Khóa luận Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy chủng lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

hầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cô thầy là người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hoàn thành tốt đề tài. Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm nền tảng để em có thể hoàn thành đề tài. Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài. Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình. Chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày tháng năm 2014 TRẦN THỊ KIỀU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ........................................................ 5 1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................. 5 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic ........................................... 7 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum................................................... 8 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS ................................................................................................... 10 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 10 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 11 1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM .................................................................. 12 1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ................................................. 12 1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc .............................................................................. 14 1.3.3. Thí nghiệm tối ưu hóa ........................................................................... 16 1.4. PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0............... 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 23 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU .................................................. 24 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................ 24 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 24 2.2.2. Môi trường – hóa chất .......................................................................... 24 2.2.3. Dụng cụ ................................................................................................. 24 2.2.4. Trang thiết bị ........................................................................................ 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 25 2.3.1. Hoạt hóa chủng ..................................................................................... 25 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 ............. 26 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.4. Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5 ............................................................................................................... 27 2.3.5. Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ............................................................ 28 2.3.6. Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman ................................................................ 30 2.3.7. Thí nghiệm khởi đầu ............................................................................. 32 2.3.8. Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp leo dốc .............................................................................................................. 32 2.3.9. Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính. ............................................................................................................. 33 2.3.10. Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5 trên môi trường tối ưu...................................................................................................... 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 ..................................................................... 35 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT 1.5 ............................................................................................... 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5. ............................................................... 38 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG ....................................... 39 3.4.1. Nguồn nitơ ............................................................................................. 39 3.4.2. Nguồn cacbon ........................................................................................ 41 3.4.3. Nguồn khoáng ....................................................................................... 42 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN ............................................. 44 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU .................................... 48 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC .......................................................... 50 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN ............................................... 52 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU .............................................................................. 57 4.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 61 4.2 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 63 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 68 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iii TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs. Cộng sự L. plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iv TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Streptococcus ...................................................................................... 6 Hình 1.2 Lactobacillus ........................................................................................ 6 Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) ............................................................................................................................. 9 Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. ......................... 13 Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và Behnken, 1960) ................................................................................................. 20 Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 ................................................ 22 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU v TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát .................................................................. 28 Bảng 2.2. Các nguồn cacbon khảo sát ............................................................. 29 Bảng 2.3. Các nguồn khoáng khảo sát ............................................................ 30 Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) .............................. 35 Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian ............................................................. 36 Bảng 3.3. Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát ................................................................... 38 Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát ............................ 40 Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát ....................... 41 Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát ............. 43 Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố ..................................................... 44 Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman ........................................... 45 Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính ........................................................................................................................... 50 Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc ............................................................. 51 Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53 Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken ......................... 53 Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố .............................................. 56 Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian ................................................................ 57 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ .......................................................... 40 Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon .................................................... 42 Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng ........................................... 43 Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) ........................... 47 Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau .................................................................................... 55 Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau .......................................................................................... 56 Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường tối ưu ..................................................................................... 58 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ (WHO, 2013). Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim và cs., 2004). Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu. Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus) có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno, 2007). Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này có tác dụng kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Shahravy, 2012). Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng muối mật, kháng khuẩn, (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm cholesterol. Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật đang được quan tâm. Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn (Shahravy, 2012). Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”. Nội dung thực hiện:  Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào tương ứng với từng giá trị OD.  Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn.  Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5  Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khoáng.  Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B).  Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp Box-Behnken.  Nuôi cấy thử nghiệm. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1. Giới thiệu Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người (David, 2013). Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin, bình thường chúng không có cytochrome. Vì vậy, chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005). Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus. a b Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử b: Streptococcus nhuộm Gram b a Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus dưới KHV điện tử b:Lactobacillus nhuộm Gram SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 6 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường. 1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005). LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):  Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình.  Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của quá trình lên men này ngoài acid lactic còn có ethanol, acetate và CO2 hay còn gọi là quá trình lên men dị hình. Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và LAB dị hình. 1.1.2.1 Lên men đồng hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hoàn toàn đường chúng sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas) tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thông qua các quá trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong quá trình này là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose không phải là đường duy nhất có thể được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose- 6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài. Đại diện cho SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 7 TỔNG QUAN TÀI LIỆU kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989) 1.1.2.2 Lên men dị hình Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hóa một phân tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C. Quá trình này xảy ra trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus, Weissella và Lactobacillus nhóm III. (Desantis và cs., 1989) 1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum 1.1.3.1. Phân loại Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại: Giới (Kingdom): bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Lactobacillales Họ (Family): Lactobacillaceae Giống (Genus): Lactobacillus Loài: L. Plantarum 1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus. Lactobacillus plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực không SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Vi khuẩn này lần đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009) Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị hình, có thể sống trong nhiều môi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012). L. plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những điểm sau: - Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem và cs., 2003) - Có thể lên men nhiều loại đường. -Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995). - Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs., 2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004). Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) 1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con người. Nó thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được công nhận trên thị trường. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 9 TỔNG QUAN TÀI LIỆU L. plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009). Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh (Lonnermark và cs., 2009). Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở ruột kết. Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn lớp phân tử (Qin và cs., 2009). 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn thế giới, trong đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít công trình nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus. Phần lớn các nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm probiotic. 1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá thành thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn. Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus PEN. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 10 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa môi trường thu acid lactic cho chủng Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như: bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid lactic/ g tinh bột được sử dụng). Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii. Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton, cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ nuôi cấy là 35oC. Năm 2006, Zhong đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid: nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ. 1.2.2. Các nghiên cứu trong nước Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về môi trường nuôi vi khuẩn lactic tốt nhất. Môi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%. Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic. Tìm ra được ba môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bifidobacteria bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết thịt bò ở điều kiện nuôi cấy kỵ khí. Môi trường thích hợp cho L. acidophilus là môi SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 11 TỔNG QUAN TÀI LIỆU trường MRS, môi trường nước chiết cà chua, môi trường nước chiết giá, môi trường nước thải của Công ty sữa Vinamilk. 1.3. QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM Quy hoạch thực nghiệm là dạng nghiên cứu về mối quan hệ nguyên nhân – kết quả. Trước hết, nhà nghiên cứu cần xác định các thông số (hay các biến) cần và có thể quan tâm rồi đưa ra các chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng. (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011). 1.3.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm hiện đại. Đó là phương pháp nghiên cứu mới, trong đó công cụ toán học giữ vai trò tích cực. Cơ sở toán học nền tảng của lý thuyết qui hoạch thực nghiệm là toán học xác suất thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi qui (Giang Thị Kim Liên, 2009). 1.3.1.1. Khái niệm Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Giang Thị Kim Liên, 2009). 1.3.1.2. Đối tượng Là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu. Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng, nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thông tin biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng. Có thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong hệ thống điều khiển gồm các tín hiệu đầu vào và đầu ra (Giang Thị Kim Liên, 2009). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 12 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình. Các tín hiệu đầu vào được chia thành ba nhóm: (Giang Thị Kim Liên, 2009) 1) Các biến kiểm tra được và điều khiển được, mà người nghiên cứu có thể điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vectơ: Z = [Z1, Z2, ..., Zk] 2) Các biến kiểm tra được nhưng không điều khiển được, biểu diễn bằng vectơ: T = [T1, T2, ..., Th] 3) Các biến không kiểm tra được và không điều khiển được, biểu diễn bằng vectơ: E = [E1, E2, ..., Ef] Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là vectơ Y = (y1, y2,..., yq). Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu. Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu được gọi là mặt đáp ứng (bề mặt biểu diễn). Phương pháp toán học trong xử lý số liệu từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp thống kê. Vì vậy các mô hình biểu diễn hàm mục tiêu chính là các mô hình thống kê thực nghiệm. Các mô hình này nhận được khi có công tính nhiễu ngẫu nhiên. 1.3.1.3. Ưu điểm về quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm đóng vai trò quan trọng trong khoa học kỹ thuật. Các mô hình lý thuyết, giải thuật, quá trình mới luôn được kiểm nghiệm thực trước khi đem ra SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 13 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ứng dụng. Hơn nữa, quy hoạch thực nghiệm còn có ý nghĩa bổ sung, hoàn chỉnh các kết quả nghiên cứu sáng tạo lý thuyết đã được phát triển (Giang Thị Kim Liên, 2009). Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của các nhà khoa học. Những ưu điểm rõ rệt của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là: (Giang Thị Kim Liên, 2009) − Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết. − Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu. Nhận được mô hình toán học thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết. − Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động. 1.3.2. Thí nghiệm sàng lọc Thí nghiệm sàng lọc là thí nghiệm được tiến hành nhằm các mục đích sau: Xác định đâu là yếu tố ảnh hưởng chính đến đối tượng hay quá trình cần khảo sát. Đáng giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố. Đánh giá mức độ ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố. Thí nghiệm sàng lọc thường khai thác các dạng thí nghiệm toàn phần 2 mức khi số yếu tố thí nghiệm không lớn hoặc thiết kế thí nghiệm riêng phần hay thiết kế thí nghiệm Plackett – Bur...ật độ tế bào vi khuẩn và giá trị OD610, đường cong tăng trưởng trưởng , kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng của L. plantarum), chúng tôi tiến đến bước sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng L. plantarum. Các nguồn dinh dưỡng khảo sát gồm có: nguồn nitơ, nguồn cacbon, nguồn khoáng. 3.4.1. Nguồn nitơ Chúng tôi tiến hành khảo sát các nguồn nitơ: pepton, bột đậu nành, bột bắp, (NH4)2SO4, Urê với khói lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.1 (mục 2.3.5.1). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khảo sát đến sinh trưởng của L. plantarum NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.4 và đồ thị 3.4. Bảng 3.4. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát Nguồn Nitơ Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) Bột bắp 7,193 ± 0,051c 1,5.107 Pepton 8,721 ± 0,164a 5,2.108 Bột đậu nành 7,644 ± 0,164b 4,4.107 (NH4)2SO4 7,265 ± 0,021c 1,107 Urê 7,381 ± 0,012c 1.8.107 Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 10 9 8 7 6 5 4 Log (M/ mL) (M/ Log 3 2 1 0 bot bap pepton bột đậu nành (NH4)2SO4 URE Đồ thị 3.4. Kết quả khảo sát nguồn nitơ Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 chúng tôi nhận thấy rằng:  Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2). Trong các nguồn nitơ (hữu cơ và vô cơ) thì nguồn nitơ hữu cơ ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn cao hơn các nguồn nitơ vô cơ. Pepton cho mật độ vi khuẩn cao nhất (Log (N/ mL) = 8,721 ± 0,081), thấp nhất là bột bắp (Log (N/ mL) = 7,193 ± SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 0,008. Vì vậy, pepton được chọn là nguồn nitơ tốt nhất cho sản xuất sinh khối của L. plantarum NT1.5. 3.4.2. Nguồn cacbon Từ kết quả mục 3.4.1 chúng tôi tiếp tục khảo sát các nguồn cacbon. Môi trường khảo sát gồm có pepton, các nguồn khoáng của môi trường MRS và các nguồn cacbon cần khảo sat. Các nguồn cacbon cần khảo sát là: succrose, maltose, glucose, lactose, mật rỉ đường, bột bắp với khối lượng mỗi nguồn được trình bày trong bảng 2.2 (mục 2.5.3.2). Ảnh hưởng của các nguồn cacbon khảo sát đến sự sinh trưởng của L.plantarun NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.5. Bảng 3.5. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát Nguồn Cacbon Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) Succrose 8,586 ± 0,057c 3,9.108 Maltose 9,519 ± 0,007a 3,0.109 Glucose 9,155 ± 0,014b 10,5.109 Lactose 7,198 ± 0,020d 1,6.107 Mật rỉ đường 9,252 ± 0,093b 1.8.109 Bột bắp 6,912 ± 0,012e 8,2.106 Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 10,000 9,000 8,000 7,000 6,000 5,000 4,000 Log (N/ mL) (N/ Log 3,000 2,000 1,000 0 succrose maltose glucose lactose mật rỉ bột bắp đường Đồ thị 3.5. Kết quả khảo sát nguồn Cacbon Theo kết quả thí nghiệm bảng 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi thấy rằng: - Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05 (phụ lục 2). - Các nguồn cacbon đều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn L.plantarum NT1.5. Trong các nguồn cacbon thì maltose cho mật độ vi khuẩn cao nhất (Log (N/ mL) = 9,519 ± 0,000). Glucose và mật rỉ đường ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn ngang nhau (với giá trị Log (N/ mL) tương ứng là 9,155 ± 0,001 và 9,252 ± 0,026). Thấp nhất là bột bắp Log (N/ mL) = 6,912 ± 0,000. Các nguồn cacbon maltose, glucose, mật rỉ đường đều có ảnh hưởng cao đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn. Mặc dù maltose có ảnh hưởng cao hơn tuy nhiên, xét về giá thành mật rỉ đường giúp tiết kiệm chi phí sản xuất hơn maltose và glucose rất nhiều lần. Vì vậy, chúng tôi chọn mật rỉ đường là nguồn cacbon tốt nhất cho sản xuất sinh khối L. plantarum NT1.5. 3.4.3. Nguồn khoáng Từ kết quả mục 3.4.1 và 3.4.2 chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến khă năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn. Các nguồn khoáng được khảo sát là: CaCO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl, KH2PO4 với khối lượng mỗi nguồn được thể hiện trong bảng 2.3 (mục 2.3.5.3). SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Ảnh hưởng của các nguồn muối khoáng khảo sát đến sự sinh trưởng của L.plantarum NT1.5 được xác định thông qua giá trị Log (N/ mL). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.6 và biểu đồ 3.6. Bảng 3.6. Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát Nguồn khoáng Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) CaCO3 8,648 ± 0,305a 4,4.108 K2HPO4 7,665 ± 0,121b 4,6.107 MgSO4 9,348 ± 0,299a 2,0.109 CaCl2 8,659 ± 0,374a 4,6.108 NaCl 9,070 ± 0,111a 1,2.109 KH2PO4 7,163 ± 0,152b 1,3.107 Trong cùng một cột các chỉ số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. 12 10 8 6 Log(N/ mL) Log(N/ 4 2 0 CaCO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl KH2PO4 Đồ thị 3.6. Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng Theo bảng kết quả 3.5 và biểu đồ 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng:  Giữa các số liệu có sự khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy p < 0,05.  Tất cả các nguồn khoáng khảo sát đều có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng của vi khuẩn. Trong đó, ảnh hưởng của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl đến mật độ tế vi khuẩn L. plantarum NT1.5 không có sự khác biệt ý nghĩa, giá trị SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Log (N/ mL) của CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl lần lượt là 8,648 ± 0,279; 9,348 ± 0,269; 8,659 ± 0,420; 9.07 ± 0,037. KH2PO4 và K2HPO4 cho mật độ tế bào thấp hơn với giá trị Log (N/ mL) = 7,163 ± 0,070; 7,665 ± 0,044. Như vậy, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl là các nguồn khoáng tốt nhất cho sinh trưởng của L. plantarum NT1.5. 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN Từ kết quả mục khảo sát các nguồn dinh dưỡng, chúng tôi xác định được các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, NaCl có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng L. plantarum NT1.5. Để xác định được các yếu tố có ảnh hưởng chính đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng chính theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman (P-B). Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman được thiết kế với 6 yếu tố (bảng 2.1) gồm 20 thí nghiệm, lặp lại 3 lần được bố trí dựa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA (bảng 3.7). Mỗi yếu tố được xem xét ở 2 mức độ: (-1) cho mức độ thấp và (+1) cho mức độ cao. Mức giá trị của các yếu tố khảo sát và kết quả phân tích hồi quy được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.7. Mức ảnh hưởng của từng yếu tố Giá trị mức yếu tố Kí Mức ảnh Yếu tố (g/ L) Giá trị cao Giá trị thấp P hiệu hưởng (+1) (-1) A Pepton 15 5 0,8905 0,000 B Mật rỉ đường 20 10 1,1509 0,000 C NaCl 1,5 1 0,3968 0,000 D CaCl2 1,5 1 0,5219 0,000 E CaCO3 1,5 1 0,0506 0,554 F MgSO4.7H2O 0,2 0 0,7621 0,000 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman Pepton Mật rỉ NaCl CaCl2 CaCO3 MgSO4. P-B Mật độ đường 7H2O (CFU/mL) 1 -1 -1 -1 -1 1 6,344 2,2.106 1 1 -1 1 1 -1 8,702 5,0.108 -1 -1 -1 1 -1 1 5,734 5,4.105 1 -1 1 1 -1 -1 7,869 7,4.107 -1 -1 1 -1 1 -1 6,392 2,5.106 -1 -1 -1 -1 1 -1 5,943 8,8.105 -1 1 -1 1 1 1 7,055 1,1.107 -1 -1 1 1 -1 1 6,221 1,7.106 1 1 -1 -1 -1 -1 8,286 1,9.108 -1 -1 1 -1 1 -1 6,408 2,6.106 -1 1 -1 1 1 1 7,061 1,2.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,686 4,9.107 1 -1 1 -1 1 1 6,808 6,4.106 1 -1 -1 1 1 -1 7,408 2,6.107 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,952 9,0.105 -1 -1 -1 1 -1 1 5,739 5,5.105 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,943 8,8.105 1 1 1 1 -1 -1 9,157 1,4.109 -1 1 1 -1 1 1 7,055 1,1.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,664 4,6.107 1 -1 1 -1 1 1 6,808 6,4.106 1 -1 1 1 -1 -1 7,864 7,3.107 1 -1 1 -1 1 1 6,815 6,5.106 1 1 -1 -1 -1 -1 8,254 1,8.108 1 1 -1 1 1 -1 8,739 5,5.108 -1 -1 -1 1 -1 1 5,764 5,8.105 1 -1 -1 1 1 -1 7,446 2,8.107 -1 1 -1 1 -1 1 7,061 1,2.107 1 -1 1 1 1 1 7,238 1,7.107 1 1 -1 1 1 -1 8,719 5,2.108 1 -1 1 1 -1 -1 7,879 7,6.107 1 -1 -1 -1 -1 1 6,350 2,2.106 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 1 -1 -1 -1 -1 8,284 1,9.108 -1 1 1 -1 1 1 7,061 1,2.107 1 1 -1 -1 1 1 7,640 4,4.107 1 1 1 1 -1 -1 9,135 1,4.109 1 1 1 1 -1 -1 9,173 1,5.109 -1 1 -1 1 -1 1 7,055 1,1.107 1 -1 1 1 1 1 7,240 1,7.107 -1 1 1 -1 -1 -1 7,685 4,8.107 1 1 1 -1 -1 1 8,157 1,4.108 -1 -1 -1 -1 -1 -1 5,933 8,6.105 -1 1 1 1 1 -1 8,119 1,3.108 -1 1 1 1 1 -1 8,135 1,4.108 -1 -1 -1 -1 1 -1 5,943 8,8.105 -1 1 -1 1 1 1 7,093 1,2.107 -1 1 1 1 1 -1 8,120 1,3.108 1 -1 1 1 1 1 7,254 1,8.107 1 -1 -1 1 1 -1 7,425 2,7.107 1 -1 -1 -1 -1 1 6,408 2,6.106 -1 -1 1 1 -1 1 6,203 1,6.106 -1 1 -1 1 -1 1 7,119 1,3.107 1 1 1 -1 -1 1 8,093 1,2.108 -1 -1 1 -1 1 -1 6,391 2,5.106 1 1 -1 -1 1 1 7,661 4,6.107 -1 1 1 -1 1 1 7,093 1,2.107 -1 -1 1 1 -1 1 6,238 1,7.106 1 1 -1 -1 1 1 7,410 2,6.107 1 1 1 -1 -1 1 6,135 1,4.106 -1 -1 -1 -1 1 -1 6,921 8,3.106 Theo kết quả thí nghiệm (bảng 3.7), các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O có mức độ ảnh hưởng cao vì vậy các yếu tố này ảnh hưởng chính tới khả năng tăng sinh khối của L. plantarum NT 1.5. Trong đó, yếu tố mật rỉ đường có mức ảnh hưởng cao nhất (mức ảnh hưởng là 1,1905) tiếp đến là pepton (mức ảnh hưởng là 0,9305) đồng thời có p<0,05. Yếu tố MgSO4.7H2O có p<0,05 và SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ có mức ảnh hưởng (effect) âm có nghĩa là các yếu tố này làm tăng khả năng tạo sinh khối khi ở nồng độ thấp và giảm khả năng tạo sinh khối khi ở nồng độ cao. Yếu tố CaCO3 có p=0,214 (>0,05) vì vậy yếu tố này có mức ảnh hưởng rất yếu có thể loại bỏ. Đồng thời, với kết quả đánh giá mức độ ảnh hưởng của từng biến thí nghiệm ở đồ thị các ảnh hưởng chính (đồ thị 3.7), đồ thị ứng với yếu tố mật rỉ đường và pepton có độ dốc rất lớn chứng tỏ các biến này có ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT1.5. Đồ thị 3.7. Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) Dựa theo đồ thị các ảnh hưởng được chuẩn hóa (Normal Plot of the Standardized Effects) và đồ thị Pareto của các ảnh hưởng (Pareto Chart of the Standardized Effects) (phụ lục 2) cũng cho thấy các yếu tố Pepton, Mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O nằm xa đường chuẩn nên các yếu tố này có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5. Tương tự ở biểu đồ Pareto của các ảnh hưởng, các yếu tố này nằm bên phải đường giới hạn nên nó có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm. Điều này phù hợp với kết luận rút ra từ việc phân tích đồ thị các ảnh hưởng chính và đồ thị ảnh hưởng chuẩn hóa. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.8 cho thấy khả năng tạo sinh khối của chủng L. plantarum NT 1.5 dao động từ 5,734 – 9,173 N/ mL khi các yếu tố thay đổi. Dựa vào bảng 2.4 (phụ lục 2) suy ra phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố có dạng: Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 + 0,0453X5 - 0,3610X6 Trong đó, Y là hàm mục tiêu (CFU/mL), X1, X2, X3, X4, X5, X6 lần lượt là các yếu tố pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, CaCO3, MgSO4.7H2O. Theo mô hình hồi quy, các biến pepton, mật rỉ đường, NaCl, CaCl2, MgSO4.7H2O có giá trị P<0,05 nên các biến này có ý nghĩa trong phương trình hồi quy. Biến CaCO3 có giá trị P>0,05 do vậy có thể loại bỏ trong phương trình hồi quy. Suy ra phương rình hồi quy có dạng: Y = 7,2248 + 0,4652X1 + 0,5954X2 + 0,1784X3 + 0,2407X4 - 0,3610X6 Phân tích phương sai cho thấy, giá trị xác suất p ứng với ảnh hưởng chính (Main Effects) <0,01 được thể hiện ở cột p có giá trị là 0,00 do đó ảnh hưởng của các yếu tố có ý nghĩa thống kê. Nói cách khác các ảnh hưởng của các biến là đáng kể. 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU Từ kết quả thí nghiệm P-B, thí nghiệm khởi đầu được thiết kế với các yếu tố ảnh hưởng chính: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, NaCl, MgSO4.7H2O để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình hồi quy bậc nhất nhằm xác định giá trị khảo sát ở gần vùng cực trị hay chưa. Mỗi yếu tố ảnh hưởng được khảo xác ở 3 mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao (+1), và mức độ trung tâm (0). Thí nghiệm được thiết kế dạng đầy đủ với 37 thí nghiệm trong đó có 5 thí nghiệm trung tâm được bố trí theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng chương trình thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA. Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.9. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Bảng 3.9 Thiết kế thí nghiệm khởi đầu và kết quả thí nghiệm TT Pepton Mật rỉ CaCl2 NaCl MgSO4.7H2O Log Mật độ đường 1 1 -1 -1 1 -1 8,270 1,9.108 2 1 1 -1 1 1 9,110 1,3.109 3 1 -1 1 -1 1 8,366 2,3.108 4 -1 -1 1 -1 1 7,199 1,3.107 5 0 0 0 0 0 9,778 6,0.109 6 0 0 0 0 0 9,658 5,5.109 7 0 0 0 0 0 9,613 5,6.109 8 -1 1 -1 -1 1 8,254 1,8.108 9 1 -1 -1 1 1 7,655 4,5.107 10 -1 1 1 1 1 8,711 5,1.108 11 1 1 -1 -1 -1 9,847 7,0.109 12 1 1 -1 -1 1 9,173 1,5.109 13 1 -1 1 1 -1 8,964 9,2.108 14 1 1 1 -1 1 9,678 4,8.109 15 -1 -1 1 1 -1 7,997 1,0.108 16 -1 1 -1 1 -1 8,998 1,1.109 17 1 -1 1 1 1 8,156 1,4.108 18 -1 -1 -1 -1 1 6,654 4,5.106 19 -1 -1 -1 1 1 6,526 3,3.106 20 1 1 -1 1 -1 9,997 9,9.109 21 0 0 0 0 0 9,750 5,6.109 22 -1 -1 -1 1 -1 7,446 2,8.107 23 1 1 1 1 1 9,670 4,7.109 24 -1 -1 -1 -1 -1 7,486 3,1.107 25 -1 1 1 1 -1 9,509 3,2.109 26 -1 -1 1 -1 -1 7,991 9,8.107 27 -1 -1 1 1 1 7,199 1,6.107 28 -1 1 1 -1 1 8,702 5,0.108 29 1 1 1 1 -1 10,382 2,4.1010 30 1 -1 -1 -1 -1 8,453 2,8.108 31 1 1 1 -1 -1 10,456 2,9.1010 32 1 -1 -1 -1 1 7,655 4,5.107 33 -1 1 -1 1 1 8,270 1,9.108 34 -1 1 -1 -1 -1 8,998 1,0.109 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 0 0 0 0 0 9,578 3,8.109 36 -1 1 1 -1 -1 9,446 2,8.109 37 1 -1 1 -1 -1 8,964 9,2.108 Từ bảng kết quả thu được (bảng 3.9) cho thấy giá trị Log (N/ mL) tăng lên so với thí nghiệm P-B, thay đổi từ 7,199 đến 10,456 (N/ mL). Theo kết quả mô hình phân tích hồi (phụ lục 2) quy ta thấy các yếu tố pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O có giá trị p<0,05 chứng tỏ sự có mặt của các yếu tố này là có ý nghĩa trong phương trình hồi quy. Yếu tố NaCl có giá trị p=0,202 (>0,05) chứng tỏ sự có mặt của NaCl là không có ý nghĩa. Suy ra phương trình hối quy có dạng: y = 8,5692 + 0,4825x1 + 0,7578x2 + 0,2677x3 – 0,3811x5. Trong đó y là hàm mục tiêu Log (N/ mL), x1,x2,x3,x5 lần lượt là các yếu tố pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O. Giá trị “Lack-of-fit” có p=0,822 (>0,05) Điều này có nghĩa là mô hình hồi quy là phù hợp, giá trị vùng khảo sát còn ở xa vùng cực trị. Do đó tiếp tục chuyển sang bước leo dốc tìm vùng chứa cực trị. 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC Dựa vào kết quả thực nghiệm và mô hình hồi quy nhận được từ thí nghiệm khởi đầu, những yếu tố có hệ số hồi quy âm, chứng tỏ khi nồng độ của các yếu tố này ở mức cao trong vùng khảo sát thì sinh khối sẽ giảm. Vì vậy, cần giảm giá trị khảo sát của các biến này cho mỗi bước leo dốc. Từ đó, bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính sẽ được tính toán và trình bày trong bảng 3.10. Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.7H2O Các chỉ tiêu (A) đường(B) (C) (G) Gốc 5 20 1,5 0,25 Khoảng biến thiên 7,5 7,5 1 0,05 Hệ số 0,4825 0,7578 0,2677 -0.3811 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3,61875 5,6835 0,2677 -0,019055 Bước chuyển động 0,6367 1 0,0455 -0,00335 Làm tròn bước chuyển 0,6 1 0,05 -0,003 động Chọn bước chuyển động δB = 1và tính toán các bước chuyển động còn lại: Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc STT Kí hiệu Yếu tố Log Mật độ Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4. (N/ mL) (CFU/ đường 7H2O mL) 1 Gốc 5 20 1,5 0,25 7,553 ± 0,380 3,6.107 2 Gốc + 1δ 5,6 21 1,55 0,247 7,861 ± 0,024 7,3.107 3 Gốc + 2δ 6,2 22 1,6 0,244 7,941 ± 0,024 8,7.107 4 Gốc + 3δ 6,8 23 1,65 0,241 7,957 ± 0,024 9,1.107 5 Gốc + 4δ 7,4 24 1,7 0,238 8,021 ± 0,104 1,0.108 6 Gốc + 5δ 8 25 1,75 0,235 8,075 ± 0,078 1,2.108 7 Gốc + 6δ 8,6 26 1,8 0,232 8,109 ± 0,016 1,3.108 8 Gốc + 7δ 9,2 27 1,85 0,229 8,165 ± 0,104 1,5.108 9 Gốc + 8δ 9,8 28 1,9 0,226 8,189 ± 0,000 1,5.108 10 Gốc + 9δ 10,4 29 1,95 0,223 8.213 ± 0,184 1,6.108 11 Gốc+10δ 11 30 2 0,22 8.262 ± 0,056 1,8.108 12 Gốc+11δ 11,6 31 2,05 0,217 8,390 ± 0,008 2,5.108 13 Gốc+12δ 12,2 32 2,1 0,214 8,406 ± 0,345 2,5.108 14 Gốc+13δ 12,8 33 2,15 0,211 8,414 ± 0,240 2,6.108 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 15 Gốc+14δ 13,4 34 2,2 0,208 8,917 ± 0,000 8,3.108 16 Gốc+15δ 14 35 2,25 0,205 9,037 ± 0,404 1,1.109 17 Gốc+16δ 14,6 36 2,3 0,202 10,574 ±0,449 3,7.1010 18 Gốc+17δ 15,2 37 2,35 0,199 11,672 ± 0,120 4,7.1011 19 Gốc+18δ 15,8 38 2,4 0,196 11,691 ± 0,139 4,9.1011 20 Gốc+19δ 16,4 39 2,45 0,193 11,488 ± 0,192 3,1.1011 21 Gốc+20δ 17 40 2,5 0,19 10,263 ± 0,112 1,8.1010 22 Gốc+21δ 17,6 41 2,55 0,187 9,489 ± 0,412 3,1.109 23 Gốc+22δ 18,2 42 2,6 0,184 8,949 ± 0,112 8,9.108 Dựa vào giá trị Log (N/ ml) ở bảng 3.11 ta thấy giá trị log tăng dần từ thí nghiệm 1 (Log = 7,553 ± 0,380) đến thí nghiệm 19 (Log = 11,691 ± 0,139) và bắt đầu giảm ở thí nghiệm 20 (Log = 11,488 ± 0,192). Vì vậy khoảng giá trị tối ưu của các yếu tố cho thí nghiệm tiếp theo là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L). Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L). CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L). MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L). 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN Từ kết quả thí nghiệm khởi đầu và thí nghiệm leo dốc 4 yếu tố ảnh hưởng chính đến khả năng sinh trưởng của chung L. plantarum NT1.5 là: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O sẽ được tiếp tục khảo sát để xác định giá trị tối ưu bằng thí nghiệm Box-Behken. Mỗi yếu tố được khảo sát ở 3 mức độ: cao (+1), thấp (-1) và mức độ trung tâm (0). Ma trận được thiết kế với 30 thí nghiệm trong đó có 6 thí nghiệm tại tâm. Mỗi thí nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc giữ 2 yếu tố tại tâm, thay đổi đồng thời 2 yếu tố còn lại. Các yếu tố được giữ tại tâm được thay đổi lần lượt để tạo ra 1 ma SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ trận không trùng nhau (ngoại trừ 6 thí nghiệm trung tâm). Giá trị các biến được xác định dựa trên kết quả thí nghiệm leo dốc. Giá trị các mức độ của các yếu tố và kết quả bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.12 và 3.13. Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken Giá trị từng mức độ (g/ L) Yếu tố -1 0 +1 A Pepton 14,6 15,8 17 B Mật rỉ đường 36 38 40 C CaCl2 2,3 2,4 2,5 G MgSO4.7H2O 0,202 0,196 0,19 Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken STT Pepton Mật rỉ CaCl2 MgSO4.7H2O Log Mật độ đường (N/mL) (CFU/ mL) 1 1 0 0 1 9,895 7,8.109 2 0 1 -1 0 9,941 8,7.109 3 1 -1 0 0 8,732 5,4.108 4 0 -1 0 1 7,958 9,0.107 5 0 0 -1 -1 9,735 5,4.109 6 1 1 0 0 10,801 6,3.1010 7 -1 0 0 1 7,937 8,6.107 8 0 0 0 0 12,113 1,2.1012 9 0 1 0 1 10,079 1,2.1010 10 0 1 0 -1 10,771 5,9.1010 11 0 -1 1 0 8,561 3,6.108 12 0 0 1 1 9,733 5,4.109 13 1 0 0 -1 10,594 3,9.1010 14 0 1 1 0 10,636 4,3.1010 15 0 0 0 0 12,073 1,2.1012 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 16 0 0 1 -1 10,424 2,7.1010 17 -1 0 -1 0 7,799 6,3.107 18 0 0 0 0 12,039 1,1.1012 19 0 -1 -1 0 7,785 6,1.107 20 -1 0 0 -1 8,623 4,2.108 21 0 -1 0 -1 8,698 5,0.108 22 0 0 0 0 12,117 1,3.1012 23 0 0 -1 1 9,045 1,1.109 24 0 0 0 0 12,039 1,1.1012 25 -1 0 1 0 8,486 3,1.108 26 -1 -1 0 0 6,758 3,8.106 27 0 0 0 0 11,764 5,8.1011 28 -1 1 0 0 8,834 6,8.108 29 1 0 1 0 10,459 2,9.1010 30 1 0 -1 0 9,773 5,9.109 Phân tích kết quả hồi quy phương sai của mô hình ta thấy tất cả các yếu tố đều có giá trị p<0,05. Trong đó yếu tố MgSO4.7H2O có hệ số hồi quy âm chứng tỏ sự có mặt của yếu tố với khối lượng cao sẽ làm giảm khả năng tăng trưởng của vi khuẩn và ngược lại với khối lượng thấp sẽ làm tăng khả năng tăng trưởng của vi khuẩn. Phương trình hồi quy của mô hình: Y = 12,0242 + 0,9847A + 1,0475B + 0,3518D – 0,3498D – 1,6781A2 – 1,5702B2 – 1,2173C2 – 1,0780D2. Trong đó A, B, C, D lần lượt là các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCl2, MgSO4.7H2O. Theo giá trị Lack-of-fit có p lớn hơn rất nhiều so với mức ý nghĩa α điều này có nghĩa dạng mô hình rất khớp với dữ liêu. Để biểu diễn trực quan về mối quan hệ giữa hàm mục tiêu với từng cặp biến thí nghiệm có thể sử dụng đồ thị bề mặt chỉ tiêu (đồ thị bề mặt hoặc đồ thị đường mức) được thể hiện ở đồ thị 3.1 và 3.2. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau Kết quả giá trị tối ưu hóa của môi trường được trình bày trong bảng 3.7.3 Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố Theo bảng 3.14 giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng lần lượt là: Pepton: 16,1515 g/ L. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L. CaCl2: 2,41515 g/ L. MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L. Như vậy, chúng tôi xác định được môi trường tối ưu để tăng sinh khối chủng L.plantarum NT1.5 bao gồm các thành phần và có giá trị như sau: Pepton: 16,15 g/ L Mật rỉ đường 38,7 g/ L CaCl2: 2,42 g/ L MgSO4.7H2O: 0,2 g/ L NaCl: 0,05 g/ L Nhiệt độ nuôi cấy: 37oC, pH=7. 3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L. PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU Sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn L. plantarum NT1.5 trên môi trường tối ưu được theo dõi dựa vào OD610 và giá trị Log (N/ mL). Kết quả được trình bày trong bảng 3.15 và đồ thị 3.16. Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian Thời gian (giờ) Giá trị OD Log (N/ mL) Mật độ (CFU/ mL) 0 0.023 6,793 ± 0,007 6,2.106 3 0.074 6,875 ± 0,021 7,5.106 6 0.165 7,021 ± 0,011 1,1.107 9 0.321 7,271 ± 0,038 1,9.107 12 0.477 7,521 ± 0,042 3,3.107 15 0.804 8,045 ± 0,089 1,0.108 18 1.252 8,764 ± 0,062 6,0.108 21 1.364 8,943 ± 0,018 8,5.108 24 1.674 9,439 ± 0,087 2,7.109 27 1.697 9,477 ± 0,031 2,9.109 30 1.828 9,686 ± 0,031 4,9.109 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 2.028 10,007 ± 0,077 1,0.1010 36 1.9 9,802 ± 0,021 6,3.109 39 1.834 9,697 ± 0,094 5,0.109 42 1.24 8,744 ± 0.363 5,5.108 45 1.212 8,699 ± 0,455 5,0.108 48 0.912 8,219 ± 0,035 1,7.108 12.000 10.000 ) 8.000 6.000 Log (N/ Log mL 4.000 2.000 0.000 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 Thời gian (giờ) Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L. plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường tối ưu Từ kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, nhận thấy trên môi trường tối ưu vi khuẩn cho sinh khối cao nhất tại 33 giờ, sinh khối đạt được Log = 10,007 ± 0,077 (N/ mL) khoảng 1.1010 tế bào / mL. Trên môi trường MRS chủng đạt được sinh khối cao nhất tại 18 giờ, nồng độ sinh khối đạt được khoảng 1,3.1010 tế bào / mL (tương ứng với log (N/ mL)=10,141) (theo bảng 3.2, mục 3.2). Trên môi trường tối ưu chủng L. plantarum NT1.5 đạt được mật độ sinh khối cao nhất chậm hơn 15 giờ so với môi trường MRS với mật độ tế bào tương đương. Điều này cho thấy các yếu tố trong thành phần môi trường tối ưu đã xác định được SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng trưởng của chủng Lactobacillus plantarum NT 1.5. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài, với những kết quả thu được chúng tôi có kết luận như sau: Sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào trên môi trường MRS theo phương trình y = 1,603x + 6,7566 với mức độ tin cậy 96,17%. Dựa vào đường cong tăng trưởng, xác định được thời gian thu sinh khối của L. plantarum NT 1.5 trên môi trường MRS nhiều nhất là 24 giờ. pH=7, 37oC là pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng của L. plantarum NT1.5. Từ các nguồn nitơ, cacbon, khoáng chọn được các yếu tố: pepton, mật rỉ đường, CaCO3, MgSO4, CaCl2, NaCl ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của vi khuẩn Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính P-B, xác định được các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối của chủng là: Pepton, Mật rỉ đường, MgSO4, CaCl2. Xác định được khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng thí nghiệm leo dốc tìm vùng cực trị là: Pepton: 14,6 – 17 (g/ L), Mật rỉ đường: 36- 40 (g/ L), CaCl2: 2,3 – 2,5 (g/ L), MgSO4.7H2O: 0,19 – 0, 202 (g/ L). Xác định được giá tri tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp Box-Behnken: Pepton: 16,1515 g/ L Mật rỉ đường: 38,6667 g/ L CaCl2: 2,41515 g/ L MgSO4.7H2O: 0,195091 g/ L Xác định được thời gian tạo sinh khối nhiều nhất của chủng trên môi trường tối ưu là 33 giờ. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.2 KIẾN NGHỊ Với mục đích tối ưu hóa môi trường lên men L. plantarum NT 1.5 để thu được sinh khối vi khuẩn nhiều nhất và có hiệu quả kinh tế cao. Chúng tôi đề nghị thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo sau: - Khảo sát các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền thay thế các nguồn dinh dưỡng hiện tại. - Thử nghiệm môi trường tối ưu trên quy mô lớn. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Nguyễn Tú Anh, Lê Thị Mỹ Linh, Nguyễn Văn Thanh (2003), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei”, Tạp chí Y học TP. HCM, Chuyên đề Dược, 7(4), Tr. 195-197. [2]. Nguyễn Đăng Diệp, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên cứu các thông số thích hợp trong qui trình công nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic", Tuyển tập công tác nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nông Nghiệp. [3]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. [4]. Nguyễn Văn Dự, Nguyễn Đăng Bình (2011), ” Quy hoạch thực nghiệm trong kỹ thuật”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, Tr.9-26, 138-216. [5]. Nguyễn Thành Đạt (2011), Cơ sở sinh học vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Sư Phạm [6]. Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, Tr. 251-255. [7]. Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng Qui hoạch thực nghiệm (các phương pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm), Trường Đại Học Đà Nẵng. [8]. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 24, Tr.221-226. [9]. Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm Thị Minh Trang, Trần Cát Đông (2013), “Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam lần III “Công nghệ sinh học vì cuộc sống”, Tr. 151. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO [10]. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 1- thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh. [11]. Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai (2012), phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ trên cá tra”, Tạp chí Khoa học, Pp. 224-234 [12]. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang, Phạm Thị Hồng Tươi (2001), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43. [13]. Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ Cẩm Quy (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh. Tiếng Anh [14]. Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J. F. (2000), “Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl. Environ. Microbiol, 66: Pp. 3368-3375. [15]. Barthelmebs, L., Divies, C. and Cavin, J-F. (2001), “Molecular characterization of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum”, Lait, 81:Pp. 161-171. [16]. Bevilacqua A., Corbo M. R., Mastromatteo M. and Sinigaglia M. (2008), “Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”, World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp. 1721–1729. [17]. Daeschel M. A. and Nes I. F. (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap. 21, Pp. 721-743. SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO [18]. David M. I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M. M. and Sherri A. M. (2013), “Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and Human Resources”, [19]. David D., Tryon V. V. and Dennis J. P. (1989), “Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”, Journal of Gener