấp tính và lần đầu tiên được mô tả bởi Bollinger (1878) tại Đức. Sau đó Kitt (1879) đã phân lập được vi khuẩn gây bệnh và gây bệnh thành công cho chuột bạch và bồ câu. Ngày nay người ta đã xác định được tác nhân gây bệnh Tụ huyết trùng trâu bò là Pasteurella multocida (P.multocida) thuộc serotype B:2 và E:2. Ở Việt Nam, bệnh Tụ huyết trùng trâu bò được phát hiện lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX (Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh, 1958[4]). Đến nay bệnh đã có mặt hầu hết ở các tỉnh, thành trong cả nước và gây thiệt hại đáng kể cho chăn nuôi trâu bò. Bệnh xảy ra lẻ tẻ quanh năm nhưng thường phát triển nhanh, mạnh vào mùa mưa và những giai đoạn chuyển mùa. Tuy vậy, bệnh không phát triển thành các ổ dịch lớn, mà xuất hiện rải rác, xảy ra trên diện rộng do vậy rất khó khăn trong công tác phòng chống và gây thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi. Để phòng chống bệnh Tụ huyết trùng trâu bò, ở Việt Nam trong những năm qua đã có nhiều nghiên cứu về vacxin phòng bệnh (Nguyễn Ngã, 1987[14]; Phan Thanh Phượng, 1990[22]). Trước đây, Xí nghiệp thuốc thú y đã sản xuất được vacxin tụ huyết trùng trâu bò nhưng với công nghệ cũ (phương pháp nuôi cấy tĩnh). Hiện nay, Xí nghiệp đã và đang áp dụng công nghệ lên men sục khí để nuôi cấy vi khuẩn trong quy trình sản xuất vacxin. Phương pháp này có những ưu điểm như: tăng nhanh mật độ vi khuẩn, rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao chất lượng vacxin. Theo quy định, bất cứ một loại vacxin nào sau khi sản xuất đều phải tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực. Ngoài ra còn định kỳ kiểm tra độ dài bảo quản và độ dài miễn dịch của vacxin đối với động vật thí nghiệm. Để hiểu rõ hơn những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Kiểm nghiệm vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí”. 1.2 Mục đích yêu cầu của đề tài Đánh giá được các chỉ tiêu: thuần khiết, vô trùng và đếm số lượng vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy giống sản xuất vacxin Tụ huyết trùng trâu bò bằng công nghệ lên men sục khí. Kiểm nghiệm chất lượng vacxin Tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí. Đánh giá được độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin Tụ huyết trùng trâu bò. 1.3 Ý nghĩa của đề tài Nghiên cứu và đánh giá lại một cách hệ thống về quá trình sản xuất cũng như kiểm nghiệm vacxin Tụ huyết trùng trâu bò, làm tiền đề cho những bước nghiên cứu tiếp theo về vacxin này. Độ dài miễn dịch và độ dài bảo quản của vacxin giúp cho Xí nghiệp thuốc thú y, các Chi cục, Trạm thú y và người chăn nuôi có thể đưa ra được kế hoạch sản xuất, tiêm phòng hợp lý và tiết kiệm nhất. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc tính chung của vi khuẩn P.multocida 2.1.1 Hình thái Vi khuẩn Pasteurella multocida có hình cầu trực khuẩn, bắt màu rõ ở hai đầu (lưỡng cực), gram âm, không di động, không hình thành nha bào, có khả năng tạo giáp mô. Kích thước vi khuẩn từ 0,6 - 2,5µm x 0,2 - 0,4 µm. Hình thái và kích thước của vi khuẩn có thể thay đổi tuỳ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy khác nhau (Rimler, 1992 [50]). Trong máu động vật, hình thái của vi khuẩn thường đồng nhất, còn khi phát triển trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình thái (hình trứng, hình cầu, hình que). Khi nuôi cấy trong môi trường có cho thêm carbonhydrate, vi khuẩn thường kết lại thành chuỗi dài (Rosenbusch và Merchant, 1939[52]). dùng để đánh giá chủng vi khuẩn có độc lực cao, thấp hay không có độc lực. Trên môi trường thạch huyết thanh, khuẩn lạc của vi khuẩn tạo ra các loại dung quang rất khác nhau. Vi khuẩn tạo khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng độc hơn so với vi khuẩn tạo khuẩn lạc có dung quang sắc xanh (Namioka và Murata, 1961[46]). 2.1.2 Đặc tính nuôi cấy Vi khuẩn P.multocida thuộc loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, chúng có thể phát triển tốt trong hầu hết các loại môi trường phổ thông. Môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn P.multocida có thể là môi trường đặc, lỏng hoặc bán lỏng. Trong môi trường nước thịt, sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn làm đục môi trường, canh trùng có mùi tanh rất đặc trưng, vài ngày sau nước thịt trở lên trong, đáy có cặn nhầy, lắc khó tan, trên mặt môi trường có lớp màng mỏng, khi lắc lớp màng này vỡ ra (Hoàng Đạo Phấn, 1986[16]). Trong môi trường thạch máu vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 370C, pH trong khoảng 7,2 - 7,4. Trong môi trường nuôi cấy nếu có thêm huyết thanh và huyết cầu tố thì vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn. Cấy chuyển liên tục trong môi trường nhân tạo có thể làm thay đổi một số đặc tính sinh học của vi khuẩn. Vi khuẩn P.multocida phát triển tốt hơn trong môi trường nhân tạo nếu cho thêm vào một số chất như cystein, glutamic acid, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường (Michael và cộng sự, 2002[43]). Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng thì các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động rất mạnh (Michael và cộng sự, 2002[43]); Shivachandra và cộng sự, 2006[56]). Theo tài liệu của OIE (2004) [47], môi trường tốt nhất cho vi khuẩn P.multocida phát triển là môi trường YPC (yeast extract peptone L-cystine) có thêm sucrose và sodium sulfite (Na2SO4). Nuôi cấy trên môi trường TSA (Tryptone Soya Agar) kích thước của khuẩn lạc sẽ lớn nhất. Vi khuẩn P.multocida phát triển trên môi trường YPC thạch máu sẽ tạo được kháng nguyên quan trọng hơn là cấy trên các môi trường tổng hợp khác. Đây cũng là môi trường giúp tái tạo giáp mô của vi khuẩn. Vi khuẩn P.multocida còn có khả năng mọc tốt trong môi trường chế từ đậu phụ. Tuy nhiên vi khuẩn P.multocida không phát triển trên môi trường thạch MacConkey. Để nuôi cấy vi khuẩn chế tạo vacxin người ta thường sử dụng môi trường cơ bản có thêm sucrose, peptone và chất chiết men bia. Môi trường Hottinger cũng rất tốt cho vi khuẩn Pasteurella phát triển. Nuôi cấy có sục khí có thể làm tăng sinh khối vi khuẩn lên gấp 20 lần so với nuôi cấy tĩnh. Nuôi cấy động trên máy lắc, vi khuẩn cần 12 giờ để đạt tới pha dừng, còn nuôi cấy có sục khí và khuấy đảo liên tục trong fermentor bằng công nghệ lên men hiện đại chỉ cần 5 - 6 giờ đã đạt mức phát triển tối đa. 2.1.3 Đặc tính sinh hoá Phản ứng sinh hoá có tính đặc trưng cho mỗi giống, loài vi khuẩn, vì vậy người ta thường sử dụng kết quả của phản ứng này để bước đầu giám định vi khuẩn cần nghiên cứu. Thông thường, để kiểm tra phản ứng lên men các loại đường của vi khuẩn, các nhà nghiên cứu tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cơ bản nước peptone 1% có chứa loại đường yêu cầu thử nghiệm ở nồng độ dùng là 1%. Đa số các chủng vi khuẩn P.multocida cho kết quả dương tính đối với galactose, glucose, mannose, sorbitol, xylose và sucrose. P.multocida còn có thể lên men mannit và mantose. Vi khuẩn P.multocida không làm tan chảy gelatin, không mọc trên môi trường khoai tây, không làm đông vón sữa. Các chủng vi khuẩn P.multocida có khả năng sinh indol, tuy nhiên thời gian đọc kết quả tuỳ thuộc vào môi trường sử dụng. Nếu dùng môi trường 1% peptone thì vi khuẩn cho phản ứng dương tính sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C. Khi dùng môi trường 2% peptone có bổ sung thêm chất chiết men bia và một số vitamine, vi khuẩn P.multocida cho phản ứng indol dương tính chỉ sau 18 - 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 370C. Vi khuẩn Pasteurella multocida sẽ mất đặc tính sinh indol khi cấy chuyển nhiều lần trên môi trường nhân tạo, nhưng sẽ có lại đặc tính này khi tăng cường giống bằng cách tiêm cho trâu, bò. Một số chủng thuộc P.multocida khi bảo quản sau 2 năm có thể không lên men xylose (De Alwis, 1992[35]). Đặc tính sinh hoá của các chủng P.multocida phân lập được tại các vùng khác nhau cũng có thể khác nhau. Vi khuẩn P.multocida phân lập được từ gia cầm bị bệnh tụ huyết trùng tại Việt Nam có đặc tính sinh hoá thông thường như lên men glucose, sucrose… Riêng đường sorbitol có 3 chủng luôn cho phản ứng âm tính, 3 chủng luôn cho phản ứng dương tính, 26 chủng còn lại cho kết quả thay đổi, lúc âm lúc dương (Phùng Duy Hồng Hà, 1990[6]). Các chủng thuộc P.multocida phân lập được từ các vùng dịch ở Sri-lanka lại không có chủng nào lên men đường lactose, salicin, adonitol, inositol và dulcitol (Wijewadana, 1994[59]). Ở một nghiên cứu khác, với vi khuẩn P.multocida phân lập từ lợn ở Úc và Việt Nam cho thấy khoảng 24,1% dương tính với đường lactose và 100% dương tính với đường sorbitol (Trần Xuân Hạnh, 2002[39]). Tính đồng nhất về kết quả phản ứng lên men đường của các chủng P.multocida serotype B:2 phân lập từ lợn hoặc trâu bò cũng được thông báo. Nhiều nghiên cứu thông báo rằng vi khuẩn P.multocida không có khả năng gây dung huyết (Rimler và cộng sự, 1992[50]). Tuy nhiên Diallo và Frost (2000) [36], qua thực nghiệm lại cho thấy: các chủng vi khuẩn P.multocida khi nuôi cấy trong các môi trường nhân tạo không có khả năng phân huỷ hồng cầu, nhưng nếu các vi khuẩn này sau khi được xử lý với dung dịch Tween 80 nồng độ 0,5% trong 1 giờ thì khả năng này lại xuất hiện. Vi khuẩn có khả năng phân huỷ hồng cầu gà, thỏ, cừu, ngựa, trâu bò và cả hồng cầu người. Tuy nhiên hoạt tính đối với hồng cầu của các loài khác nhau thì khác nhau. 2.2 Kháng nguyên của P.multocida Cho đến nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P.multocida có 3 loại chính là kháng nguyên giáp mô (K), kháng nguyên thân (O) và các kháng nguyên protein khác. 2.2.1 Kháng nguyên giáp mô (K) Giáp mô vi khuẩn P.multocida chứa polysaccharide. Nhìn chung, kháng nguyên giáp mô có tính kháng nguyên yếu và không có khả năng tạo được sự bảo hộ chuột và thỏ khi thử thách bằng công cường độc (Rimler và Rhoades, 1989[49]). Rất khó có thể tách được kháng nguyên giáp mô với độ tinh khiết cao, do vậy khi đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của loại kháng nguyên này cần lưu ý để tránh kết luận không chính xác vì có thể lẫn các kháng nguyên khác. Có sự khác nhau về thành phần cũng như tỷ lệ các loại đường chứa trong kháng nguyên vỏ lấy từ các serogroup khác nhau của vi khuẩn gây bệnh Tụ huyết trùng. Polysaccharide từ P.multocida serotype B:2 có chứa monosacchride arabinose, mannose và galactose với tỷ lệ 0,5:2:0 (Muniandy và cộng sự, 1992[45]), trong khi đó kháng nguyên giáp mô của nhóm huyết thanh D và F của vi khuẩn P.multocida lại chứa heparin và chondroitin sulfate (Rimler, 1994[51]). Muniandy và cộng sự, 1992[45] cũng xác nhận rằng polysaccharide tinh khiết chiết xuất từ giáp mô của P.multocida không có khả năng gây độc và tạo miễn dịch bảo hộ chuột khi tiêm với liều 300µg/con. 2.2.2 Kháng nguyên thân (O) Kháng nguyên thân lipopolysaccharide của vi khuẩn P.multocida được Pirosky thông báo vào năm 1938. Có thể phát hiện kháng nguyên thân bằng phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch (Heddleston và cộng sự, 1972[40]). Hiện nay, có 16 loại kháng nguyên thân đã được xác định, các kháng nguyên này được đánh theo số từ 1 đến 16 (Heddleston và cộng sự, 1972[40]). Lipopolysaccharide là kháng nguyên thân quan trọng, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao và đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch dịch thể (Ryu và Kim, 2000[53]). Dựa vào thành phần carbonhydrate, lipo-polysaccharide của vi khuẩn P.multocida có thể chia thành 4 type hoá học I, II, III và IV (Rimler, 1992[50]). 2.2.3 Kháng nguyên protein Các protein của vi khuẩn P.multocida được coi là những chất có khả năng sinh miễn dịch cao. Các nhà nghiên cứu sử dụng phản ứng nhuộm màu với thiazine đỏ, đem xử lý bằng nhiệt và enzyme đã xác định được 6 trong số 16 kháng nguyên nằm sâu bên trong là protein và đã kết luận rằng các kháng nguyên giáp mô có chứa protein, đặc biệt là kháng nguyên α và β. Vi khuẩn P.multocida có chứa protein màng ngoài (outer membrane protein - OMP), mà một số protein màng ngoài có đặc tính kháng nguyên. Những năm gần đây tính chất kháng nguyên của protein màng ngoài của vi khuẩn P.multocida cũng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. 2.3 Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 2.3.1 Lịch sử bệnh Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò được Bollinger phát hiện lần đầu tiên ở bò tại Đức vào năm 1878. Hiện nay bệnh xuất hiện ở nhiều nước trên thế giới thuộc châu Á, châu Phi và gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò. 2.3.2 Nguyên nhân gây bệnh Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò thể bại huyết xuất huyết là P. multocida thuộc serotype B:2 hoặc E:2. Các đặc điểm về hình thái, nhuộm gram, nuôi cấy, tính chất sinh vật hoá học… giống các đặc điểm chung của giống Pasteurella như đã miêu tả ở phần trên. 2.3.3 Phân bố địa lý và mùa vụ Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò xảy ra ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước thuộc châu Á và châu Phi. Tại châu Á vi khuẩn gây bệnh thường thuộc serotype B:2 và ở châu Phi là serotype E:2 (theo phân loại của Carter-Heddleston) (OIE, 2004[47]). Kumar và cộng sự, 1996[41] còn phân lập được vi khuẩn P.multocida thuộc serotype A:1 và A:3 gây bệnh Tụ huyết trùng cho trâu bò tại Ấn Độ. Ở một số nước như Ai Cập và Sudan tồn tại vi khuẩn thuộc cả 2 serotype B:2 và E:2 (Shigidi và Mustafa, 1979[55]). Trong một nghiên cứu khi giám định 42 chủng vi khuẩn P.multocida phân lập được tại các vùng khác nhau của Sudan thì có tới 38 chủng (chiếm 90,5%) thuộc serotype B và chỉ có 4 chủng (chiếm 9,5%) thuộc serotype E. Tại Nhật Bản cũng đã phát hiện ra bệnh vào năm 1923, nhưng không gây thành dịch và không biểu hiện rõ về dịch tễ (Carter, 1982[32]). Nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng trâu bò tại Ấn Độ cho thấy vùng ít xảy ra dịch thì tỷ lệ trâu, bò mang trùng hầu như không có, vùng thường xuyên có dịch thì tỷ lệ trâu, bò mang trùng có khi chỉ đạt khoảng 7,5% (Gupta, 1980[38]). Sri-Lanka là một trong những nước có tỷ lệ trâu bò bị bệnh nhiều nhất. Tỷ lệ trâu bị bệnh là 45,2%, cao hơn nhiều so với tỷ lệ bò bị bệnh (15,8%). Tại vùng thường xuyên có dịch, tỷ lệ trâu bệnh chỉ khoảng 29% và những con bị chết đa phần là những con nghé non, còn ở vùng ít xảy ra dịch thì khi có dịch tỷ lệ trâu bị bệnh rất cao, tới 64,5% và con bệnh ở bất cứ tuổi nào cũng có thể chết (De Alwis, 1992[35]). Tỷ lệ trâu bò khoẻ mạnh mang trùng tại Sri-Lanka cũng rất cao, khi gặp những điều kiện bất lợi, sức khoẻ của những con trâu bò mang trùng này giảm sút và nguy cơ phát bệnh hoàn toàn có thể xảy ra (De Alwis và cộng sự, 1990[34]). Nghiên cứu tại vùng Punjab thuộc Pakistan thấy rằng 11% trâu bò mang trùng, tỷ lệ trâu bệnh là 9% và tỷ lệ tử vong lên tới 78%; ở bò tỷ lệ tương ứng có thấp hơn 4%, 2,5% và 62%. Trâu bò thường bị bệnh vào mùa mưa, các mùa khác tỷ lệ trâu bò bị bệnh Tụ huyết trùng chiếm rất nhỏ. Bệnh chủ yếu xảy ra ở trâu bò có độ tuổi dưới 24 tháng và ở đàn có số lượng ít hơn 10 con (Sheikh và cộng sự, 1996[54]). Tại Cameroon, bệnh tụ huyết trùng trâu bò lần đầu tiên được phát hiện tại vùng Maga ở giống bò Zebu. Khi phân lập thấy vi khuẩn gây bệnh thuộc serotype B:2, serotype này ít phổ biến tại châu Phi. Việc nghiên cứu sự bảo hộ đối với chuột, các tác giả thấy rằng giống vi khuẩn để sản xuất vacxin được dùng tại đây thuộc serotype E:2 (Martrenchar và Njanpop, 1994[42]). Tại Namibia, dịch bệnh Tụ huyết trùng xảy ra ở trâu thường xuyên và nhiều hơn ở bò, đặc biệt là những vùng ẩm ướt, có nhiều đầm lầy, trâu hay ngâm tắm càng tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển và lây lan (Voigts và cộng sự, 1997[58]). Một thể bệnh khác của bệnh Tụ huyết trùng là thể viêm phổi, gây ra bởi vi khuẩn P.multocida thuộc các serotype khác cũng được nghiên cứu tại các nước thuộc châu Âu và châu Mỹ. Tại Anh quốc và xứ Wales, trâu bò bị bệnh ở thể viêm phổi, nguyên nhân chủ yếu do vi khuẩn thuộc serotype A, một số ít thuộc serogroup E (Hodgson và cộng sự, 2005[49]). Hươu, nai ở châu Âu bị bệnh Tụ huyết trùng thường xuyên hơn trâu bò. Năm 1990 có 13 con hươu bị chết tại xứ Wales, các vi khuẩn phân lập được đều thuộc serotype A:3,4 (Carrigan, 1991[31]). Năm 1999, Aalbeak và cộng sự, 1999[28] phát hiện ổ dịch tụ huyết trùng xảy ra ở hai loài hươu nhỏ tại Đan Mạch và nhận thấy tỷ lệ hươu khoẻ mạnh mang trùng tại Đan Mạch lên tới 27%. 2.3.4 Thiệt hại kinh tế do bệnh Tụ huyết trùng trâu bò gây ra Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò. Tại Việt nam, thống kê trong 10 năm từ 1986 - 1995 dịch bệnh tụ huyết trùng trâu bò là nguyên nhân gây chết hơn 70% số trâu bò chết bệnh hàng năm. Trong một số vụ dịch, nhiều hộ nông dân bị chết tới 4 - 5 con trâu bò, ảnh hưởng rất lớn đến sản xuất và kinh tế gia đình (Bùi Quý Huy, 1998[11]). Dương Thế Long, 1994[13] điều tra dịch bệnh Tụ huyết trùng trâu bò tại Sơn La từ năm 1980 đến 1993 thấy rằng số lượng trâu bò chết do dịch bệnh trâu bò biến động từ 21 đến 155 con/tháng. Số lượng trâu bò chết tại tỉnh Lạng Sơn trong vòng 6 năm từ 1991 - 1996 cũng rất nhiều, nhiều hộ gia đình không còn trâu bò để cày kéo (Đỗ Văn Được, 1998[5]). Tại một số tỉnh phía nam, dịch bệnh Tụ huyết trùng trâu bò cũng là nguyên nhân gây chết hàng nghìn con trâu bò mỗi năm như ở Long An, Minh Hải, Kiên Giang, Bình Phước (Nguyễn Vĩnh Phước và cộng sự, 1988[18]). Những năm gần đây dịch bệnh xảy ra có ít hơn, nhưng thiệt hại kinh tế do dịch bệnh tụ huyết trùng gây ra là không nhỏ. Trên thế giới, dịch bệnh tụ huyết trùng trâu bò gây thiệt hại nặng nề nhất là ở châu Á, đặc biệt là ở Ấn Độ, Pakistan, Sri lanka và các nước thuộc vùng Đông Nam Á. Theo các báo cáo, bệnh Tụ huyết trùng hàng năm tại Indonesia làm chết khoảng 4000 - 6000 con (Darrmadi, 1991[33]), tại Lào thiệt hại do bệnh khoảng 1,5 triệu USD/năm (Souriya, 1991[57]), khoảng 1 triệu USD/năm tại Malaysia (Rahim, 1991[48]). Một số nước khác như Thái Lan, trâu bò bị bệnh tụ huyết trùng khoảng 10.000 con/năm, Ấn Độ từ 30.000 - 50.000 con/năm (Bain, 1963[30]). 2.3.5 Động vật thụ cảm Trâu và bò là những loài mắc bệnh chủ yếu, trâu bị nhiều và nặng hơn bò. Các loài động vật khác nhau có sự mẫn cảm khác nhau đối với vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò. Mức độ mẫn cảm của các loài động vật khi thí nghiệm với vi khuẩn P.multocida thuộc serotype B:2 được trình bày theo thứ tự giảm dần như sau: thỏ - chuột bạch - trâu bò - chuột lang - bồ cầu - lợn - ngựa - cừu, dê (thay đổi) - chó, gà, vịt (không mẫn cảm) (Bain và cộng sự, 1982[29]). Một số báo cáo ở Ấn Độ cho biết đã phân lập được P.multocida serotype B:2 ở gà. Lạc đà cũng được coi là có sức đề kháng, tuy nhiên có những ca bệnh được ghi nhận ở Sudan. Năm 2002, Elfaki và cộng sự[37] thông báo về các trường hợp lạc đà bị bệnh Tụ huyết trùng tại Saudi Arabia. Gần đây, Mochabo và cộng sự 2005[44] thống kê các bệnh thường xảy ra ở lạc đà tại Kenia (châu Phi) thấy rằng bệnh Tụ huyết trùng đứng thứ 4, với tỷ lệ bò bệnh 7,7%. Những ca bệnh tụ huyết trùng ở hươu cũng được thông báo ở xứ Wales (Carrigan, 1991[31]). Trong thời gian từ 1992 - 1996, tại Đan Mạch có tới 257 hươu bị chết do P.multocida gây ra (Eriksen, 1999). Tỷ lệ hươu khoẻ mang trùng tại Đan Mạch lên tới 27% (Aalbaek, 1999[24]). Một số ổ dịch Tụ huyết trùng trâu bò có thể xảy ra đồng thời với bệnh Tụ huyết trùng ở lợn và ngựa. Tại Quảng Ninh đã xác nhận xác lợn rừng chết trong ổ dịch Tụ huyết trùng trâu bò (Bùi Quý Huy, 1998[11]). Năm 2002, tại Kontum có ghi nhận một ổ dịch Tụ huyết trùng ở trâu, bò và lợn. Ổ dịch bắt đầu xảy ra ở lợn, sau đó lây sang cho trâu bò (Trần Xuân Hạnh, 2002[39]). 2.3.6 Cách phát sinh và lây lan bệnh Đến nay nhiều công trình đã xác nhận nguồn lây bệnh chính là những trâu bò khoẻ mạnh mang trùng. Tỷ lệ mang trùng có liên quan mật thiết đến tần số xuất hiện của dịch Tụ huyết trùng trong vùng. Bệnh phát sinh khi điều kiện chăn nuôi sút kém như chuồng trại chật chội, dinh dưỡng kém. Quy mô ổ dịch rộng hay hẹp tuỳ theo điều kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịch của toàn đàn. 2.3.7 Triệu chứng và bệnh tích 2.3.7.1 Triệu chứng lâm sàng Thể quá cấp tính Ở thể quá cấp tính trâu bò có thể chết mà không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng. Một số trường hợp ở thể quá cấp tính con vật sốt cao tới 41 - 420C, hung dữ điên cuồng, đập đầu vào tường, đổ ngã, chân co giật từng cơn, mắt trợn ngược rồi chết (Hodgson và cộng sự, 2005[49]). Thể cấp tính Khi trâu bò bị bệnh Tụ huyết trùng do các chủng thuộc serotype B:2 hoặc E:2 gây nên ở thể cấp tính có các triệu chứng sốt cao, thở khó, chảy nước mũi, sùi bọt mép rồi chết. Nhiễm trùng máu là đặc trưng chung, gặp ở tất cả các trường hợp do vi khuẩn P.multocida thuộc serotype B:2 gây ra. Trong đa số trường hợp có triệu chứng phù nề ở vùng yếm cổ, ở một số con đực có biểu hiện dịch hoàn bị sưng (De Alwis, 1992[35]). Một số triệu chứng lâm sàng khác: nước tiểu có màu vàng, tiết nhiều nước bọt, cổ họng bị sưng, thở khò khè rồi chết (Sheikh và cộng sự, 1996[54]). Trong trường hợp gây bệnh thực nghiệm, bệnh xảy ra ở thể cấp tính, triệu chứng thường thấy sốt 39,4 - 40,10C, con vật mệt mỏi, kém ăn, sau 36 giờ có con sốt cao tới 41,50C. Phân táo, sau đó con vật có hiện tượng ho, khó thở, tần số hô hấp tăng, phân loãng dần có lẫn máu. Nước mũi đặc nhầy, có lẫn máu, phù thũng xuất hiện ở một số vùng, điển hình là vùng hầu - vùng yếm, vùng bẹn. Con vật chết thường bụng chướng to, chết trong trạng thái ngạt thở, truỵ hô hấp, truỵ tim (Đỗ Tuấn Cương và cộng sự, 2004[3]). Thể mãn tính Bệnh tiến triển chậm, triệu chứng lâm sàng thể hiện ở mức độ nhẹ. Nếu ghép với một số bệnh khác thì con vật dễ chết, nếu không con vật sẽ khỏi bệnh, nhưng thường gầy yếu và cho năng suất thấp. 2.3.7.2 Bệnh tích Bệnh tích đại thể Bệnh tích đại thể của bệnh Tụ huyết trùng trâu bò thể cấp tính rất đặc trưng và điển hình. Tổ chức liên kết dưới da bị thuỷ thũng, dịch phù nhầy có màu vàng nhạt. Thông thường bệnh tích này xuất hiện ở vùng hầu, vùng yếm, dưới lớp da cổ. Ngoài ra là bệnh tích của viêm phổi thuỳ. Bệnh tích vi thể Khi nhuộm HE đối với bệnh phẩm cơ tim thì thấy các sợi cơ mô liên kết tách rời nhau, có nơi xuất hiện dày đặc hồng cầu hoặc sợi cơ thoái hoá, tại tổ chức mô liên kết có sự hiện diện của các vi khuẩn hình que. Đối với các bệnh phẩm là lách: các mô lympho bị teo, có nhiều tế bào lympho non, có các điểm hoại tử nhỏ ở phần tuỷ đỏ, hơi phù nề và có các điểm phù mờ với vi khuẩn hình que, tăng sinh các tế bào đại thực bào (OIE, 2004[47]; Đỗ Tuấn Cương và cộng sự, 2004[3]). 2.3.8 Phòng và điều trị bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 2.3.8.1 Phòng bệnh Biện pháp tiêm phòng kết hợp với vệ sinh thú y, chăm sóc, nuôi dưỡng và các biện pháp thú y khác là rất quan trọng trong việc phòng bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Phòng bệnh bằng vacxin: là biện pháp chủ động và mang lại hiệu quả cao. Cho đến nay ở nước ta theo Cao Văn Hồng [8], có một số loại vacxin vô hoạt sử dụng để phòng bệnh tụ huyết trùng bao gồm: - Vacxin Tụ huyết trùng trâu, bò keo phèn chủng Robert I: sử dụng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ và miền nam Trung Bộ. Ưu điểm của loại vacxin này là liều tiêm thấp 2ml/con, thời gian miễn dịch kéo dài, tỷ lệ miễn dịch cao. Nhược điểm là sau khi tiêm một tỷ lệ gia súc bị phản ứng, nên người chăn nuôi rất ngại dùng. - Vacxin Tụ huyết trùng trâu bò nhũ dầu chủng P52: Do Phạm Quang Thái và cộng sự của công ty thuốc thú y Trung ương 2 nghiên cứu sản xuất. Vacxin này có ưu điểm là liều tiêm ít, có độ dài miễn dịch kéo dài (12 tháng), độ an toàn cao, vacxin này hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các tỉnh miền Nam. (Phạm Quang Thái, 2007[24]) - Vacxin Tụ huyết trùng chủng Iran: trong những năm 1956 - 1992 là loại vacxin được chế dưới dạng Bacterin, sau đó được cải tiến để nâng cao hiệu lực bằng cách cho thêm chất bổ trợ là Al(OH)3. Liều dùng 2 ml/con, thời gian miễn dịch 6 - 7 tháng. Hiện nay loại vacxin này đang được sử dụng rộng rãi ở các tỉnh duyên hải nam Trung Bộ và Tây Nguyên. - Vacxin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ hoá: được Viện Thú y Quốc gia nghiên cứu dùng chủng P52 có bổ trợ dầu maccon và montanit để sản xuất. Vacxin có dạng nhũ tương, liều tiêm 2ml/con, thời gian miễn dịch trên 12 tháng (Phan Thanh Phượng, 1990 [22]. Vacxin đã được thử nghiệm trên địa bàn một số tỉnh: Hà Nội, Hà Tây, Đăk Lăk, Hoà Bình… và được đánh giá cao (Phan Địch Lân, 1998[12]). - Vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu, bò do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất, các chủng T2, T3, T4, T5 có nguồn gốc từ Trung Quốc. Trước những năm 90 sản xuất theo phương pháp nuôi cấy tĩnh nên liều tiêm lớn (10 - 15 ml/con). Do đó, người sử dụng không ưa chuộng. Sau cải tiến phương pháp sản xuất bằng lên men sục khí và cho thêm chất bổ trợ keo phèn, tạo được lượng vi khuẩn tụ huyết trùng cao gấp hàng chục lần so với phương pháp nuôi cấy tĩnh nên đã rút liều tiêm xuống còn 1 - 2ml/con. Vacxin hiện đang được dùng rộng rãi ở các tỉnh Bắc Bộ và miền Trung. 2.3.8.2 Điều trị Có rất nhiều loại kháng sinh có thể dùng để điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu bò. Tuỳ vào từng vùng, từng trại mà có thể sử dụng các chủng loại kháng sinh khác nhau trên cơ sở kết quả của kháng sinh đồ. Một số kháng sinh đã dùng như streptomycine sulfate, kanamycine sulfate, terramycine, chlortetrasone, ofloxacin novobocin, neomycine, lincomycine (Phạm Văn Chức, 1994[2]; Sa Đình Chiến, 2001[1]). Theo Phan Thanh Phượng, 1986[20] thì kháng huyết thanh cũng được dùng để điều trị bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Ngoài ra một số kháng sinh khác cũng được dùng để điều trị bệnh Tụ huyết trùng trâu bò như enrofloxacine, aspoxicillin, ceftiofur, marbofloxacin mang lại hiệu quả điều trị cao. 2.4 Vacxin và sử dụng vacxin phòng bệnh động vật 2.4.1 Khái niệm vacxin Trước thế kỷ 19 dịch đậu mùa lan tràn khắp các Châu lục, giết chết nhiều người. Quan sát các ổ dịch đậu mùa thì thấy những người thợ vắt sữa bò rất ít mắc bệnh, thậm chí còn không bao giờ mắc bệnh này. Đi sâu tìm hiểu được biết trong thời gian vắt sữa bò, trên tay những người này đã từng mọc những nốt đậu loét do bò sữa bị bệnh đậu truyền sang. Từ những quan sát thực tiễn trên, năm 1876 Gienne đã đưa ra nhận định rằng: virus đậu bò khi lây sang người đã tạo được trạng thái đặc biệt giúp cơ thể người không nhiễm virus đậu mùa nữa. Trạng thái đặc biệt này về sau được gọi là trạng thái miễn dịch của cơ thể. Từ nhận định của mình, Gienne đã dùng vẩy đậu bò sấy khô nghiền với nước muối sinh lý thành huyễn dịch và đem huyễn dịch chủng cho người. Tại vị trí chủng huyễn dịch đậu bò mọc lên những nốt đậu, nốt đậu vỡ ra tạo nên nốt loét và nhanh chóng trở l._.ại bình thường, chỉ để lại vết sẹo nhỏ. Những người được chủng virus đậu bò suốt đời không bị nhiễm virus đậu mùa nữa. Từ những thành công này về sau các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu để chế tạo ra nhiều loại vacxin phòng bệnh cho người và gia súc như: vacxin phòng bệnh Lao cho người, vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia cầm, vacxin phòng bệnh Nhiệt thán… (Tô Long Thành, 2009[26]). Trước đây thuật ngữ vacxin được dùng để chỉ một chế phẩm sinh học được chế từ vi sinh vật dùng để gây miễn dịch phòng bệnh truyền nhiễm. Ngày nay không chỉ có vacxin phòng bệnh truyền nhiễm mà còn có vacxin phòng bệnh ký sinh trùng. Vì vậy, thuật ngữ vacxin được hiểu rộng hơn đó là một chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật, sẽ kích thích cơ thể tạo ra trạng thái miễn dịch giúp cơ thể chống lại kháng nguyên đó. 2.4.2 Thành phần của vacxin Vacxin bao gồm hai thành phần chính: kháng nguyên và chất bổ trợ (Lê Văn Tạo (2006)[23]). 2.4.2.1 Kháng nguyên Trước đây kháng nguyên được quan niệm là một chất lạ có bản chất là protein, khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu, kháng thể đặc hiệu sẽ trung hoà kháng nguyên đó. Ngày nay khi nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cơ thể các nhà khoa học thấy rằng khi cơ thể nhận được kháng nguyên sẽ không chỉ sản sinh kháng thể đặc hiệu (đáp ứng miễn dịch dịch thể) mà còn tạo ra một lớp tế bào mẫn cảm, các tế bào này cũng có khả năng tạo phản ứng với kháng nguyên (đáp ứng miễn dịch tế bào). Vì vậy theo Đỗ Trung Phấn (1979) [15], Phan Thanh Phượng (1989) [21], kháng nguyên được hiểu là chất khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể và tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại sự xâm nhập và gây bệnh của kháng nguyên đó. Khả năng kích thích sinh miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào của kháng nguyên gọi là tính kháng nguyên.Tính kháng nguyên của một kháng nguyên trong vacxin mạnh hay yếu phụ thuộc vào tổng số nhóm quyết định kháng nguyên, trọng lượng phân tử, thành phần hoá học, cấu trúc lập thể và khả năng tích điện của các phân tử kháng nguyên. Một kháng nguyên tạo miễn dịch phòng vệ tốt cho cơ thể ngoài tính kháng nguyên mạnh còn cần phải có tính đặc hiệu cao. Tính đặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc vào tính chất và cấu trúc của các nhóm quyết định kháng nguyên. Kháng nguyên dùng chế tạo vacxin phòng bệnh truyền nhiễm gồm có: + Thường là kháng nguyên của vi sinh vật, có thể bao gồm kháng nguyên thân, lông, vỏ bọc và độc tố của chúng sản sinh ra trong quá trình phát triển (vacxin toàn khuẩn - vacxin thế hệ I) như: vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm; bệnh Phó thương hàn lợn con…. + Có thể là thành phần các yếu tố gây bệnh của vi sinh vật (vacxin tiểu phần - vacxin thế hệ II) như: vacxin chứa kháng nguyên F4, F5, F6, F18 của vi khuẩn E.coli dùng phòng bệnh tiêu chảy lợn con, bê, nghé, phù đầu lợn; vacxin chứa kháng nguyên VP2 của virut Gumboro dùng phòng bệnh Gumboro của gà. + Có thể là AND, protein tái tổ hợp (vacxin gen - vacxin thế hệ III) như: vacxin tái tổ hợp phòng bệnh Lở mồm long móng và bệnh lưỡi xanh; vacxin Trovac phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 và bệnh đậu gà. 2.4.2.2 Chất bổ trợ Trong quá trình chế tạo vacxin người ta thấy rằng nếu vacxin chỉ chứa kháng nguyên thì khi tiêm phòng sẽ tạo hiệu lực bảo hộ thấp, không kéo dài, phản ứng xảy ra với tỷ lệ cao. Nhưng khi cho thêm những chất không phải là kháng nguyên vào vacxin sẽ làm cho hiệu lực và thời gian bảo hộ của vacxin tăng lên. Các chất đưa vào vacxin được gọi là chất bổ trợ. Chất bổ trợ của vacxin là những chất có hoạt tính kích thích miễn dịch không đặc hiệu, dùng bổ sung vào vacxin để nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch. Như vậy, tác dụng của chất bổ trợ khi bổ sung vào vacxin là: - Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn - Tạo đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể - Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vacxin đối với cơ thể. Căn cứ vào bản chất, thành phần cấu tạo của chất bổ trợ, Phan Thanh Phượng (1985) [19] chia chất bổ trợ đang được dùng để chế tạo vacxin hiện nay thành các nhóm sau đây: + Chất bổ trợ vô cơ: bao gồm hydrocyte nhôm, photphat nhôm, sulfat nhôm kali, các loại thuốc nhuộm, than hoạt tính. Các chất bổ trợ vô cơ thường hấp phụ kháng nguyên lên bề mặt để tăng cường kích thích sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể, đồng thời giải phóng kháng nguyên từ từ vào hệ bạch huyết, kéo dài thời gian kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Với mầm bệnh có sản sinh độc tố, sau khi đã được vô hoạt (giải độc tố) cũng được chất bổ trợ hấp thu và giải phóng từ từ để hạn chế tác động gây phản ứng cục bộ và toàn thân. + Chất bổ trợ hữu cơ: bao gồm các loại dầu thực vật: dầu hướng dương, dầu lạc, dầu ôliu, các loại mỡ động vật, các sản phẩm của dầu khoáng. Các chất bổ trợ hữu cơ khi hỗn hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu. Ở dạng nhũ tương này kháng nguyên nằm trong huyễn dịch dầu. Để khắc phục các nhược điểm của vacxin nhũ nước trong dầu như: dễ phân lớp, rít kim khi tiêm, các nhà khoa học đã nghiên cứu chế tạo loại vacxin dạng nhũ tương kép nước trong dầu trong nước. Khi vacxin nhũ có chứa xác vi khuẩn được gọi là vacxin nhũ hoàn toàn, vacxin nhũ không chứa xác vi khuẩn được gọi là vacxin nhũ không hoàn toàn. Tác dụng của chất bổ trợ dầu trong vacxin cũng tương tự như tác dụng của chất bổ trợ vô cơ. Nhờ các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước mà kháng nguyên tự do được giải phóng từ từ vào cơ thể để kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch kéo dài, đồng thời các hạt nhũ cũng di chuyển từ chỗ tiêm vào hạch lympho hoặc đến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch để kích thích miễn dịch phi đặc hiệu. Kết quả liều tiêm vacxin giảm, hiệu lực miễn dịch tăng cao, thời gian miễn dịch kéo dài. 2.4.3 Phân loại vacxin Có nhiều cách phân loại vacxin: căn cứ vào hoạt tính của mầm bệnh, thành phần kháng nguyên có trong vacxin hoặc công nghệ chế tạo vacxin. 2.4.3.1 Phân loại vacxin căn cứ vào hoạt tính của mầm bệnh Căn cứ vào hoạt tính của mầm bệnh chứa trong vacxin, thì vacxin được chia thành hai loại: * Vacxin vô hoạt: là vacxin chứa kháng nguyên là mầm bệnh đã được làm vô hoạt bằng các yếu tố vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia tử ngoại; bằng hoá chất như: các loại thuốc nhuộm, các loại axit, formon hoặc từng phần của mầm bệnh đã được chiết tách, tinh chế. Vacxin vô hoạt có ưu điểm là độ an toàn cao nhưng có nhược điểm lớn là tạo miễn dịch phòng hộ chậm (14 - 21 ngày), thời gian miễn dịch ngắn, hiệu lực phòng vệ hạn chế, liều tiêm vacxin lớn. Để khắc phục những nhược điểm trên, căn cứ vào tính chất kháng nguyên, mục đích sử dụng mà người ta bổ sung vào vacxin chất bổ trợ để giảm tỷ lệ phản ứng, nâng cao và kéo dài thời gian, khả năng tạo miễn dịch phòng vệ của vacxin.Vì vậy vacxin vô hoạt lại được chia ra: vacxin vô hoạt có chất bổ trợ và vacxin vô hoạt không có chất bổ trợ. Vacxin vô hoạt không có chất bổ trợ được gọi là vacxin bacterin. Thành phần của vacxin bacterin chỉ chứa kháng nguyên tạo miễn dịch. Ưu điểm của vacxin này là công nghệ chế tạo đơn giản, phù hợp với các nước có trình độ công nghệ thấp, giá thành rẻ. Hạn chế: độ dài miễn dịch ngắn (2 - 3 tháng), hiệu lực miễn dịch phòng vệ không cao (60 - 70%), tỷ lệ gây phản ứng khi tiêm cao. Thường dùng chế tạo vacxin phòng các bệnh không đòi hỏi thời gian miễn dịch kéo dài, vacxin chế từ các chủng vi sinh vật có độc lực thấp không sản sinh độc tố, vacxin cho qua đường miệng. Hiện tại vacxin bacterin còn tồn tại rất ít như vacxin E.coli cho uống phòng bệnh phân trắng và tiêu chảy ở lợn con. Vacxin vô hoạt có chất bổ trợ là loại vacxin trong thành phần của nó ngoài kháng nguyên đã vô hoạt còn được bổ sung chất bổ trợ. Các chất bổ trợ thường được dùng có thể là chất bổ trợ vô cơ như: than hoạt tính, kết tinh tím (Crytal Violet), keo phèn (Aluminium hydrocyte), nước phèn chua hoặc các chất bổ trợ hữu cơ như: các loại dầu thực vật, dầu khoáng. Các chất bổ trợ trong vacxin sẽ hấp phụ kháng nguyên hoặc tạo thành phức hợp với kháng nguyên để làm tăng cường và kéo dài kích thích miễn dịch của vacxin đối với cơ thể, đồng thời giảm kích thích gây phản ứng của độc tố có trong vacxin chưa được vô hoạt triệt để. Vacxin vô hoạt có chất bổ trợ có ưu điểm rất an toàn. Tuy hiệu lực được nâng cao hơn (80 - 90%) và thời gian duy trì miễn dịch kéo dài hơn (4 - 6 tháng với bổ trợ vô cơ và 9 - 12 tháng với bổ trợ hữu cơ) so với vacxin bacterin nhưng vẫn kém vacxin nhược độc. Thời gian tạo miễn dịch phòng vệ vững chắc vẫn chậm. Thường dùng chế tạo vacxin phòng các bệnh đã được khống chế hoặc thanh toán, dùng tiêm phòng cho các vùng an toàn dịch bệnh, cơ sở chăn nuôi gia súc gia cầm giống. Vacxin vô hoạt đang được dùng ngày càng rộng rãi ở các nước phát triển, thay thế vacxin nhược độc đặc biệt là vacxin vô hoạt có chất bổ trợ hữu cơ (vacxin nhũ hoá). * Vacxin nhược độc: là loại vacxin chứa kháng nguyên là mầm bệnh còn sống đã được làm yếu đi hoặc vô độc nhưng không làm thay đổi tính kháng nguyên. Ưu điểm của vacxin nhược độc, tạo miễn dịch phòng hộ nhanh (7 - 14 ngày), hiệu lực miễn dịch cao và kéo dài. Thường dùng để chế tạo các loại vacxin phòng bệnh do virus gây ra, sử dụng phòng các bệnh thường lưu hành, khi phòng chống dịch khẩn cấp. Vacxin này ngày càng hạn chế sử dụng ở các nước phát triển. Ở Việt Nam, vacxin nhược độc vẫn còn được sử dụng, phần lớn vacxin phòng bệnh do virus gây ra. Một số vacxin nhược độc hiện tại đang dùng như: vacxin phòng bệnh Newcastle, Dịch tả vịt, Gumborro… 2.4.3.2 Căn cứ theo thành phần của kháng nguyên * Vacxin toàn khuẩn (vacxin thế hệ I): vacxin này chứa kháng nguyên là toàn bộ xác mầm bệnh, độc tố do mầm bệnh sản sinh ra và các sản phẩm trao đổi chất của mầm bệnh trong quá trình phát triển và nhân lên. Vacxin toàn khuẩn chế tạo dễ dàng, không cần công nghệ phức tạp và giá thành rẻ. Hạn chế của vacxin là liều tiêm nhiều, hiệu giá kháng thể phòng vệ đặc hiệu đối với yếu tố, thành phần gây bệnh của mầm bệnh thấp. Gia súc được tiêm phòng phải tạo đáp ứng miễn dịch với các loại kháng nguyên không đặc hiệu có trong vacxin. Trên thế giới vacxin toàn khuẩn đang dần dần được thay thế bởi vacxin thế hệ mới. Ở Việt Nam hiện nay vacxin dùng phòng bệnh cho động vật chủ yếu là vacxin toàn khuẩn. * Vacxin tiểu phần (vacxin thế hệ II): vacxin tiểu phần còn được gọi là vacxin chiết tách. Sau khi tạo sinh khối vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lên men (đối với vi khuẩn) hoặc nuôi cấy trên động vật, trên môi trường tế bào (đối với virus), người ta dùng các phương pháp công nghệ sinh học tách riêng từng loại kháng nguyên, từng tiểu phần kháng nguyên là yếu tố gây bệnh của mầm bệnh. Sau đó dùng kháng nguyên hoặc tiểu phần kháng nguyên phối hợp với chất bổ trợ để chế tạo vacxin. Để chế tạo vacxin tiểu phần phải thực hiện quy trình chế tạo phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại nên giá thành vacxin cao. Vacxin này chỉ kích thích đáp ứng miễn dịch phòng vệ đặc hiệu với kháng nguyên hoặc tiểu phần kháng nguyên là yếu tố gây bệnh nên hiệu giá kháng thể phòng vệ đặc hiệu cao. Vacxin tiểu phần có ưu điểm là an toàn và hiệu lực cao hơn so với vacxin toàn khuẩn, liều tiêm ít và không gây phản ứng khi tiêm. Vacxin chiết tách ngày càng xuất hiện nhiều trên thị trường thế giới thay thế cho vacxin toàn khuẩn, thí dụ: vacxin chứa các loại kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18 dùng phòng bệnh tiêu chảy ở gia súc do vi khuẩn E.coli gây ra. Vacxin phối hợp kháng nguyên O và kháng nguyên K của vi khuẩn Pasteurella mulltocida phòng bệnh Tụ huyết trùng trâu bò… Ở Việt Nam đang bắt đầu nghiên cứu chế tạo vacxin thế hệ II dùng phòng bệnh phù đầu lợn con và bệnh Gumboro ở gà. * Vacxin tái tổ hợp (vacxin thế hệ III): là loại vacxin được chế tạo từ các chủng vi sinh vật được tạo ra bởi công nghệ gen và công nghệ protein. Để có được các chủng vi sinh vật tái tổ hợp (recombinant) chứa kháng nguyên đặc hiệu của nhiều giống, nhiều loài, nhiều serotype hoặc phân type, trước tiên phải xác định được những gen chịu trách nhiệm kiểm soát tổng hợp những protein chủ yếu của kháng nguyên có nhiệm vụ kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ đặc hiệu của mầm bệnh. Bằng công nghệ gen, chuyển các gen đã chọn vào các plasmid vector rồi vào AND của vi sinh vật mang. Nuôi cấy tạo sinh khối vi sinh vật mang, bằng công nghệ protein tách, tinh chế kháng nguyên đặc hiệu, dùng kháng nguyên chế tạo vacxin. Để chế tạo vacxin tái tổ hợp phải sử dụng công nghệ gen để tạo giống vi sinh vật, cần những thiết bị công nghệ hiện đại chế tạo vacxin nên giá thành cao. Nhưng đây là loại vacxin chứa kháng nguyên đặc hiệu có độ tinh khiết cao, tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mạnh cho cơ thể nên hiệu lực phòng vệ cao, thời gian miễn dịch kéo dài, liều tiêm vacxin ít, không gây những đáp ứng miễn dịch phụ, ít phản ứng. Khi tạo được chủng vi sinh vật mang gen nhiều loài, nhiều serotyp hoặc phân type sẽ chế tạo được vacxin đa giá, đa type, tiêm một mũi vacxin phòng được nhiều bệnh, nhiều type, giảm công tiêm, giảm stress cho vật nuôi được tiêm phòng. Trên thế giới, nhiều loại vacxin tái tổ hợp đã được sản xuất và lưu hành trên thị trường, thí dụ: vacxin E.coli phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con, vacxin Trovac của hãng Merial phòng bệnh cúm gia cầm và đậu gà, vacxin phòng bệnh Lở mồm long móng và bệnh lưỡi xanh của trâu bò. Ở Việt Nam, bước đầu đã có những công trình nghiên cứu cơ bản đặt nền móng cho việc nghiên cứu chế tạo vacxin tái tổ hợp trong thời gian tới như: nghiên cứu tạo chủng Salmonella enteritidis bằng phương pháp biến nạp của Trương Nam Hải (2005) [7], nghiên cứu chuyển gen VP2 của virus Gumboro vào vi khuẩn E.coli khả biến (Nguyễn Bá Thành (2006) [25]). 2.4.4 Bảo quản và sử dụng vacxin - Bảo quản vacxin: Khả năng tạo miễn dịch phòng vệ của vacxin cho cơ thể động vật được tiêm phòng cao hay thấp không chỉ phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác, trong đó có việc bảo quản vacxin sau sản xuất, quá trình vận chuyển và sử dụng. Muốn đảm bảo tính ổn định của kháng nguyên trong vacxin, phải căn cứ vào từng loại, từng dạng vacxin để có chế độ bảo quản khi cất giữ, vận chuyển thích hợp trước và trong khi sử dụng. Vacxin sau khi sản xuất, được nhập kho bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C và khi xuất bán, vận chuyển đến người sử dụng bằng xe lạnh chuyên dụng. Cán bộ thú y trực tiếp đi tiêm phòng phải bảo quản vacxin trong phích lạnh, thùng bảo ôn hoặc hộp xốp có đá. Trước khi tiêm, vacxin được lấy ra, để trở lại nhiệt độ tự nhiên mới dùng tiêm vào cơ thể động vật. Vacxin chưa dùng phải được bảo quản ở nhiệt độ âm đối với vacxin virus nhược độc và nhiệt độ lạnh dương (2 - 80C) đối với vacxin vô hoạt. Trong quá trình bảo quản vacxin trong kho lạnh, tủ lạnh, phích đá, hộp xốp, không được lấy ra, để lại nhiều lần để tránh làm cho vacxin đông tan nhiều lần. Nếu trên nhãn vacxin, nhà sản xuất có quy định phương pháp bảo quản vacxin thì phải tuyệt đối thực hiện nghiêm túc chế độ bảo quản theo hướng dẫn. Chỉ được bảo quản vacxin trong thời hạn cho phép theo quy định của nhà sản xuất ghi trên nhãn. - Sử dụng vacxin: vacxin tốt, bảo quản đúng quy trình nhưng sử dụng vacxin không đúng kỹ thuật cũng không tạo được miễn dịch phòng hộ cao cho động vật được tiêm phòng, dễ gây phản ứng, thậm chí gây chết động vật, vì vậy để đảm bảo tiêm phòng vacxin đạt hiệu quả cao cần lưu ý một số điểm sau: Vacxin là chế phẩm sinh học thường được dùng để phòng bệnh cho động vật khoẻ, chưa mắc bệnh, nếu tiêm cho động vật đã nhiễm bệnh thì bệnh có thể phát ra sớm hơn, nặng hơn. Vacxin phòng bệnh nào thì chỉ phòng bệnh đó. Không phải động vật nào được tiêm vacxin cũng đều có miễn dịch như nhau và có khả năng chống được sự xâm nhiễm của mầm bệnh, vì hiệu lực của vacxin phụ thuộc vào sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật, vì vậy nên tiêm cho động vật ở trạng thái khoẻ mạnh thì sẽ có đáp ứng miễn dịch tốt. Không được dùng vacxin đã hết hạn. Việc bảo quản và sử dụng của vacxin phải theo đúng sự hướng dẫn và liều chỉ định đã ghi trên nhãn bao bì. Pha vacxin đông khô với nước sinh lý hoặc nước cất vô trùng. Vacxin pha xong phải dùng ngay trong thời gian từ 2 - 4 giờ. Lắc kỹ lọ vacxin trước khi dùng, dùng đúng liều, tiêm đúng vị trí (liều quá cao hoặc quá thấp đều không có tác dụng. Liều quá cao gây tê liệt miễn dịch, gây phản ứng và không an toàn với con vật. Liều quá thấp thì không đủ tạo miễn dịch). Dụng cụ (bơm tiêm, kim tiêm) đều phải được vô trùng bằng cách luộc sôi hoặc hấp và sau đó để nguội mới đem sử dụng. 2.4.5 Những phản ứng phụ không mong muốn khi tiêm phòng vacxin Khi đưa vacxin vào cơ thể, cơ thể sẽ có những phản ứng tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể hoặc miễn dịch tế bào để chống lại mầm bệnh xâm nhập, gây bệnh. Mức độ phản ứng của cơ thể đối với vacxin tiêm phòng phụ thuộc vào bản chất của vacxin và trạng thái mẫn cảm của cơ thể. Một số vacxin có thể gây ra phản ứng dị ứng như sốt, run rẩy, nôn mửa, thở gấp, nổi mẩn trên da… nếu phản ứng nhẹ thì sau một thời gian sẽ hết nhưng cũng có một số cá thể có phản ứng thể hiện thành triệu chứng cần được xử lý kịp thời. 2.4.5.1 Phản ứng cục bộ Đây là dạng phản ứng nhẹ, thường xảy ra sau khi tiêm 2 - 4 giờ tại vị trí tiêm, với các triệu chứng: vị trí tiêm vacxin sưng tấy, đỏ, nóng, đôi khi có thuỷ thũng, con vật khó chịu, ăn ít, mệt mỏi. Nếu phản ứng nhẹ, nơi tiêm sưng nhỏ, không lan rộng, không cần can thiệp, sau 24 giờ phản ứng sẽ mất. Nếu nơi tiêm sưng to có thuỷ thũng, con vật mệt mỏi, dùng dầu nóng xoa bóp nơi sưng 2-3 lần/ngày, cho động vật nghỉ ngơi, ăn uống tốt sau 2-3 ngày sẽ khỏi. 2.4.5.2 Phản ứng toàn thân Thường xảy ra khi tiêm vacxin chế tạo từ mầm bệnh có sản sinh độc tố, ở động vật có loại hình thần kinh mẫn cảm, động vật gầy yếu do nuôi dưỡng kém hoặc mắc các bệnh mãn tính, động vật đang trong giai đoạn ủ bệnh. Phản ứng toàn thân có thể xảy ra sau khi tiêm vacxin vài giờ đến 1-2 ngày với các triệu chứng: sốt, mệt mỏi, ăn ít đến bỏ ăn, thở khó. Nếu phản ứng nhẹ, chỉ cần để động vật nghỉ ngơi yên tĩnh nơi thoáng mát, cho ăn thức ăn loãng, giàu đạm, tiêm các loại vitamin, thuốc trợ sức, trợ lực. Khi con vật sốt cao, các triệu chứng toàn thân nặng, dùng kháng sinh kết hợp với các loại vitamin B1, vitamin C tiêm bắp. Chăm sóc nuôi dưỡng tốt, để gia súc nghỉ ngơi đến khi hết triệu chứng. 2.4.5.3 Sốc quá mẫn Thường xảy ra ngay sau khi tiêm vacxin, do vacxin chứa lượng độc tố cao chưa được vô hoạt triệt để, động vật gầy yếu do bị bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng thể mạn tính, động vật có loại hình thần kinh mẫn cảm với kích thích. Biểu hiện của sốc quá mẫn là con vật thở khó, niêm mạc mắt, mũi đỏ ửng, các cơ nhất là cơ vân run mạnh, xuất hiện các biểu hiện thần kinh như giãy giụa, kêu rống. Khi phản ứng nặng, con vật đi đại, tiểu tiện tự do, sùi bọt mép, niêm mạc tím tái. Khi con vật sốc quá mẫn phải can thiệp khẩn trương, kịp thời. Trước hết đưa ngay vào nơi thoáng mát, yên tĩnh, để đầu cao hơn một chút cho động vật dễ thở. Tiến hành các biện pháp cấp cứu như xoa bóp vùng ngực để tăng tần số hô hấp và nhịp tim. Tiêm Adrenalin, truyền tĩnh mạch dung dịch sinh lý mặn hoặc ngọt có phối hợp với vitamin B1 và C. 2.5 Miễn dịch học động vật 2.5.1 Khái niệm miễn dịch Vacxin khi đưa vào cơ thể có tác dụng tạo miễn dịch cho cơ thể người và động vật để chống lại các bệnh truyền nhiễm. Từ xa xưa, con người đã nhận thấy có những bệnh truyền nhiễm chỉ gặp ở một số loài động vật và trong cùng một vụ dịch có thể có cá thể mắc nặng, có cá thể mắc nhẹ. Mặt khác, có những bệnh sau khi con vật bị bệnh qua khỏi thì vĩnh viễn không bị mắc lại, tức là con người đã biết tới những gì mà ngày nay chúng ta gọi là miễn dịch. Đối với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, con người đã có một quá trình đấu tranh phòng chống để giành giật lấy sự sống. Để phòng chống bệnh dại, một nhà khoa học nổi tiếng người Hy Lạp (384-322 Trước Công nguyên) đã đề nghị chặt bỏ tổ chức bị chó dại cắn. Đấu tranh phòng chống bệnh đậu mùa, một bệnh cực kỳ nguy hiểm của loài người trong những thế kỷ trước ở thời kỳ sơ khai, người ta đã biết lấy vẩy mụn đậu mùa phơi khô, tán nhỏ cho người lành hít để gây bệnh nhẹ, tạo nên một trạng thái miễn dịch. Phương pháp này mang lại những hiệu quả nhất định nhưng nguy hiểm, không kiểm soát được liều lượng nên có thể gây chết người hoặc tạo ra những ổ dịch trong cộng đồng. Bước ngoặt lịch sử trong phòng, chống bệnh đậu mùa được đánh dấu vào năm 1798 do Edward Jenner, một thầy thuốc vùng Gloucestershive (thuộc Vương quốc Anh) đã dùng dịch mủ trong mụn đậu bò để chủng cho người tạo trạng thái miễn dịch chống bệnh đậu mùa. Đây là phát minh quan trọng trong sự phát triển của miễn dịch học, mở đầu cho việc nghiên cứu về khả năng bảo vệ đặc hiệu của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh. Sau đó, Luis Pasteur trên cơ sở này đã thành công trong việc chế tạo vacxin phòng bệnh Nhiệt thán, bệnh Tụ huyết trùng gia cầm và bệnh dại. Mặc dù là môn học ra đời muộn nhưng miễn dịch học đã phát triển rất mạnh vào những năm cuối của thế kỷ XVIII - XIX và đã trở thành một môn khoa học cơ sở của rất nhiều môn học khác như: sinh lý học, sinh hoá học… Miễn dịch học là nền tảng của các hiểu biết cơ bản để có thể học và hiểu được sự hoạt động của hệ thống miễn dịch trong việc bảo vệ cơ thể động vật và con người chống lại các tác nhân gây bệnh, hiểu được những thay đổi đáp ứng miễn dịch trong một số trường hợp bệnh lý và ứng dụng miễn dịch trong việc chẩn đoán, phòng bệnh, điều trị bệnh cho người, động vật. Khái niệm Miễn dịch là trạng thái đặc biệt của một cơ thể sống không mắc phải những tác động có hại của các yếu tố gây bệnh như: vi sinh vật, các chất độc do chúng tiết ra hoặc các chất lạ khác, trong khi các cá thể cùng loài hoặc khác loài bị tác động trong điều kiện sống và lây bệnh tương tự. Hay nói một cách đơn giản hơn: miễn dịch là khả năng tự vệ của cơ thể, là khả năng nhận ra và loại trừ các vật lạ ra khỏi cơ thể. Cơ thể có miễn dịch do hai cơ năng bảo vệ đó là miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu. Khả năng miễn dịch của cơ thể liên quan tới cơ năng hoạt động của cơ thể, đặc tính của mầm bệnh và điều kiện ngoại cảnh. Vì vậy tính miễn dịch cũng biểu hiện ở các mức độ khác nhau: + Cơ thể có miễn dịch cao: mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể nhưng không gây được bệnh, mầm bệnh sẽ bị loại trừ. + Cơ thể có miễn dịch thấp: mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể và gây thành bệnh nhưng biểu hiện bệnh lý chỉ ở một mức độ nhất định. + Cơ thể không có miễn dịch: mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể sẽ gây thành bệnh với các triệu chứng bệnh tích điển hình, cơ thể bị đầu độc, phá huỷ và dẫn đến tử vong. 2.5.2 Phân loại miễn dịch Có nhiều cách phân loại miễn dịch như: dựa vào tính chất của miễn dịch, căn cứ vào đối tượng miễn dịch hay dựa vào tính đặc hiệu hoặc không đặc hiệu… 2.5.2.1 Căn cứ vào tính chất của miễn dịch chia miễn dịch thành các loại sau - Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch bẩm sinh): là đặc tính không mắc phải một bệnh hay một số bệnh nào đó do một giống vi sinh vật nhất định gây ra. Thí dụ: người không mắc Dịch tả lợn, ngựa không mắc Lở mồm long móng... Miễn dịch này mang tính chất di truyền. Miễn dịch tự nhiên được chia thành hai loại: + Miễn dịch tự nhiên tuyệt đối: là loại miễn dịch mà trong bất cứ điều kiện nào khả năng miễn dịch của cơ thể không bị phá vỡ. + Miễn dịch tự nhiên tương đối: là loại miễn dịch trong điều kiện nhất định có thể không cảm thụ với bệnh nhưng trong điều kiện khác tính miễn dịch bị phá vỡ, cơ thể lại mắc bệnh. Thí dụ: Gà không mắc bệnh Nhiệt thán nhưng nếu ngâm chân gà trong nước đá lạnh làm thân nhiệt giảm, tiêm vi khuẩn Nhiệt thán thì gà sẽ mắc bệnh. - Miễn dịch tiếp thu: là loại miễn dịch cơ thể thu được trong quá trình sống sau khi tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh đã qua khỏi, sau khi tiêm huyết thanh miễn dịch hoặc sau khi tiêm vacxin. Miễn dịch tiếp thu được chia thành hai loại: + Miễn dịch tiếp thu chủ động: miễn dịch có được do hệ thống miễn dịch của cơ thể sinh ra sau khi tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh hoặc tiêm vacxin. Miễn dịch tiếp thu chủ động được chia thành hai loại: Miễn dịch tiếp thu chủ động tự nhiên: là loại miễn dịch cơ thể có được sau khi tình cờ tiếp xúc với mầm bệnh và qua khỏi. Miễn dịch tiếp thu chủ động nhân tạo: là loại miễn dịch có được do con người chủ động đưa vacxin vào cơ thể, cơ thể tạo ra miễn dịch. Đây là hình thức tập dượt cho cơ thể có sức chống đỡ lại yếu tố gây bệnh. Ứng dụng: Dùng vacxin phòng bệnh cho người và gia súc là biện pháp căn bản và chủ động để khống chế, tiến tới thanh toán bệnh truyền nhiễm. + Miễn dịch tiếp thu bị động: miễn dịch mà con vật có được không phải do cơ thể tạo ra mà được cung cấp từ bên ngoài. Miễn dịch tiếp thu bị động chia làm hai loại: Miễn dịch tiếp thu bị động tự nhiên: là loại miễn dịch cơ thể có được do kháng thể đặc hiệu từ mẹ truyền sang cho con một cách tự nhiên. Thí dụ: Gia súc non và trẻ sơ sinh nhận được kháng thể đặc hiệu từ mẹ qua nhau thai hoặc bú sữa đầu. Hoặc gia cầm mới nở nhận được kháng thể đặc hiệu từ mẹ qua lòng đỏ trứng. Kháng thể này thuộc lớp IgG. Miễn dịch này giúp cho cơ thể non có sức đề kháng với các tác nhân gây bệnh nhưng thời gian tồn tại miễn dịch này ngắn. Ứng dụng: Cho gia súc non và trẻ sơ sinh bú sữa đầu; ở gia cầm mới nở miễn dịch kéo dài khoảng 21 ngày tuổi, lợn con sau khoảng 45 ngày tuổi. Sau thời gian này phải tiêm vacxin cho chúng. Miễn dịch tiếp thu bị động nhân tạo: là loại miễn dịch cơ thể có được do con người chủ động đưa vào cơ thể kháng thể đặc hiệu. Kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ máu của động vật mắc bệnh đã qua khỏi, của con vật được tiêm vacxin hoặc trong máu của con vật được tối miễn dịch. Người ta lấy máu của những động vật này rồi chắt lấy huyết thanh gọi là kháng huyết thanh và dùng để phòng hoặc chữa bệnh. Miễn dịch xuất hiện ngay sau khi tiêm kháng huyết thanh và thời gian tồn tại từ 3 - 4 ngày, không quá 1 tuần. Đây là hình thức chi viện tạm thời giúp cơ thể chống lại sự xâm nhập ồ ạt của mầm bệnh. 2.5.2.2 Căn cứ vào loại mầm bệnh, chia miễn dịch thành ba loại - Miễn dịch chống vi khuẩn: miễn dịch của cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh là vi khuẩn. Loại miễn dịch này không mạnh, không bền. Muốn tạo được miễn dịch cao thì vi khuẩn thường phải tiếp xúc với cơ thể 2 - 3 lần. - Miễn dịch chống virus: miễn dịch của cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh là virus. Loại miễn dịch này thường mạnh và dài hơn miễn dịch chống vi khuẩn. Miễn dịch chống virus thường xảy ra sớm (8 - 24 giờ sau khi virus xâm nhập vào cơ thể) và kéo dài, thậm chí suốt đời. - Miễn dịch chống độc tố: miễn dịch không trực tiếp chống mầm bệnh mà chống lại độc tố của mầm bệnh. Khi cơ thể có miễn dịch thì mầm bệnh vẫn có thể tồn tại nhưng không gây được bệnh vì độc tố do vi khuẩn tiết ra đã bị kháng thể trung hoà và phá huỷ. 2.5.2.3 Dựa vào tính đặc hiệu hay không đặc hiệu, chia miễn dịch thành hai loại - Miễn dịch không đặc hiệu: là khả năng bảo vệ tự nhiên của cơ thể chống lại các tác động có hại của bất kỳ một tác nhân gây bệnh nào. Bao gồm vai trò bảo vệ của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, các tế bào thực bào. - Miễn dịch đặc hiệu: là khả năng miễn dịch của cơ thể chỉ chống lại một loại mầm bệnh nhất định. Khả năng miễn dịch này có được là do kháng thể đặc hiệu quyết định. 2.6 Vài nét về Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương được thành lập từ năm 1956, với hình thức kinh doanh chính là sản xuất vacxin phòng bệnh và các loại thuốc dược phẩm điều trị cho gia súc, gia cầm. Sau hơn 50 năm sản xuất và nghiên cứu, cho đến nay Xí nghiệp vẫn luôn không ngừng đổi mới và góp phần vào sự phát triển của nền nông nghiệp nói chung và ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng. Xí nghiệp đã sản xuất một lượng lớn vacxin và thuốc chữa bệnh, góp phần tích cực trong công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm cho cả nước và các nước bạn Lào, Campuchia… Cùng với công cuộc đổi mới của đất nước, ngành chăn nuôi của nước nhà đang chuyển từ một ngành chăn nuôi tự túc thực phẩm, chăn nuôi là ngành sản xuất phụ, sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp, không chú ý khâu hạch toán lỗ lãi sang chăn nuôi theo hướng hàng hoá. Người chăn nuôi dù với số lượng bao nhiêu cũng đều đặt mục tiêu kinh tế lên hàng đầu trong việc sử dụng các dịch vụ chăn nuôi, trong đó có việc sử dụng thuốc và vacxin phòng bệnh. Bên cạnh việc thay đổi cơ cấu, phương thức chăn nuôi và dịch vụ thú y, Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương cũng đã có thay đổi cả về công nghệ sản xuất cũng như phương thức bán hàng cho phù hợp với cơ chế mới. Chất lượng vacxin là yếu tố quan trọng luôn được đặt lên hàng đầu. Xí nghiệp chỉ cho phép xuất xưởng các lô vacxin đã được kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn và cũng luôn phối hợp cùng với cán bộ chuyên môn ở cơ sở để xác định lịch tiêm phòng, phương pháp tiêm phòng, bảo quản sử dụng vacxin sao cho có hiệu quả nhất. Cùng với việc nghiên cứu và sản xuất các vacxin truyền thống để phục vụ công tác phòng chống dịch như vacxin tụ dấu, phó thương hàn lợn nhược độc và vô hoạt, tụ huyết trùng trâu bò, lợn, gia cầm, dịch tả vịt, dịch tả lợn, đậu gà, care, gumboro…, đồng thời cũng đã nghiên cứu và đưa ra thị trường nhiều loại vacxin mới như: vacxin xuất huyết truyền nhiễm thỏ, đậu dê, lở mồm long móng, viêm gan vịt, cúm gia cầm… Trong tương lai, mục tiêu phấn đấu của Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương vẫn là không ngừng nghiên cứu cải tiến công nghệ sản xuất để cho ra những sản phẩm vacxin cũng như thuốc dược phẩm chất lượng cao đáp ứng sự đòi hỏi của thị trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho người chăn nuôi nói riêng và nền nông nghiệp an toàn, bền vững của nước nhà nói chung. 2.7 Giới thiệu về công nghệ lên men sục khí trong sản xuất vacxin Hiện nay công nghệ lên men sục khí được áp dụng phổ biến trên thế giới trong việc sản xuất vacxin. Công nghệ lên men thực chất là áp dụng các tiến bộ khoa học như công nghệ chế tạo máy, điện tử tin học, công nghệ vi sinh vật… với mục đích cung cấp đầy đủ các điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển như vòng khuấy, oxy, nhiệt độ… Trên thực tế, công nghệ lên men có thể áp dụng được vào nuôi cấy virus và vi khuẩn. Với virus, người ta ứng dụng công nghệ lên men vào sản xuất môi trường tế bào phục vụ quá trình nuôi._.nghiệm thay thế là thỏ và chuột bạch. 4.3.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu lực đối với thỏ Theo quy định, mỗi lô vacxin nghiên cứu tiêm cho 4 thỏ khoẻ mạnh, mỗi con có trọng lượng 1,5 - 2kg, mỗi thỏ tiêm vào dưới da 0,5 ml vacxin (1/4 liều sử dụng cho trâu, bò). Sau 21 ngày, 4 thỏ thí nghiệm cùng với 2 thỏ đối chứng không tiêm vacxin, được thử thách bằng vi khuẩn cường độc tụ huyết trùng trâu bò, liều 10MLD/thỏ. Theo dõi và đánh giá số lượng thỏ sống trên số thỏ tiêm ở từng lô thí nghiệm. Kết quả được tổng hợp trong bảng 4.13. Theo tiêu chuẩn ngành TCN 162 - 92, 1994[27] quy định kiểm tra hiệu lực đối với vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò, nếu tiêm vacxin gây miễn dịch cho thỏ thì sau khi công cường độc chỉ cần 50% số thỏ sống (2/4con/lô) và 2/2 thỏ đối chứng chết. Từ số liệu trong bảng 4.13 cho thấy tất cả các lô vacxin kiểm tra hiệu lực đối với thỏ đều đạt tiêu chuẩn, 100% thỏ được miễn dịch đều sống khoẻ mạnh bình thường, trong khi 100% thỏ đối chứng chết trong vòng 25 - 35 giờ sau khi công cường độc. Bảng 4.13: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) Tỷ lệ sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) TB 1 4 0,5 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 26 TB 2 4 0,5 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 31 TB 3 4 0,5 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 29 TB 4 4 0,5 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 25 TB 5 4 0,5 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 35 4.3.3.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực đối với chuột bạch Đồng thời với việc kiểm tra hiệu lực của các lô vacxin đối với thỏ, tiến hành kiểm tra hiệu lực đối với chuột bạch. Mỗi lô vacxin tiêm cho 10 chuột bạch khoẻ mạnh, mỗi con trọng lượng 18 - 20g. Mỗi chuột được tiêm vào dưới da 0,25 ml vacxin. 21 ngày sau khi gây miễn dịch, 10 chuột bạch thí nghiệm, cùng với 5 chuột đối chứng không tiêm vacxin, được thử thách bằng vi khuẩn cường độc tụ huyết trùng trâu bò, liều 1MLD/chuột. Theo dõi và đánh giá số lượng chuột sống, chết ở từng lô thí nghiệm. Kết quả được tổng hợp trong bảng 4.14. Theo tiêu chuẩn ngành TCN 162 - 92, 1994[27] quy định, kiểm tra hiệu lực đối với vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò, nếu tiêm vacxin gây miễn dịch cho chuột bạch thì sau khi công cường độc chỉ cần 50% số chuột thí nghiệm sống (5/10con/lô) và 5/5 chuột đối chứng chết. Từ số liệu trong bảng 4.14 cho thấy tất cả các lô vacxin kiểm tra hiệu lực đối với chuột bạch đều đạt tiêu chuẩn, 100% chuột bạch thí nghiệm đều sống bình thường, trong khi 100% chuột bạch đối chứng chết trong vòng 24 - 30 giờ sau khi công cường độc. Bảng 4.14: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với chuột bạch Lô vacxin Lô chuột bạch thí nghiệm Lô chuột bạch đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) Tỷ lệ sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) Tỷ lệ chết (%) Thời gian chết (giờ) TB 1 10 0,25 1MLD dưới da 10/10 100 5 1MLD dưới da 0/5 100 29 TB 2 10 0,25 1MLD dưới da 10/10 100 5 1MLD dưới da 0/5 100 30 TB 3 10 0,25 1MLD dưới da 10/10 100 5 1MLD dưới da 0/5 100 26 TB 4 10 0,25 1MLD dưới da 10/10 100 5 1MLD dưới da 0/5 100 28 TB 5 10 0,25 1MLD dưới da 10/10 100 5 1MLD dưới da 0/5 100 24 4.4. Kết quả kiểm tra độ dài miễn dịch của vacxin vô hoạt THT trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí Độ dài miễn dịch của vacxin chính là khả năng duy trì sự tồn tại trạng thái miễn dịch trong cơ thể động vật thí nghiệm, được gây ra do tiêm vacxin tụ huyết trùng trâu bò vô hoạt sản xuất bằng công nghệ len men sục khí. Khả năng miễn dịch của động vật thí nghiệm với bệnh Tụ huyết trùng trâu bò càng dài bao nhiêu thì càng chứng tỏ được sự bảo hộ của vacxin đối với động vật bấy nhiêu. Phương pháp kiểm tra độ dài miễn dịch của vacxin Tụ huyết trùng trâu bò cũng được áp dụng theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 162 - 92. Động vật thí nghiệm dùng trong phương pháp này vẫn sử dụng thỏ. Mỗi lô vacxin tiêm cho 12 thỏ khoẻ mạnh, mỗi con trọng lượng 1,5 - 2kg, mỗi con được tiêm vào dưới da 0,5 ml vacxin. Kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin đối với thỏ ở các mốc thời gian 3, 6 và 9 tháng sau khi tiêm vacxin.Cụ thể tiến hành như sau: Sau 3 tháng từ khi thỏ được gây miễn dịch bằng vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu bò, ở mỗi lô vacxin lấy 4 thỏ được gây miễn dịch cùng với 2 thỏ đối chứng không được tiêm vacxin, đem thử thách bằng vi khuẩn cường độc P.multocida. Mỗi thỏ được tiêm 10MLD vào dưới da. Sau khi tiêm, theo dõi liên tục 10 ngày. 8 thỏ còn lại của mỗi lô vẫn tiếp tục được nuôi dưỡng trong điều kiện của phòng thí nghiệm. Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 4.15 và hình 4.1. Sau 6 tháng tính từ khi thỏ được gây miễn dịch bằng vacxin, mỗi lô vacxin lại lấy 4 thỏ được gây miễn dịch cùng với 2 thỏ đối chứng không được tiêm vacxin, tiếp tục thử thách với vi khuẩn cường độc P.multocida. Liều lượng tiêm không đổi (10MLD). 4 thỏ chưa tiêm còn lại vẫn tiếp tục nuôi dưỡng. Kết quả theo dõi sau 10 ngày được thể hiện trong bảng 4.16 và hình 4.1. Sau 9 tháng, phương pháp tiến hành giống như lúc 3 và 6 tháng đối với 4 thỏ được gây miễn dịch còn lại. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 4.17 và hình 4.1. Bảng 4.15: Kết quả kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 3 tháng Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Thời gian miễn dịch sau tiêm Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ chết (%) TB 1 4 0,5 90 ngày 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 2 4 0,5 90 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 3 4 0,5 90 ngày 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 4 4 0,5 90 ngày 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 5 4 0,5 90 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 Bảng 4.16: Kết quả kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 6 tháng Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Thời gian miễn dịch sau tiêm Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ chết (%) TB 1 4 0,5 180 ngày 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 2 4 0,5 180 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 3 4 0,5 180 ngày 10MLD dưới da 4/4 100 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 4 4 0,5 180 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 5 4 0,5 180 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 Bảng 4.17: Kết quả kiểm tra khả năng bảo hộ của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 9 tháng Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Thời gian miễn dịch sau tiêm Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) Tỷ lệ chết (%) TB 1 4 0,5 270 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 2 4 0,5 270 ngày 10MLD dưới da 2/4 50 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 3 4 0,5 270 ngày 10MLD dưới da 3/4 75 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 4 4 0,5 270 ngày 10MLD dưới da 2/4 50 2 10MLD dưới da 0/2 100 TB 5 4 0,5 270 ngày 10MLD dưới da 2/4 50 2 10MLD dưới da 0/2 100 Từ kết quả kiểm tra độ dài miễn dịch của vacxin đối với thỏ, chúng tôi có nhận xét như sau: Sau khi gây miễn dịch cho thỏ được 3 tháng, số liệu thể hiện trong bảng 4.15 cho thấy, kết quả kiểm tra hiệu lực của 5 lô vacxin so với kết quả kiểm tra hiệu lực tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm vacxin đã có sự thay đổi. Hai lô vacxin tụ huyết trùng trâu bò số 2 và số 5 có tỷ lệ bảo hộ 75%, trong khi tại thời điểm kiểm tra hiệu lực sau 21 ngày tiêm vacxin, tỷ lệ bảo hộ 100%. 3 lô vacxin còn lại (lô 1, 3 và 4) vẫn giữ nguyên tỷ lệ bảo hộ 100% đối với thỏ. Ở thời điểm 6 tháng từ khi gây miễn cho thỏ, chỉ còn lại 2 lô vacxin số 1 và 3 đạt tỷ lệ bảo hộ 100% và xuất hiện thêm lô vacxin tụ huyết trùng trâu bò số 4, tỷ lệ bảo hộ giảm xuống còn 75% đối với thỏ. Kết quả này được thể hiện trong bảng 4.16. Thời điểm 9 tháng là mốc thời gian kiểm tra độ dài miễn dịch cuối cùng đối với thỏ trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này. Bảng 4.17 cho thấy khả năng bảo hộ của vacxin đối với thỏ đã giảm đi đáng kể. Ở thời điểm 9 tháng, không còn lô vacxin nào có tỷ lệ bảo hộ 100% đối với thỏ. Hai lô 1 và 3 ở thời điểm 6 tháng, tỷ lệ bảo hộ 100%, giảm xuống còn 75% ở thời điểm này. Đặc biệt các lô vacxin 2, 4 và 5 tỷ lệ bảo hộ đối với thỏ giảm từ 75% ở thời điểm kiểm tra 6 tháng, xuống còn 50% ở thời điểm 9 tháng. Tuy vậy, tỷ lệ bảo hộ này theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 162 - 92[27] thì vẫn nằm ở giới hạn cho phép. Kết quả kiểm tra độ dài miễn dịch của 5 lô vacxin Tụ huyết trùng trâu bò còn được minh hoạ bởi 5 đường biểu diễn ở hình 4.1: TB4 TB2,TB5 TB1,TB3 Tháng KT 100 100 100 75 75 50 75 50 TB2,TB5 TB1,TB3 75 100 100 100 80 TL bảo hộ 120 100 60 40 20 9T 6T 3T 0 21 ngày 0 ngày TB2, TB5 TB4 Hình 4.1. Đường biểu diễn độ dài miễn dịch của các lô vacxin Như vậy, qua hình 4.1 có thể quan sát rõ hơn sự ổn định hay giảm xuống về tỷ lệ bảo hộ của mỗi lô vacxin đối với động vật thí nghiệm ở từng thời điểm kiểm tra độ dài miễn dịch. 4.5 Kết quả định kỳ kiểm tra độ dài bảo quản của vacxin vô hoạt THT trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1979) [17] thì một tỷ lệ nhất định gia súc khoẻ mạnh có vi khuẩn Tụ huyết trùng tồn tại ở đường hô hấp trên. Nó chỉ nhân lên và gây thành bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm xuống. Mặt khác, sức đề kháng của gia súc phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng, thời tiết, khí hậu, mùa vụ, vùng địa lý… Bùi Quý Huy (1993) [10] đã khái quát tình hình bệnh Tụ huyết trùng trâu bò ở Việt Nam là bệnh thường xảy ra rải rác thành dịch địa phương ở một số tỉnh Nam Bộ vào mùa mưa hàng năm. Ở miền Trung, bệnh phát ra sau các đợt lũ, lụt. Ở miền Bắc, trước đây bệnh gây thành dịch địa phương, giết hại trâu bò ở một số tỉnh miền núi. Bệnh diễn ra ở thể cấp tính gây tỷ lệ tử vong khá cao. Hiện nay, do công tác phòng chống dịch bệnh đối với bệnh Tụ huyết trùng trâu bò được quan tâm tốt hơn, vì thế bệnh đã được khống chế đáng kể. Tuy vậy, bệnh Tụ huyết trùng vẫn còn tồn tại và xảy ra lẻ tẻ ở các địa phương thuộc nhiều vùng, miền trong cả nước. Chính vì bệnh Tụ huyết trùng trâu bò là bệnh thường tiến triển ở thể cấp tính. Mặt khác, bệnh thường xảy ra vào mùa mưa hoặc thời tiết thay đổi đột ngột. Vì thế, việc sản xuất dự trữ đủ một lượng vacxin nhằm đáp ứng nhu cầu của thực tiễn chăn nuôi là rất cần thiết. Trong quá trình dự trữ, điều kiện bảo quản tốt để không làm giảm chất lượng vacxin là không thể thiếu. Vấn đề đặt ra ở đây là vacxin sau khi sản xuất, bảo quản ở 2 - 80C, kéo dài được bao lâu mà chất lượng của nó không bị ảnh hưởng. Do đó, thông tin về thời hạn bảo quản của vacxin là rất cần thiết đối với đơn vị sản xuất cũng như người tiêu dùng. Trong quá trình nghiên cứu đề tài, từng lô vacxin trong quá trình bảo quản được chúng tôi định kỳ lấy mẫu ở các thời điểm 1, 3, 6, 9 và 12 tháng, tính từ thời điểm kết thúc quá trình sản xuất vacxin, để tiến hành kiểm tra hiệu lực. Theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 162 - 92 năm 1994[27], việc kiểm tra hiệu lực của vacxin trong quá trình bảo quản được tiêm miễn dịch cho thỏ. Mỗi lô vacxin tụ huyết trùng trâu bò tiêm cho 4 thỏ, mỗi thỏ được tiêm vào dưới da 0,5 ml vacxin. 21 ngày sau khi tiêm vacxin, 4 thỏ được gây miễn dịch cùng với 2 thỏ đối chứng không tiêm vacxin được thử thách bằng vi khuẩn cường độc P.multocida. Liều công cường độc đối với thỏ là 10MLD/con. Theo dõi liên tục trong 10 ngày, ghi lại số thỏ sống, chết ở cả lô miễn dịch và đối chứng. 4.5.1 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 1 tháng bảo quản Từ kết quả trong bảng 4.18 cho thấy, sau bảo quản 1 tháng trong điều kiện 2 - 80C, vacxin được đem kiểm tra hiệu lực thì tất cả các lô vacxin chưa có sự thay đổi gì về chất lượng. Bảng 4.18: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 1 tháng bảo quản Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL chết (%) TB 1 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 2 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 3 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 4 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 5 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 4.5.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 3 tháng bảo quản Bảng 4.19: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 3 tháng bảo quản Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL chết (%) TB 1 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 2 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 3 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 4 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 5 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 Sau 3 tháng bảo quản ở 2 - 80C, các lô vacxin tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí chưa thấy có dấu hiệu giảm hiệu lực. Kết quả trong 5 lô vacxin theo dõi, tỷ lệ bảo hộ đối với thỏ vẫn đạt 100%. 4.5.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 6 tháng bảo quản Ở mốc thời điểm bảo quản sau 6 tháng, đem kiểm tra hiệu lực, kết quả trong bảng 4.20 dễ dàng nhận thấy, sự ổn định về chất lượng vacxin tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí, 100% số thỏ được bảo hộ khi công cường độc. Bảng 4.20: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin THT trâu bò đối với thỏ sau 6 tháng bảo quản Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL chết (%) TB 1 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 2 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 3 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 4 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 5 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 4.5.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 9 tháng bảo quản Kết quả được thể hiện trong bảng 4.21 cho thấy, đã bắt đầu có dấu hiệu về sự thay đổi tỷ lệ bảo hộ của 5 lô vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò tại thời điểm 9 tháng sau khi bảo quản. 2 lô TB2 và TB5, tỷ lệ bảo hộ đối với thỏ giảm xuống còn 75%, 3 lô còn lại (TB1, TB3 và TB4) còn lại vẫn giữ nguyên chất lượng. Bảng 4.21: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 9 tháng bảo quản Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL chết (%) TB 1 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 2 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 3 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 4 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 5 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 4.5.5 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạt THT trâu bò đối với thỏ sau 12 tháng bảo quản Bảng 4.22: Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin vô hoạtTHT trâu bò đối với thỏ sau 12 tháng bảo quản Lô vacxin Lô thỏ thí nghiệm Lô thỏ đối chứng Số tiêm (con) Liều vacxin (ml/con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/ tiêm (con) TL sống (%) Số tiêm (con) Liều công CĐ/con Vị trí tiêm Sống/tiêm (con) TL chết (%) TB 1 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 2 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 3 4 0,5 10MLD d.da 4/4 100 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 4 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 TB 5 4 0,5 10MLD d.da 3/4 75 2 10MLD d.da 0/2 100 Thời điểm 12 tháng là thời điểm cuối cùng chúng tôi lấy mốc kiểm tra độ dài bảo quản của vacxin trong đề tài nghiên cứu này. Kết quả trong bảng 4.22 cho thấy, chỉ có lô vacxin tụ huyết trùng trâu bò số 3 còn giữ nguyên tỷ lệ bảo hộ đối với thỏ so với ban đầu. Các lô còn lại hiệu lực bảo hộ đối với thỏ giảm xuống còn 75%. Tuy vậy, theo quy định của Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 162 - 92 [27], sau khi thử thách cường độc, 50% số động vật được miễn dịch sống sót và đối chứng chết 100%, thì lô vacxin đó vẫn đạt tiêu chuẩn hiệu lực. Chính vì vậy, những kết quả kiểm tra hiệu lực ở các thời điểm đều đạt ở mức cho phép trở lên. Kết quả kiểm tra tỷ lệ bảo hộ của các lô vacxin Tụ huyết trùng trâu bò trong quá trình bảo quản còn được minh hoạ qua hình 4.2. 75 TB1,TB4 TB2,TB5 TB3 100 75 TB2,TB5 TB2,TB5 TB1,TB4 100 100 100 100 100 120 80 60 40 20 0 1T 3T 6T 12T 9T TL bảo hộ Tháng KT 0 TB3 Hình 4.2. Đường biểu diễn độ dài bảo quản của các lô vacxin Trong hình 4.2 chúng tôi nhận thấy rằng: trong số 5 lô vacxin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí nghiên cứu, chỉ có duy nhất lô vacxin TB3, sau thời hạn bảo quản 12 tháng kiểm tra thì tỷ lệ bảo hộ bảo hộ đối với thỏ vẫn duy trì ở 100%. 2 lô vacxin TB1 và TB4, tỷ lệ bảo hộ 100% kéo dài đến tháng thứ 9 rồi giảm xuống 75% ở tháng thứ 12 khi kiểm tra hiệu lực. 2 lô vacxin còn lại (TB2 và TB5), tỷ lệ bảo hộ 100% chỉ đến tháng thứ 6 và giảm xuống 75% ở tháng thứ 9, giữ nguyên ở mức này cho đến tháng thứ 12. Với kết quả thu được trong quá trình xác định hiệu lực của vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò đối với thỏ, đã khẳng định sau bảo quản 12 tháng ở điều kiện 2 - 80C, vacxin vẫn duy trì được khả năng bảo hộ. Kết quả này giúp cho Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương có thể chủ động hơn trong kế hoạch sản xuất, cung ứng vacxin và cũng giúp cho người sử dụng có thể xây dựng một chương trình tiêm phòng chủ động có hiệu quả, đặc biệt đối với miền núi và các vùng xa. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Căn cứ vào các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu luận văn, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau đây: 1. Giống vi khuẩn Tụ huyết trùng trâu bò dùng để sản xuất vacxin hoàn toàn đảm bảo các chỉ tiêu quy định bắt buộc: - Thuần khiết sau khi nuôi cấy trong các môi trường tăng sinh, nhân giống lần 1, nhân giống lần 2. - Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh trùng đều đạt và vượt quy định. Môi trường tăng sinh: trung bình 1,48 tỷ vk/1ml Nhân giống lần 1: trung bình 10,66 tỷ vk/1ml Nhân giống lần 2: trung bình 19,46 tỷ vk/1ml - Canh trùng sau khi xử lý bằng formol 36% với tỷ lệ 0,2% và hấp phụ keo phèn đều hoàn toàn vô trùng. 2. Kết quả kiểm nghiệm vacxin Các lô vacxin đều đạt 3 chỉ tiêu bắt buộc kiểm tra theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 162 - 92: - Vô trùng trên các môi trường nuôi cấy cơ bản, gồm có: thạch máu, thạch thường, nước thịt ống, nước thịt gan yếm khí, lọ nước thịt dinh dưỡng 50ml và thạch nấm. - An toàn đối với thỏ và chuột bạch - Hiệu lực: tỷ lệ bảo hộ 100% đối với thỏ và chuột bạch 3. Độ đài miễn dịch của vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí là 9 tháng. 4. Độ dài bảo quản của vacxin vô hoạt tụ huyết trùng trâu bò sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí trong điều kiện nhiệt độ từ 2 - 80C đạt ít nhất 12 tháng. 5.2 Đề nghị Tiếp tục xác định độ dài bảo quản của vacxin trong điều kiện nhiệt độ 2 - 80C. Tiếp tục nghiên cứu và bổ sung cho quy trình sản xuất để có được độ dài miễn dịch tốt hơn, kéo dài khả năng miễn dịch cho động vật. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Sa Đình Chiến (2001). Nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La, một số đặc tính của P.multocida phân lập được, biện pháp phòng trị. Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Hà Nội. Phạm Văn Chức (1994). Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Báo cáo khoa học của công ty thuốc thú y TW. Đỗ Tuấn Cương, Tô Long Thành. Đặng Vũ Hoàng, Trương Văn Dung (2004). Thiết lập phương pháp miễn dịch bệnh lý trong chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. Khoa học kỹ thuật thú y, tập 11(1), tr. 46 - 52. Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958). Bệnh truyền nhiễm gia súc (những bệnh thường có ở Việt Nam), NXB Nông thôn, Hà Nội. Đỗ Văn Được (1998). Vài nét về tình hình dịch bệnh ở đàn trâu bò Lạng Sơn trong những năm 1991 - 1996. Khoa học kỹ thuật thú y, tập V (4), tr. 92 - 93. Phùng Duy Hồng Hà (1990). Nghiên cứu sản xuất vacxin Tụ huyết trùng gia cầm dạng nhũ dầu. Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp, 4, tr.168-172. Trương Nam Hải (2005). Sản xuất vacxin phòng bệnh do Salmonella enteritidis và S.typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. Báo cáo tổng kết đề tài KC04.06, Hà Nội 2005. Cao Văn Hồng (2002). Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò, lợn tại Đăk Lăk và một số biện pháp phòng trị. Luận án tiến sỹ nông nghiệp. Nguyễn Tuấn Hùng. ”Nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất vacxin phó thương hàn lợn bằng công nghệ lên men sục khí”. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp năm 2006. Bùi Quý Huy (1993). Tình hình dịch tễ và công tác phòng chống dịch bệnh gia súc hiện nay. Khoa học kỹ thuật thú y, Hội thú y 1(1), tr. 56 - 58. Bùi Quý Huy (1998). Một số đặc điểm bệnh Tụ huyết trùng trâu bò ở Việt Nam trong những năm qua. Khoa học kỹ thuật thú y, tập 5(1), tr.94-95. Phan Địch Lân (1998). Kết quả hoạt động khoa học công nghệ của Viện Thú y giai đoạn 1991 - 1996 và phương hướng nghiên cứu đến năm 2000. Khoa học kỹ thuật thú y, 5(4), tr. 6 - 9. Dương Thế Long (1994). Ảnh hưởng của thời tiết khí hậu tời tình hình dịch Tụ huyết trùng trâu bò tại Sơn La. Khoa học kỹ thuật thú y, tập 1(5), tr. 59 - 63. Nguyễn Ngã, Lê Minh Tâm, Nguyễn Bá Cường (1987). Nghiên cứu sản xuất vacxin Tụ huyết trùng trâu bò chủng Iran. Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, tập 1. Đỗ Trung Phấn (1979). Miễn dịch trung gian tế bào. Nhà xuất bản y học Hà Nội. Hoàng Đạo Phấn (1986). Về đặc tính của P.multocida và type huyết thanh của chúng. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tr.1-7. Nguyễn Vĩnh Phước: “Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò - Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc”. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 1979. Nguyễn Vĩnh Phước và cộng sự (1988). Phân lập và giám định serotype vi khuẩn Tụ huyết trùng trâu bò tại các tỉnh phía Nam. Kết quả hoạt động khoa học kỹ thuật thú y 1975 - 1985. Nhà xuất bản Nông nghiệp. Phan Thanh Phượng (1985). Các loại bổ trợ vacxin trong nghiên cứu ứng dụng. Tạp chí NN và CNTP, số 9, tr.430 - 432. Phan Thanh Phượng (1986). Bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm. NXB Nông nghiệp. Phan Thanh Phượng (1989). Cơ sở miễn dịch và dịch tễ điều khiển phòng chống đặc hiệu bệnh Tụ huyết trùng gia súc và gia cầm ở Việt Nam. Luận án tiến sỹ khoa học, Matxcơva. Phan Thanh Phượng, Trương Văn Dung (1990). Vacxin nhũ hoá Tụ huyết trùng trâu bò trong sản xuất công nghệ. Báo cáo tổng kết công trình 02B giai đoạn 1986 - 1990. Lê Văn Tạo: “Vacxin và sử dụng vacxin phòng bệnh động vật”. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XIII, số 5 - 2006. Phạm Quang Thái, Trần Xuân Hạnh, Tô Thị Phấn, Nguyễn Thiên Thu, Phạm Hào Quang, Đỗ Văn Dũng: “An toàn và hiệu lực vacxin Tụ huyết trùng trâu bò nhũ hoá chủng P52”. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y. Tập XIV, số 2 - 2007. Nguyễn Bá Thành (2006). Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Gumboro, virus gây bệnh và đề xuất quy trình tiêm chủng vacxin phù hợp để phòng bệnh cho đàn gà tại Đồng Nai. Luận án tiến sỹ nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. Tô Long Thành: “Tổng quan về vacxin”. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y. Tập XVI - Số 1 - 2009. Quy trình Tiêu chuẩn ngành 10TCN 162 - 92 (1994). Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp và CNTP. II. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Aalbeak B., Eriksen L., Rimler R.B., Leifsson P.S., Basse A., Christiansen T., Eriksen E. (1999). Typing of P.multocida from haemorrhagic septicaemia in Danish fallow deer (Dama dama). APMIS. 107(10), pp. 913 - 932. Bain R.V.S, De Alwis M.C.L., Carter G.R., Gupta B.K. (1982). Haemorrhagic septicaemia. Animal production and health. No 33, FAO, Rome. Bain R.V.S. (1963). Haemorrhagic septicaemia. FAO Agricultural studies No 62, FAO, Rome. Carrigan M.J., Dawkins J.J., Cockram F.A., Hansen A.T. (1991). P.multocida septicaemia in fallow deer (Dama dama). Aust. Vet. J. (6), pp. 201 - 206. Carter G.R. (1982). Whatever happened to haemorrhagic septicaemia. Journal of the American Veterinary Medical Association, 180, pp. 1176 - 1177. Darrmadi P. (1991). Country report-Indonesia. In: Proceeding of the fourth international Workshop on Haemorrhagic septicaemia, 11 - 17 February 1991, Kandy, Sri Lanka. De Alwis, Wijewardana T.G., Gomis A.I., Vipulasiri A.A. (1990). Persistence of the carrier status haemorrhagic septicaemia (serotype 6:B infection) in buffaloes. Trop. Anim. Health. Prod. 22(3), pp. 185 - 202. De Alwis M.C.L. (1992). Pasteurellosis in production animals. A review. An International workshop sponsored by ACIAR held at Bali, Indonesia 10 - 13 August 1992. Diallo I.S., Frost A.J. (2000). Characteristics of haemolytic extract from avian P.multocida. Veterinary Microbioly 71, pp. 37 - 45. Elfaki M.G., Abbas B., Mahmoud O.M., Abdel-Magied E.M. (2002). Septicaemia pasteurellosis in camelus in central Saudi Arabia. Vet. J. 163(2), pp. 218 - 231. Gupta K.B. (1980). Symptomes on diseases of livestocks 13, pp.45-53. Trần Xuân Hạnh (2002). Septicaemic pasteurelosis in pigs: Some features of distribution and pathology of Pasteurella multocida serotype B:2 in pigs in Vietnam. PhD thesis. School of Veterinary Science, The University of Queensland. Heddleston K.L., Reber P.A. (1972). Fowl cholera: Cross - immunity induced in turkeys with formalin - killed in vivo propagated P.multocia. Avian Dis. 16, pp. 578 - 586. Kumar A.A., Harbola P.C., Rimler R.B., Kumar P.N. (1996). Studies on P.multocida isolates of animal and avian origin from India. Ind. J. Comp. Microbiol. Immunol. Infect. Dis. 17, pp. 120 - 124. Martrenchar A., Njanpop B.M. (1994). First case of an outbreak of haemorrhagic septicaemia caused by P.multocida serotype B:6 in Northern Cameroon. Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop. 47(1), pp. 19 - 20. Michael L.P., Barbara J.M., Vivek K. (2002). Transcriptional response of P.multocida to nutrient limitation. Journal of bacteriology 184 (13), pp.3734-3739. Mochabo K.O., Kitala P.M., Gathura P.B., Ogara W.O., Catley A., Eragae E.M., Kaitho T.D. (2005). Community perceptions of important camel diseases in Lapur division of Turkana district, Kenya. Trop. Anim. Health. Prod. 37(3), pp. 187 - 204. Muniandy N., Edgar J., Woolcock J.B., Mukhur T.K.S (1992). Virulence, Purification, Structure and Protective potential of the putative capsular polysaccharide of P.multocida ty 6:B Pasteurellosis in production animals. ACIAR Proceeding No 43, pp. 47 - 54. Namioka S, Murata M, (1961). Serological studies on Pasteurella multocida II. Characteristics of somatic “O” antigen of organism. Cornell Veterinarian 51, pp. 507 - 521. OIE, 2004. Manual of diagnostic tests and vacxins for terrestrial animals. Rahim N.A.A. (1991). Country report - Malaysia. In: Proceeding of the fourth international Workshop on Haemorrhagic septicaemia, 11 - 17 February 1991, Kandy, Sri Lanka. Rimler R.B., Rhoades K.R. (1989). Pasteurella and Pasteurelosis. Academic rpress Limited, London, pp. 37 - 73. Rimler R.B (1992). Pasteurella: Laboratory techniques for typing and diagnosis of infection. ACIAR oroceedings N0 43, 1992, pp. 199 - 202. Rimler R.B. (1994). Presumptive identification of P.multocida serogroup A, D and F by capsule depolymerisation with mucopoly saccharidases. National Animal Diseases center PO. Box, Ames, IA 50010, USA. Rosenbusch C.T., Merchant I.A. (1939). A study of the Haemorrhagic septicaemia Pasteurella. Journal of Bacteriology 37, pp. 68 - 74. Ryu H.I., Kim C.J. (2000). Immunologic reactivity of a lipopolysaccharide-protein complex pf type A P.multocida in mice. Jour of Vet. Sci. (2), pp. 87 - 95. Sheikh M.A., Anzam M., Shakoori A.R. (1996). Observations on haemorrhagic septicaemia in Pakistan livestocks. Zentralbl. Veterinarmed. 43(5), pp. 293 - 304. Shigidi M.T.A., Mustafa A.A. (1979). Biochemical and serological studies on P.multocida isolated from cattle in Sudan. Cornell Veterinarian 69, pp. 77 - 84. Shivachandra S.B., Kumar A.A., Gautam R., Singh V.P., Saxena M.K., Srivastava S.K. (2006). Identification of avian strains of P.multocida in India by conventional and PCR assays. Vet. Journal. 172 (3), pp.561-565. Souriya M. (1991). Country report - Laos. In: Proceeding of the fourth international Workshop on Haemorrhagic septicaemia, 11 - 17 February 1991, Kandy, Sri Lanka. Voigts A., Nagaisiue G., Henton M.N. (1997). Haemorrhagic septicaemia due to P.multocida type B:2 in Namibia. Trop. Anim. Health. Prod. 29(4), pp. 247 - 255. Wijewadana T.G., Gunawardana G.A., De Alwis M.C.L., Talagoda S.A. (1994). Serotyping and biochemical characteristics of P.multocida isolated from outbreaks of fowl cholera in chiken in Srilanka. Sri-lanka Vet. Journal 41., pp.1-6. PHỤ LỤC ẢNH Một số ảnh minh hoạ Ảnh 4: Bộc lộ bệnh tích phủ tạng thỏ đối chứng ._.