Khóa luận Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống

ông nghệ sau thu hoạch Giáo viên hướng dẫn : TS. Đinh Thị Hiền TS. Đặng Hồng Ánh Địa điểm thực tập : Viện Công Nghiệp Thực phẩm HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Thu Trang 1 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Đinh Thị Hiền - Bộ môn Công nghệ chế biến, khoa Công nghệ Thực phẩm và TS. Đặng Hồng Ánh - Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công nghiệp thực phẩm, người đã dành nhiều thời gian, công sức tận tình giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể các thầy cô trong Khoa công nghệ thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã truyền đạt những kiến thức bổ ích, quý báu giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại trường. Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, các anh chị em, bạn bè đã luôn cảm thông, chia sẻ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Thu Trang 2 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................... 1 LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ 6 DANH MỤC BẢNG .............................................................................................................. 8 DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ ................................................................................................. 9 PHẦN I. MỞ ĐẦU.............................................................................................................10 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 12 1.2. Mục đích .......................................................................................................... 14 1.3. Yêu cầu............................................................................................................. 14 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 12 2.1. Tổng quan chung về bánh men rượu ............................................................ 12 2.1.1. Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam ......................................... 12 2.1.2. Phân loại bánh men rượu ............................................................................ 13 2.2. Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống ................ 13 2.2.1. Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu ........................................................ 13 2.2.1.1. Gạo ....................................................................................................................... 13 2.2.1.2. Men giống ............................................................................................................ 14 2.2.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men .................................................................... 15 2.2.2.1. Nấm men .............................................................................................................. 16 2.2.2.2. Nấm mốc .............................................................................................................. 16 2.2.2.3. Vi khuẩn ............................................................................................................... 17 2.2.3. Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống ...................................... 17 2.2.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ ................................................................................... 18 2.2.3.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................... 19 2.3. Nấm mốc – Vi sinh vật có khả năng đường hoá. ......................................... 20 2.3.1. Cấu tạo và hình thức sinh sản. ....................................................................... 21 2.3.1.1. Cấu tạo. ............................................................................................................ 21 2.3.1.2. Hình thức sinh sản. ........................................................................................... 21 3 2.3.2. Một số nấm mốc có khả năng đường hóa trong sản xuất rượu. ................... 22 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy. ................................................................................... 23 2.3.3.1. Phương pháp nuôi cấy bề sâu. ......................................................................... 23 2.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt. ......................................................................... 23 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy................................................................. 23 2.3.4.1. Độ ẩm môi trường. ........................................................................................... 23 2.3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy. ............................................................................................. 23 2.3.4.3. Thời gian nuôi . ................................................................................................ 24 2.3.4.4. pH môi trường. ................................................................................................. 24 2.4. Tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng trong sản xuất rượu truyền thống. ........................................................................ 25 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................... 26 3.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 26 3.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 26 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .......................................................................... 26 3.2.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 27 3.2.3. Thời gian nghiên cứu .................................................................................. 27 3.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 27 3.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 27 3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................... 27 3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống ... 28 3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. ............................................................................................................... 28 3.4.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu ............................................ 30 3.4.1.4. Thí nghiệm 4: Thử hoạt lực bột mốc từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn....... 31 3.4.2. Phương pháp phân tích ............................................................................... 31 3.4.2.1. Các phương pháp vi sinh .............................................................................. 31 3.4.2.2. Các phương pháp hóa sinh. .......................................................................... 32 4 3.4.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 34 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 35 4.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống .................... 35 4.1.1. Phân lập nấm mốc trong bánh men ............................................................ 35 4.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được .41 4.2. Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn ...................................................................................................................... 43 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn ............................................................................................................... 43 4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn ............................................................................................................... 44 4.2.3. Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn ....................................................................................................... 45 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu .............................................................................. 47 4.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men rượu ................................................................................................................ 48 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua trong quá trình lên men rượu ....................................................................................................... 49 4.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn trong quá trình lên men rượu ....................................................................................................... 50 4.4. Kết quả đánh giá hoạt lực bột mốc thu được ............................................... 52 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 54 5.1. Kết luận ........................................................................................................... 54 5.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 55 5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT Công thức NXB Nhà xuất bản PGS Phó giáo sư TS Tiến sĩ TSS Hàm lượng chất khô tổng số MTB Men thuốc bắc LMA Lên men ẩm LMD Lên men dịch HSLM Hiệu suất lên men 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới................................................12 Bảng 3.1: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định thời gian nuôi lắc nhân sinh khối.......................................................................................................................................29 Bảng 3.2: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi lắc nhân sinh khối.......................................................................................................................................30 Bảng 3.3: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm xác định số vòng lắc nuôi lắc nhân sinh khối.......................................................................................................................................30 Bảng 3.4: Bảng bố trí các công thức cho thí nghiệm nghiên cứu tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu............................................................................................................................31 Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ..............................35 Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên........................37 Bảng 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc.........................................41 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn............................................................................................................................................43 Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn............................................................................................................................................44 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn...................................................................................................................................46 Bảng 4.7: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men.........................................................................................................................48 Bảng 4.8: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua của quá trình lên men.........................................................................................................................49 Bảng 4.9: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của quá trình lên men.........................................................................................................................51 Bảng 4.10: Kết quả đánh giá hoạt lực của bột mốc so với bánh men Đức Ngọ gốc về một số chỉ tiêu sau 6 ngày LMD. ....................................................................................................53 7 DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ Hình 2.1:Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc (Nguyễn Đức Lượng, 2002).................18 Hình 4.1: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.......................................38 Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus oryzae............................................38 Hình 4.3: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Penicilium....................................................39 Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Penicilium..........................................................39 Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor...........................................................39 Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Mucor.................................................................39 Hình 4.7: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Rhizopus.......................................................40 Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Rhizopus.............................................................40 Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger..........................................40 Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus niger..............................................40 Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae..............................41 Hình 4.12: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus niger................................41 Hình 4.23: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium...........................................42 Hình 4.34: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Mucor.................................................42 Hình 4.45: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus.............................................42 Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01.....................................................................................................................43 Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01.....................................................................................................................45 Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01.....................................................................................................................46 Hình 4.19: Bốn mẫu cơm rượu khi kết bắt đầu quá trình lên men ẩm................................47 Hình 4.20: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. ...................................................48 Hình 4.21: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men.......50 Hình 4.22: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men.........51 Hình 4.24: Mẫu cơm rượu khi bắt đầu lên men ẩm..............................................................52 Hình 4.25: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. ...................................................52 8 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Rượu là đồ uống có từ lâu đời. Trong cuộc sống, nếu biết sử dụng hợp lý rượu sẽ rất tốt cho sức khỏe, và cần thiết trong giao tiếp. Rượu và các đồ uống có cồn chiếm một vị trí đáng kể trong công nghiệp thực phẩm. Chúng đa dạng tùy theo truyền thống và thị hiếu của người tiêu dùng mà các nhà sản xuất làm ra nhiều loại rượu khác nhau. Trong sản xuất rượu, hệ vi sinh vật trong bánh men đóng vai trò rất quan trọng. Chúng góp phần chuyển hóa các chất từ nguyên liệu thành đường và từ đường thành rượu nhờ quá trình đường hóa và lên men. Chúng cùng với nguyên liệu tạo nên chất lượng rượu. Ở nước ta, nghề nấu rượu thủ công có từ ngàn xưa và chưa có tài liệu nào cho biết chính xác có từ khi nào. Ở miền núi, đồng bào các dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn nấu chín rồi cho lên men, men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá. Nếu tiến hành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất thì sản phẩm gọi là rượu cần – Một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi. Ở đồng bằng, nhân dân biết làm men từ bột gạo với các vị thuốc bắc – thường gọi là men thuốc bắc (MTB) để lên men rượu từ các nguyên liệu khác nhau có chứa tinh bột như gạo nếp, gạo tẻ, ngô, sắn, ... và thu được loại rượu trắng với chất lượng khác nhau, trong đó có loại rất ngon và nổi tiếng. Như vậy, nghề làm rượu cổ truyền ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng men bánh hoặc men lá. Các men này có khả năng đường hóa tinh bột và lên men thành rượu. Trong các men này là một tập hợp các vi sinh vật có hoạt tính trên. Mãi đến cuối thế kỷ XIX (khoảng năm 1895), các nhà sinh vật học Pháp: Calmette, Boidin đã phân lập được một loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Mucor rouxii (hay Amylomyces). Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, nhiệt độ tối thích 33÷35°C, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năng phân giải tinh bột đật hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men một phần đường thành rượu. Tuy nhiên, nhiều loại men rượu trên thị trường hiện nay không rõ nguồn gốc xuất xứ, không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, không kiểm soát được hệ vi sinh vật cả về chủng loại, số lượng và tiềm ẩn nhiều nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. 9 Bởi vậy, việc nghiên cứu tìm ra một số chủng nấm mốc thuần chủng từ bánh men rượu truyền thống và từ đó ứng dụng sản xuất các chế phẩm bánh men vi sinh thuần chủng là một nhu cầu thiết yếu và có ý nghĩa quan trọng vào ngành công nghiệp sản xuất rượu. Từ những lý do trên, được sự đồng ý của Khoa Công nghệ thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng với sự giúp đỡ và hướng dẫn của TS Đinh Thị Hiền và TS Đặng Hồng Ánh – Bộ môn Công nghệ đồ uống, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, chúng tôi tiến hành đề tài : “Phân lập và nhân sinh khối một số chủng nấm mốc từ bánh men rượu truyền thống”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống để sản xuất bánh men rượu. 1.3. Yêu cầu Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus Penicillium và Aspergillus tuyển chọn được. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc/ nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. Thử hoạt lực bột mốc thu được từ chủng nấm mốc tuyển chọn được. 10 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan chung về bánh men rượu 2.1.1. Sơ lược về bánh men trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới, bánh men rượu truyền thống rất đa dạng và phong phú về chủng loại. Thái Lan có men Loopang dạng bột, Nhật Bản có men Koji dạng hạt, Hàn Quốc có men Nuruk và Meju dạng bánh lớn, v.v...( Haard, 1999). Men rượu là hỗn hợp các vi sinh vật có sự tác động tương hỗ trong quá trình lên men được nuôi trên cơ chất là các nguyên liệu giàu tinh bột như bột gạo, ngô, sắn, khoai, v.v.... Bảng 2.1: Bánh men được sử dụng ở các nước trên thế giới Tên nước Tên gọi Thành phần Dạng men Hệ vi sinh vật Nhật Bản Koji Lúa mỳ, gạo Dạng hạt Aspergillus Thái Lan Loopang Cám Dạng bột Amylomyces Aspergillus Malaysia Amylomyces Ragi Gạo Dạng bánh nhỏ Indonesia Endomycopsis Lúa mỳ, kê, gạo, Dạng bánh, dạng Rhizopus Trung Quốc Chu bo bo hạt Amylomyces Hansenula anomala Ấn Độ Marchaa Gạo Dạng bánh Mucor fragilis Rhizopus arrhizus Mucor, Rhizopus Phillipines Bubod Gạo Dạng bánh Saccharomyces (Haard, N. F. Fermented cereals: a global perspective, 1999) Nước ta có hai loại bánh men chính là: Bánh men thuốc bắc được sản xuất từ một số vị thuốc bắc với bột gạo và bánh men lá được sản xuất từ bột gạo và các loại lá, củ, quả 11 rừng theo kinh nghiệm cổ truyền. Men thuốc bắc (MTB) được trộn từ các vị thuốc bắc với bột gạo. Bột gạo nghiền nhỏ, bột thuốc bắc nghiền nhỏ cùng bột bánh men cái, trộn đều (Lương Đức Phẩm, 2012). Trong bánh men thuốc bắc nhờ có các vị thuốc bắc với thành phần hợp lý mà hạn chế được sự phát triển của các tạp khuẩn từ không khí vào bánh men. Mặt khác một số vị thuốc còn có tác dụng kích thích sự phát triển của nấm men và nấm mốc, nhờ vậy mà quá trình đường hoá và rượu hoá sau này diễn ra tốt hơn (Lương Đức Phẩm, 2012). Ở các vùng núi cao men lá thường được sử dụng. Lá sử dụng thường là các loại có nhiều tinh dầu và có mùi thơm. Tùy thuộc vào từng địa phương mà trong men có các loại lá khác nhau. Để làm men lá, người K’Ho Tây Nguyên sử dụng bột thân cây “đòng” và nước chiết cây “me-kà-zut” trộn với bột gạo (Lương Đức Phẩm, 2012). Vùng tây Nghệ An dùng các loại lá: lá mít, lá mía, lá nhân và lá quế, (Lương Đức Phẩm, 2009). 2.1.2. Phân loại bánh men rượu Từ xa xưa, người ta đã biết sử dụng một thành phần của mẻ lên men trước để cho vào mẻ lên men sau, cách làm này nhằm rút ngắn thời gian lên men đồng thời làm giảm những hư hỏng xảy ra trong quá trình lên men. Ngày nay người ta đã chủ động nuôi cấy các vi sinh vật đã chọn lọc để sản xuất những chế phẩm vi sinh đáp ứng tốt yêu cầu của quá trình lên men rượu. Các chế phẩm này gọi là bánh men rượu. Bánh men rượu được sản xuất chủ yếu từ gạo (nguyên liệu chính cung cấp tinh bột trong sản xuất bánh men) và men giống là các vi sinh vật để tiến hành đường hóa và rượu hóa, người ta cũng có thể trộn chung với các loại vị thuốc thảo mộc khác. Tùy từng địa phương, việc sử dụng các vị thuốc là rất khác nhau. Tạm thời có thể chia làm 3 loại:  Bánh men rượu không có thuốc bắc (Bánh men thường).  Bánh men rượu có thuốc bắc.  Bánh men rượu có lá rừng (Bánh men lá). 2.2. Giới thiệu về công nghệ sản xuất bánh men rượu truyền thống 2.2.1. Nguyên liệu sản xuất bánh men rượu 2.2.1.1. Gạo Gạo được chọn làm nguyên liệu chính để cung cấp tinh bột cho sản xuất bánh men. 12 Thành phần hóa học của gạo phụ thuộc vào nhiều yếu tố như đất đai, khí hậu, phân bón, giống lúa cũng như kỹ thuật chế biến và bảo quản. Theo Lê Vĩnh Thảo và cs. (2004), tinh bột gạo thuộc loại tinh bột phức tạp có kích thước rất nhỏ, thành phần tinh bột gạo tẻ gồm khoảng 17% amylose và 83% amylopectin. Tinh bột gạo có hình đa giác, kích thước nhỏ, trong khoảng 2-10 m. Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ và nằm sát nhau nên quá trình hồ hóa khó khăn hơn, nhiệt độ hồ hóa khoảng 70 - 80oC. Tinh bột có 2 loại: Amylose có cấu tạo mạch thẳng và amylopectin có cấu tạo mạch nhánh, tỷ lệ thành phần này liên quan đến độ dẻo của hạt. Các loại gạo Việt Nam có hàm lượng amylose thay đổi từ 15 - 35%. Ngoài ra trong gạo còn có các thành phần hóa học như protein chiếm 6 – 8%, lipit khoảng 2,02% phân bố ở lớp vỏ gạo và phôi, và có một lượng các vitamin đặc biệt là vitamin B như vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt. Thành phần chính của gạo: - Tinh bột (70% – 75% chất khô). - Các loại đường ( 2% – 5% chất khô). - Protit (6% - 8% chất khô). - Chất béo (1% - 1,5% chất khô). Tinh bột gạo chiếm 90% - 95% tổng khối lượng các nguyên liệu dùng làm bánh men. 2.2.1.2. Men giống Men giống được sử dụng là các loại bánh men cũ phát triển trên cơ chất là tinh bột, tiến hành đường hóa và rượu hóa. Cũng có thể không dùng bánh men cũ mà chỉ dùng bột gạo, thuốc bắc để làm men thuốc bắc, lúc đó, các vi sinh vật trong không khí sẽ vào bánh men, những chủng nấm mốc, nấm men nào không bị chất kháng khuẩn của thuốc bắc tiêu diệt thì sẽ phát triển nhờ quá trình phân giải tinh bột thành đường glucose và lên men rượu từ các đường cơ bản. Tuy nhiên trong sản xuất bánh men cổ truyền, nếu làm như vậy thì thời gian ủ bánh sẽ kéo dài vì các chủng nấm men, nấm mốc cần thời gian xâm nhập, thích nghi và phát triển, đồng thời chủng giống cũng sẽ yếu hơn so với việc dùng bánh men cũ làm giống. Trên môi trường nuôi cấy cơ chất là tinh bột gạo và ở điều kiện thích hợp, các chủng nấm men, nấm mốc có khả năng sản sinh ra enzyme amylase để thủy phân tinh bột thành 13 đường glucose, còn các chủng nấm men rượu sẽ sử dụng đường khử để duy trì quá trình sống và phát triển. Và sau khi đã đạt đến thời điểm nuôi cấy, đem sấy tới độ ẩm bảo quản thì các chủng vi sinh vật này sẽ cùng tồn tại trên một môi trường bánh men. Thời gian để một bánh men giống có khả năng lên men rượu cao phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau, tùy thuộc vào các giống vi sinh vật (nấm mốc, nấm men), điều kiện ủ và chế độ sấy. 2.2.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men Thực chất bánh men là canh trường không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp enzyme đường hóa và lên men rượu, nói cách khác hệ vi sinh vật trong bánh men rất đa dạng. Trong đó, có 3 loại phổ biến nhất: Nấm men, nấm mốc, vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy giá trị pH bánh men Việt Nam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,5%, nấm mốc 3,4×106, nấm men 5,8×107 cfu/gam bánh men. Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào mốc, 51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn. Các chủng nấm mốc xác định được: Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides, Amylomyces rouxii... và các chủng nấm men thường gặp: Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Sacchromycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candidas sp (A.H.Rose, 1977). Việc nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men để bổ sung vào sản xuất bánh men nhằm làm giàu các chủng vi sinh vật này để nâng cao chất lượng và ổn định bánh men là cần thiết. Tiêu chí để tuyển chọn các chủng nấm mốc, nấm men như sau: - Đối với các chủng nấm men:  Có hoạt lực lên men mạnh, hiệu suất lên men rượu cao, chịu được nồng độ đường cao.  Chịu được môi trường có nồng độ axit cao.  Tạo hương thơm và sinh ít tạp chất. - Đối với nấm mốc:  Sinh trưởng tốt trên môi trường nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.  Có khả năng sinh tổng hợp hệ emzyme amylase cao, trong một thời gian ngắn.  Tạo hương thơm. 14 2.2.2.1. Nấm men Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào và nhân chuẩn thường sinh sản bằng cách nảy chồi. Hình dạng nấm rất phong phú phụ thuộc vào giống loài, nó có thể dạng hình cầu, hình trứng hay hình bầu dục, hình tam giác... Đối với nấm men trong qua trình hoạt động sống, chúng đồng hóa các monosacarit trong điều kiện yếm khí, thải ra môi trường xung quanh sản phẩm dị hóa là rượu etylic và khí cacbonic nhờ tác dụng của phức hệ các enzyme ( Nguyễn Lân Dũng, 2002). Đây là một trong những đặc trưng quan trọng của nấm men đã được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men. Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Gồm 2 chi chủ yếu là: - Endomycopsis (chủ yếu là Endo. Fibuligenes): là nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase. Do đó vừa có khả năng rượu hóa vừa có khả năng đường hóa. - Sacharomyces (Chủ yếu là S.Cerevisiae): Đây là loại nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình rượu hóa. Chúng có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose và lên men được ở nhiệt độ cao (khoảng từ 36 - 40°C), chịu được axit. Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả năng lên men các loại ngu...ị lệch đi. Dựa trên độ lệch của tia sáng ta có thể xác định được nồng độ chất hòa tan có trong dung dịch. Tiến hành: Nhỏ vài giọt nước cất vào chiết quang kế điện tử, nhấn start chỉnh về mức 0.0 hàm lượng chất khô. Lau sạch nước nhỏ vài giọt mẫu lên chiết quang kế điện tử, nhấn start, đọc số hiện thị trên chiết quang kế. Tính kết quả: Đọc kết quả hiển thị, đó chính là hàm lượng chất khô tính theo % của mẫu đem phân tích. d. Xác định khả năng phân giải tinh bột Xác định bằng đường kính vòng thủy phân tinh bột của các chủng trên môi trường thạch đĩa có chứa tinh bột. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường Czapeck (0,5% tinh bột) cho 40 đĩa petri 20ml (800ml). Hấp khử trùng 121℃ trong 30 phút, pH 5.0-5.5. Cho 20ml môi trường trên vào đĩa peptri đã vô trùng, các đĩa petri bằng nhau. Làm nguội, dùng que cấy chấm nhẹ các mẫu mốc vào giữa đĩa petri. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ. Cho thuốc thử và đo đường kính vòng phân giải Thuốc thử lugol : 1g I2 và 0,5g KI trong 100ml nước cất, lắc cho tan hết. e. Phương pháp trích ly enzyme amylase. Cân 5 gam sinh khối/ chế phẩm cho vào ống Falcon 50ml, bổ sung thêm 30ml nước cất, nuôi lắc 3 giờ tốc độ 180 vòng/ phút. Ly tâm 6000 vòng /phút trong 10 phút. Lấy dịch ở phía trên thu được dịch chiết ly enzym. 3.4.2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Excel và Minitab 18. 33 IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chủng giống bánh men là một yếu tố rất quan trọng quyết định đến chất lượng rượu, nồng độ rượu. Việc lựa chọn loại bánh men giống là bước đầu tiên vô cùng cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai mẫu men Đức Ngọ và Thái Nguyên cho độ rượu tốt và mùi thơm đặc trưng. 4.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Mucor, Rhizopus, Penicillium và Aspergillus có khả năng đường hóa cao từ bánh men rượu truyền thống. 4.1.1. Phân lập nấm mốc trong bánh men. Hệ vi sinh vật trong bánh men rất phong phú bao gồm : nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các chủng nấm mốc trong bánh men đóng vai trò sinh enzyme amylaza để thủy phân tinh bột, lượng đường do enzyme amylaza thủy phân tinh bột tạo ra là yếu tố quan trọng quyết định đến lượng cồn được tạo ra khi lên men. Do đó, tôi sẽ tập trung vào phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao. Đầu tiên, tiến hành phân lập nấm mốc trong bánh men. Sử dụng môi trường tối ưu cho nấm mốc là môi trường Czapeck-dox. Khi tách được các khuẩn lạc riêng biệt, nuôi cấy tạo giống thuần chủng. Sau đó tiến hành làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Kết hợp việc quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào với khóa phân loại để phân loại nấm mốc và tài liệu của Barnett(1973). Kết quả thu được như sau: Bảng 4.1: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Đức Ngọ. Chủng vi STT Kí hiệu Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào sinh vật Hệ sợi rất phát triển, Khuẩn ty đơn bào ban đầu màu trắng, không có vách ngăn, 1 ĐN01 Nấm mốc Mucor sau đó sẫm hơn và bào tử kín. Đầu sợi ngả sang màu đen. nấm là cuống bào tử nang. Nang bào tử hình cầu, khi thành 34 của nang bào tử nứt ra giải phóng bào tử. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, màu vàng hoa cau, bào tử trần, cuống khi già có màu xanh mang bào tử phát triển ĐN02 lục. từ tế bào chân, phần Aspergillus 2 ĐN03 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 oryzae cái bọng (vesicle), trên ĐN04 bọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, ĐN05 màu đen. bào tử trần, cuống mang bào tử phát triển ĐN06 từ tế bào chân, phần Aspergillus 3 ĐN07 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 niger cái bọng (vesicle), trên ĐN08 bọng mọc lên các thể ĐN09 bình, trên thể bình sinh ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. ĐN10 Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn ty đa nhân có 4 Nấm mốc Penicilium sợi rất ngắn, có màu vách ngăn, bào tử trần, ĐN11 xanh nhạt,ở trung cuống mang bào tử 35 tâm lồi lên, có những hình thành ngay lớp rãnh từ trung tâm đi thể bình và các bào tử. ra. Khuẩn ty có màu Khuẩn ty đơn bào, đen, rễ cắm sâu vào hông có vách ngăn, cơ chất, ban đầu có bào tử kín. Trên khuẩn 5 ĐN12 Nấm mốc Rhizopus màu trắng, sau đó có ty hình thành những màu đen hoàn toàn. nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất. Bảng 4.2: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ bánh men Thái Nguyên. Chủng vi STT Kí hiệu Tên chủng Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào sinh vật TN01 Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn ty đa nhân có sợi rất ngắn, có màu vách ngăn, bào tử trần, TN02 xanh nhạt,ở trung cuống mang bào tử TN03 tâm lồi lên, có những hình thành ngay lớp 1 Nấm mốc Penicilium rãnh từ trung tâm đi thể bình và các bào tử. TN04 ra. TN.B TN.H Khuẩn ty có màu Khuẩn ty đơn bào, 2 TN05 Nấm mốc Rhizopus đen, rễ cắm sâu vào hông có vách ngăn, cơ chất, ban đầu có bào tử kín. Trên khuẩn màu trắng, sau đó có ty hình thành những 36 màu đen hoàn toàn. nút (đế chồi) mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất. Khuẩn lạc hình tròn, Khuẩn ty phân nhánh, sợi mảnh, ngắn, có có vách ngăn ngang, TN06 màu vàng hoa cau, bào tử trần, cuống TN.A khi già có màu xanh mang bào tử phát triển lục. từ tế bào chân, phần TN.C Aspergillus 3 Nấm mốc cuối phồng lên thành 1 oryzae TN.D cái bọng (vesicle), trên TN.E bọng mọc lên các thể bình, trên thể bình sinh TN.G ra các chuỗi bào tử xòe ra như bông hoa cúc. Nhận xét: Kết thúc quá trình phân lập từ hai mẫu bánh men Đức Ngọ và Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 1 chủng Mucor, 2 chủng Rhizopus, 8 chủng Penicilium, 10 chủng Aspergillus oryzae và 5 chủng Aspergillus niger. 37 Hình 4.1: Cấu trúc hình thái Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Aspergillus Aspergillus oryzae. oryzae. Hình 4.3: Cấu trúc hình thái Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Penicilium. Penicilium. 38 Hình 4.5: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Mucor. Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Mucor. Hình 4.7: Cấu trúc hình thái Hình 4.8: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc chủng nấm mốc Rhizopus. Rhizopus. 39 Hình 4.9: Cấu trúc hình thái chủng nấm mốc Aspergillus niger. Hình 4.10: Hình thái khuẩn lạc chủng mốc Aspergillus niger. 4.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng đường hóa của các chủng nấm mốc phân lập được. Từ các chủng nấm mốc phân lập được, tiến hành xác định khả năng phân giải tinh bột của chúng bằng phương pháp cấy chấm điểm mốc ở tâm hộp peptri chứa môi trường Czapeck có bổ sung cơ chất tinh bột, sử dụng dịch chiết emzyme amylase thu được từ các chủng nấm mốc ( mục 3.4.2.1-d, trang 28) để kiểm tra hoạt tính. Nuôi ở nhiệt độ 30°C sau 48 giờ, kiểm tra hoạt tính bằng thuốc thử thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân tinh bột. Đường kính vòng thủy phân tỉ lệ thuận với khả năng phân bột của nấm mốc. Đường kính càng lớn thì khả năng phân giải tinh bột của chủng nấm mốc đó càng lớn. Kết quả thu được: 40 Bảng 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc. STT Chủng mốc Đường kính vòng thủy phân tinh bột 1 Aspergillus oryzae 0,7mm 2 Penicilium 1,5mm 3 Mucor 4,0mm 4 Rhizopus 3,2mm 5 Aspergillus niger 0,7mm Hình 4.11: Vòng phân giải tinh bột của Hình 4.52: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Aspergillus oryzae. chủng nấm Aspergillus niger. 41 Hình 4.63: Vòng phân giải tinh bột của Hình 4.74: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Penicilium. chủng nấm Mucor. Hình 4.85: Vòng phân giải tinh bột của chủng nấm Rhizopus. Nhận xét: Từ bảng 3.4 cho thấy, các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột tốt. Sơ bộ dựa vào đường kính vòng phân giải tinh bột cho thấy chủng nấm Mucor có khả năng phân giải tinh bột tốt nhất có đường kính vòng thủy phân tinh bột là 1,4 cm, sau đó lần lượt là các chủng nấm Rhizopus (1,2cm), chủng nấm Penicillium (0,9cm) và khả năng phân giải tinh bột kém nhất là chủng nấm Aspergillus (0,7cm). Như vậy, chủng mốc Mucor (ĐN01) được lựa chọn cho những thí nghiệm tiếp theo. 42 4.2. Kết quả nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Trong quá trình nuôi sinh khối lỏng, các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, thời gian, số vòng lắc đều ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Chúng tôi tối ưu điều kiện nuôi cấy bằng cách xác định lượng sinh khối thu được sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy. 4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C, số vòng lắc 150 vòng/phút. Trong khoảng 24÷48 giờ, lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.4: Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.1.1 6,54b ± 0,965 2 CT2.1.2 10,67a ± 0,992 3 CT2.1.3 10,92a ± 1,008 Kết quả ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 12 48, 10.92 10 36, 10.67 8 6 24, 6.54 4 Lượng sinh khối thu được (gam) 2 0 0, 0 Lượng sinh khối (gam) 0 20 40 60 Thời gian nuôi (giờ) Hình 4.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 43 Nhận xét: Từ bảng 4.4 và đồ thị 4.16 ta thấy, tại thời điểm từ 24÷36 giờ là khoảng thời gian mà chủng nấm mốc ĐN01 phát triển mạnh nhất, gia tăng lượng sinh khối nhiều nhất 4,13g sinh khối. Từ khoảng thời gian 36÷48 giờ, ta thấy chủng nấm mốc ĐN01 phát triển chậm lại, lượng sinh khối gia tăng không nhiều 0,25g. Như vậy ta có thể chọn thời gian nuôi sinh khối vừa tạo ra lượng sinh khối lớn vừa rút ngắn thời gian nuôi sinh khối là 36 giờ. 4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng trong thời gian 36 giờ, số vòng lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ nuôi lần lượt là 28°C, 30°C, 32°C. Kết thúc quá trình nuôi sinh khối lỏng lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.5: Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.2.1 10,47ab ± 0,345 2 CT2.2.2 11,75a ± 0,659 3 CT2.2.3 11,46ab ± 0,685 4 CT2.2.4 10,05b ± 0,763 44 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 12 30, 11.75 11.5 32, 11.46 11 10.5 28, 10.47 Lượng sinh khối thu được(gam) 10 35, 10.05 Lượng sinh khối (gam) 9.5 0 10 20 30 40 Nhiệt độ (°C) Hình 4.17: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. Nhận xét: Từ bảng 4.5 và đồ thị 4.16 ta thấy, trong khoảng nhiệt độ từ 30÷32°C chủng nấm mốc ĐN01 phát triển tốt nhất, lượng sinh khối sinh ra nhiều nhất. Trong khoảng nhiệt độ 28°C đến dưới 30°C và trên 32°C không phải là khoảng nhiệt độ tối ưu cho chủng nấm mốc ĐN01 phát triển, lượng sinh khối sinh ra thấp hơn khi cho chủng nấm mốc phát triển ở nhiệt độ 30÷32°C. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ 30°C chủng nấm mốc ĐN01 nhân được nhiều sinh khối nhất. 4.2.2. Ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. Tiến hành nuôi sinh khối chủng nấm mốc ĐN01 trên môi trường Czapeck lỏng ở nhiệt độ 30°C, trong thời gian 36 giờ, số vòng lắc lần lượt là 100, 150, 200 vòng/phút. Kết thúc quá trình nuôi sinh khối lỏng lấy mẫu ra cân lượng sinh khối thu được, kết quả được trình bày ở bảng 4.6: 45 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. STT Công thức Lượng sinh khối trung bình thu được (g/l) 1 CT2.3.1 8,46c ± 0,894 2 CT2.3.2 12,23b ± 0,824 3 CT2.3.3 14,22a ± 0,527 Kết quả ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. 16 14 200, 14.22 12 150, 12.23 10 8 100, 8.46 6 Lượng sinh khối thu được (gam) 4 Lượng sinh khối (gam) 2 0 0 50 100 150 200 250 Số vòng lắc (vòng/phút) Hình 4.18: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của số vòng lắc lên quá trình nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01. Nhận xét: Từ bảng 4.6 và đồ thị 4.18 ta thấy, khi nuôi lắc nấm mốc ở 200 vòng/phút lượng sinh khối trung bình thu được là lớn nhất. Bởi vì, trong quá trình sinh trưởng và phát triển, oxy cần phải được cung cấp đủ, nếu oxy không đủ vi sinh vật sẽ chết hoặc chuyển sang trạng thái yếm khí. Đối với vi sinh vật hiếu khí và kị khí, tỷ lệ tăng trưởng và trao đổi chất của chúng phụ thuộc vào lượng oxy hòa tan có sẵn trong môi trường. Khi rung lắc bình, chất lỏng sẽ tráng lên thành bình, làm tăng diện tích tiếp xúc với không khí, do vậy sẽ tăng được lượng oxy hòa tan. Rung lắc càng mạnh lượng oxy hòa tan vào môi trường càng lớn. Tuy vậy cũng không nên tăng tốc độ lắc lên quá cao, do tốc độ cao tạo ra ứng suất cắt 46 có thể gây hại cho tế bào vi sinh vật. Bởi vậy, ta chọn số vòng lắc khi nuôi nấm mốc là 200 vòng/phút. 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men rượu. Quá trình lên men rượu thông thường cần sử dụng bao gồm cả nấm mốc, nấm men và một số loại vi khuẩn. Nguyên liệu gạo sau khi hấp được làm nguội thì bánh men được đưa vào trộn đều, ở giai đoạn lên men ban đầu nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đường hóa nhờ nấm mốc và quá trình rượu hóa nhờ nấm men. Trong thí nghiệm này, để nghiên cứu tỷ lệ bột mốc cho vào cơm rượu, tiến hành lên men rượu với tỷ lệ giữa bột mốc cho vào 100g gạo lần lượt là 1g; 1,5g; 2g; 2,5g. Nhiệt độ lên men ẩm: 30°C. Thời gian lên men ẩm: 2 ngày. Nhiệt độ lên men dịch: 28°C. Thời gian lên men dịch: 6 ngày. Lượng nước cho vào để lên men dịch: 200ml. Hình 4.19: Bốn mẫu cơm rượu khi kết bắt đầu quá trình lên men ẩm. 47 Hình 4.20: Bình lên men rượu khi bắt đầu lên men dịch. 4.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men rượu. Trong quá trình lên men rượu, nấm mốc có vai trò quan trọng thực hiện quá trình đường hóa chuyển các chất có khối lượng cao phân tử thành các chất có khối lượng phân tử thấp hơn (chuyển tinh bột thành đường) và nấm men sẽ chuyển hóa đường có trong dịch lên men thành rượu. Thí nghiệm này nhằm mục đích khảo sát sự thay đổi TSS trong quá trình lên men khi thay đổi tỷ lệ bột mốc và nguyên liệu. Bảng 4.7: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến TSS trong quá trình lên men. TSS sau khi TSS qua các ngày LMD (°Bx) CT kết thúc LMA (°Bx) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 8,8d ± 8,1d ± 7,4d ± 7,1d ± 6,8d ± 6,6d ± CT3.1 15,3d ± 0,058 0,058 0,1 0,10 0,058 0,00 0,00 11,9c ± 10,2c ± 8,5c ± 7,6c ± 7,2c ± 7,0c ± CT3.2 23,8a ± 0,058 0,00 0,058 0,058 0,058 0,058 0,058 12,6b ± 10,4b ± 8,8b ± 8,2b ± 7,9b ± 7,5b ± CT3.3 22,5b ± 0,10 0.058 0,10 0,058 0,00 0,058 0,10 48 13,8a ± 11,9a ± 9,8a ± 8,6a ± 8,2a ± 7,9a ± CT3.4 20,3c ± 0.058 0,10 0,058 0,058 0,10 0,058 0,00 Nhận xét: Từ bảng 4.7 cho thấy, TSS sau khi kết thúc quá trình LMA là rất cao do trong quá trình LMA, nấm mốc đã chuyển hóa tinh bột thành đường. Trong đó, TSS cao nhất ở CT3.2 với 23,8°Bx. Khi tăng tiếp tỷ lệ nấm mốc lên từ 2-2,5g ở CT3.3 và CT3.4 thì TSS giảm dần lần lượt chỉ còn 22,5°Bx và 20,3 °Bx, bởi vì tỷ lệ nấm mốc cao, lượng nấm mốc nhiều, các nấm mốc sẽ cạnh tranh nhau sử dụng cơ chất môi trường và ức chế nhau khiến cho TSS giảm. Trong quá trình LMD từ bảng 4.7, ta dễ dàng nhận thấy TSS giảm dần qua từng ngày, vì trong quá trình LMD, nấm men chuyển hóa đường thành rượu. Trong đó, độ giảm TSS ở CT3.2 là lớn nhất từ 23,8°Bx xuống còn 7,0°Bx chứng tỏ các chủng nấm mốc phát triển tốt. 4.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua trong quá trình lên men rượu. Trong quá trình lên men, bên cạnh nấm men sẽ sản sinh ra khí CO2 và CO2 có tác dụng với nước tạo thành axit làm tăng độ chua của dịch lên men thì vi khuẩn hoạt động mạnh cũng là nguyên nhân gây nên độ chua của dịch lên men cao. Bảng 4.8: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ chua của quá trình lên men. CT Độ chua qua các ngày lên men dịch (độ) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 CT3.1 0.05d ± 0.073d ± 0.09d ± 0.112d ± 0.19d ± 0.2d ± 0,00 0,00058 0,0025 0,00 0,0020 0,00 CT3.2 0.065c ± 0.106c ± 0.158c ± 0.206c ± 0.232c ± 0.248c ± 0,0030 0,0020 0,0020 0,00 0,002 0,00 CT3.3 0.076b ± 0.124b ± 0.212b ± 0.276b ± 0.312b ± 0.332b ± 49 0,0020 0,00 0,0020 0,0020 0,00 0,0020 CT3.4 0.082a ± 0.149a ± 0.242a ± 0.304a ± 0.343a ± 0.351a ± 0,002 0,0010 0,0020 0,00 0,0025 0,0010 Ảnh hưởng tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men qua từng ngày 0.4 0.35 0.3 0.25 CT3.1 0.2 CT3.2 0.15 CT3.3 Độ chua (g/ml) 0.1 CT3.4 0.05 0 1 2 3 4 5 6 Hình 4.21: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ chua của dịch lên men. Nhận xét: Từ bảng 4.8 và hình 4.12 ta thấy, độ chua của dịch lên men tăng dần qua từng ngày. Các công thức có độ chua sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: CT3.4>CT3.3>CT3.2>CT3.1. CT3.4 có độ chua cao nhất 0,351 (độ) và công thức có độ chua nhỏ nhất là CT3.1 với độ chua là 0,2 (độ). Các công thức có độ chua cao có thể là do hệ nấm men hoạt động phát triển tốt sản sinh ra nhiều khí CO2 do quá trình rượu hóa tạo ra. Tuy nhiên từ kết quả bảng 4.7 ta có thể thấy ở 2 công thức CT3.3 và CT3.4 TSS trong quá trình LMD là khá cao, lượng đường có trong dịch lên men khá cao tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển khiến độ chua của dịch lên men tăng nhanh. 4.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn trong quá trình lên men rượu. Nồng độ cồn là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hoạt lực lên men rượu. Bánh men có chất lượng tốt là loại bánh men cho ra rượu có chất lượng tốt, hiệu suất cao. Bảng 50 4.9 dưới đây là kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của dịch lên men: Bảng 4.9: Bảng kết quả ảnh hưởng tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu đến độ cồn của quá trình lên men. Độ cồn qua các ngày lên men dịch (%V) CT HSLM Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 5.2d ± 8.8d ± 10.5d ± 11.4d ± 12.1c ± 12.3c ± CT3.1 38,2% 0,200 0,00 0,00 0,00 0,115 0,058 7.5a ± 10,0b ± 12,1a ± 13.4a ± 13.9a ± 13.9a ± CT3.2 43,16% 0,00 0,115 0,058 0,00 0,00 0,058 6.9b ± 10.6a ± 11.2c ± 12.4b 12.6b ± 12.6b ± CT3.3 39,13% 0,058 0,00 0,00 ±0,00 0,00 0,058 6.5d ± 9.8c ± 11.4b ± 12.0c 12.0c ± 12.0d ± CT3.4 37,27% 0,00 0,058 0,100 ±0,00 0,00 0,00 Ảnh hưởng tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 16 14 12 10 8 6 Độ cồn Độ(%V) cồn 4 2 0 CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 Công thức Hình 4.22: Đồ thị kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ bột mốc tới độ cồn của dịch lên men 51 Nhận xét: Từ bảng 4.9 ta thấy, hiệu suất lên men của CT3.2 là cao nhất đạt 43,16%, sau đó đến CT3.3 đạt 39,13%, CT3.1 đạt 38,2% và cuối cùng là CT3.4 đạt 37,27%. Như vậy, từ kết quả bảng 4.7, 4.8 và 4.9 ta thấy, TSS của CT3.2 sau khi kết thúc quá trình LMA là cao nhất và độ giảm TSS khi kết thúc quá trình LMD cũng là lớn nhất. Độ chua CT3.1 là thấp nhất tuy nhiên độ cồn và HSLM đạt được sau khi kết thúc LMD lại chỉ đứng thứ 3 sau CT3.3 và CT3.2. Ở CT3.2 ta thấy dù độ chua chỉ thấp thứ 2 sau CT3.1 nhưng độ cồn và HSLM đạt là cao nhất với 13,9 độ cồn và HSLM lên tới 43,16%. 4.4. Kết quả đánh giá hoạt lực bột mốc thu được: Trong thí nghiệm này, để đánh giá hoạt lực của bột mốc thu được, tiến hành lên men rượu mẫu bột mốc thu được so với mẫu bánh men gốc với công thức như sau: + Mẫu 1 (CT4.1): Hoạt hóa men khô: 1g men : 1g Glucose. Nhiệt độ 30°C -33°C trong vòng 30 phút. Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g bột mốc ĐN01. + Mẫu 2 (CT4.2): Nấu 100g gạo nứt với 120g nước đem trộn với 1,5g lượng bánh men gốc ban đầu. Nhiệt độ lên men ẩm: 30°C. Thời gian lên men ẩm: 2 ngày. Nhiệt độ lên men dịch: 28°C. Thời gian lên men dịch: 6 ngày. Lượng nước cho vào để lên men dịch: 200ml. Hình 4.24: Mẫu cơm rượu khi bắt đầu lên men Hình 4.25: Bình lên men rượu khi bắt đầu ẩm. lên men dịch. 52 Phân tích mẫu dịch qua từng ngày thu được kết quả như sau: Bảng 4.10: Kết quả đánh giá hoạt lực của bột mốc so với bánh men Đức Ngọ gốc về một số chỉ tiêu sau 6 ngày LMD. Chỉ CT4.1 CT4.2 tiêu Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 TSS 6,9a ± 7,2a ± 5,5b ± 6,9b ± 7,0a ± 0,00 6,6b ± 0,00 (°Bx) 0,058 0,058 0,058 0,058 Độ 0,248b ± 0,25a ± 0,262b ± 0,352a ± chua 0,3a ± 0,00 0,2b ± 0,00 0,002 0,00 0,002 0,002 (độ) Độ cồn 13,9a ± 13,8a ± 13,5a ± 12,6b ± 13,4b ± 11,6b ± (%V) 0,058 0,00 0,058 0,00 0,00 0,00 HSLM 43,16% 42,86% 41,93% 39,13% 41,62% 36,02% Nhận xét: Qua 3 lần thí nghiệm của mỗi công thức cho thấy, ở CT4.2 với mẫu men Đức Ngọ gốc khi lên men các mẻ ở cùng điều kiện lên men như nhau thì hiệu suất lên men, TSS và độ chua đều có sự chênh lệch nhau rõ rệt. Điều này chứng tỏ khi lên men sử dụng bánh men Đức Ngọ gốc thì kết quả chất lượng rượu không ổn định. Đối với mẫu bột mốc ĐN01 thu được, qua 3 lần lên men cho hiệu suất lên men, TSS và độ chua ở cả 3 mẻ không chênh lệch nhau nhiều cho chất lượng rượu ổn định. So sánh hai quá trình lên men cho thấy hiệu suất lên men rượu và TSS của mẫu bột mốc ĐN 01 cao hơn hẳn, còn độ chua thấp hơn nhiều so với mẫu Đức Ngọ gốc. Qua việc đánh giá sơ bộ chất lượng rượu bột mốc ĐN01 cũng tốt hơn nhiều và quá trình lên men diễn ra đồng đều hơn. Đây chính là cơ sở rất quan trọng để từ đó phương pháp lên men rượu cải tiến có thể được áp dụng với qui mô công nghiệp, tạo ra sản phẩm rượu có chất lượng cao đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. 53 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc có khả năng đường hóa cao là: chủng Mucor (ĐN01). 2. Xác định được điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc ĐN01 là: - Thời gian nhân sinh khối: 36 giờ. - Nhiệt độ nhân sinh khối: 30°C. - Số vòng lắc nhân sinh khối: 200 vòng/phút. 3. Tỷ lệ giữa bột mốc và nguyên liệu thích hợp: 1,5g bột mốc/ 100 gạo. 4. Sau 6 ngày lên men dịch, bột mốc cho độ cồn và TSS cao hơn, độ chua thấp hơn so với bánh men Đức Ngọ gốc. Qua 3 mẻ lên men cho thấy chất lượng rượu ổn định hơn. 5.2. Kiến nghị Vì thời gian có hạn nên chưa tiến hành tối ưu hóa quy trình sản xuất rượu từ chủng nấm mốc ĐN01, chưa xác định được thời gian bảo quản bột mốc. Do đó, hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đề nghị: - Tối ưu hóa quy trình sản xuất rượu để có thể ứng dụng được vào thực tiễn sản xuất. - Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra thời hạn bảo quản của chế phẩm bột mốc. - Nghiên cứu thêm về các phương pháp bảo quản bột mốc. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: [1] Phan Văn Bản và cộng sự (2002), Nghiên cứu ổn định và nâng cao chất lượng rượu cồn từ gạo xuất khẩu, Báo cáo khoa học, mã số 86 – 01RD/HĐ – CNCL, Viện nghiên cứu bia rượu và nước giải khát. [2]. Nguyễn Văn Hiệu (1993), Nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất bánh men cổ truyền và ứng dụng trong sản xuất rượu, Báo cáo khoa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội. [3]. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh, Tập 3– Thực phẩm lên men truyền thống, NXB Đại học quốc gia, Tp.HCM. [4]. Nguyễn Thành Đạt (2004) , Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sư Phạm, tập(2) . [5]. Vũ Thị Minh Đức (1999), Thực tập vi sinh vật học, Đại học Quốc gia Hà Nội, trường Khoa học tự nhiên. [6]. Trần Liên Hà (2007) , Đại cương vi sinh vật thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật. [7]. Lương Đức Phẩm (2010), Giáo trình công nghệ lên men, NXB giáo dục Việt Nam. [8]. Vũ Nguyên Thành (2009), Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học, Bộ Công thương, Viện Công nghiệp Thực Phẩm. [9]. Nguyễn Đình Thưởng (2002), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB khoa học và kỹ thuật, Tp.HCM. [10]. Lương Đức Phẩm và Hồ Xưởng (1978), Vi sinh vật tổng hợp, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội. [11]. Lê Ngọc Tú và cộng sự (1997), Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [12]. Lê Thanh Mai (2001), Công nghệ sản xuất rượu vang và các loại rượu khác. Bộ môn Công nghệ sinh học thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội. [13]. PGS. Lê Thanh Mai cùng cộng sự (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học và kỹ thuật. [14]. ThS. Phạm Thị Thu (2013), Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại rượu truyền thống từ gạo đặc sản của Đồng bằng sông Cửu Long. 55 [15]. Lương Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp. Tái bản lần 2. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [16]. Lương Đức Phẩm (2012), Công nghệ lên men, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội. [17]. Nguyễn Lân Dũng (2002), Vi sinh vật học, NXB giáo dục, Hà Nội. [18]. Dự án Zaika (2002- 2007), Viện Công nghiệp thực phẩm, Hà Nội. [19]. Nguyễn Đức Lượng (1996), Công nghệ vi sinh vật, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. [20]. Đặng Thị Thu (1989), Nghiên cứu glucoamilaza của Endomycopis fibuliger và một vài ứng dụng. Luận án phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [21]. Nguyễn Mạnh Tuấn (1999), Nghiên cứu công nghệ sản xuất bánh men rượu từ các vi sinh vật thuần chủng phân lập tại Việt Nam, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội. [22]. TCVN 3217-1979 (1979), Rượu phân tích cảm quan phương pháp cho điểm Alcohols – Sensory analysis Points Score method, Hà Nội. [23]. TCVN 9298:2014 (2014), Vi sinh vật – Bảo quản dài hạn vi sinh vật dùng trong nông nghiệp. [24]. TCVN 378-86 Rượu trắng, phương pháp thử, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh: [21]. Julie A. R., Carolyn L. V. & Doris J. B. – Clin. Microbiol. Rev 13.2 (2000) 236 –301. [22]. A.H.Rose (1977), Alcoholic beverages, V.I, Acedamic Press, London, New York, San Francisco. [23]. Whitake, R.L. and Daniel J.R. (1984), Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, New York, pp.312 – 456. [24]. Lee C., and Anthony and Fujio Y., 199: Amylolytic activities of fungal isolates from Banh men, afermenting starter from viet nam, Annual reports of IC biotech, vol.20. International center for Biotechnology, Osaka, Japan, 155 – 162 [25]. Hesseltine C. W., Rogers R.& Winarno F. G.(1988), “ Microbiological studies on amylolytic oriental fermentation starters”, Mycopathologia 101, pp.141-155. [26]. Haard, N. F. (1999). Fermented cereals: a global perspective. Food & Agriculture Org. Vol. 138: p 63-65. 56 Phụ lục 1: Số liệu thống kê Kết quả xử lý số liệu bằng phần mềm minitab 18 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định điều kiện nhân sinh khối từ chủng nấm mốc đã tuyển chọn. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Thời gian nuôi Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Thời gian nuôi 3 CT2.1.1, CT2.1.2, CT2.1.3 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Thời gian nuôi 2 36.309 18.1544 18.58 0.003 Error 6 5.864 0.9773 Total 8 42.172 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.988562 86.10% 81.46% 68.72% Means Thời gian nuôi N Mean StDev 95% CI CT2.1.1 3 6.540 0.965 (5.143, 7.937) CT2.1.2 3 10.667 0.992 (9.270, 12.063) CT2.1.3 3 10.923 1.008 (9.527, 12.320) Pooled StDev = 0.988562 57 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Thời gian nuôi N Mean Grouping CT2.1.3 3 10.923 A CT2.1.2 3 10.667 A CT2.1.1 3 6.540 B Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Nhiệt độ nuôi Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Nhiệt độ nuôi 4 CT2.2.1, CT2.2.2, CT2.2.3, CT2.2.4 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Nhiệt độ nuôi 3 6.981 2.3269 5.80 0.021 Error 8 3.211 0.4013 Total 11 10.191 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.633496 68.50% 56.68% 29.12% Means Nhiệt độ nuôi N Mean StDev 95% CI 58 CT2.2.1 3 10.137 0.345 (9.293, 10.980) CT2.2.2 3 11.750 0.659 (10.907, 12.593) CT2.2.3 3 11.457 0.685 (10.613, 12.300) CT2.2.4 3 10.050 0.763 (9.207, 10.893) Pooled StDev = 0.633496 Tukey Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence Nhiệt độ nuôi N Mean Grouping CT2.2.2 3 11.750 A CT2.2.3 3 11.457 A B CT2.2.1 3 10.137 A B CT2.2.4 3 10.050 B Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Lượng sinh khối thu được versus Số vòng lắc Method Null hypothesis All means are equal Alternative hypothesis Not all means are equal Significance level α = 0.05 Equal variances were assumed for the analysis. Factor Information Factor Levels Values Số vòng lắc 3 CT2.3.1, CT2.3.2, CT2.3.3 Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Số vòng lắc 2 51.351 25.6753 43.85 0.000 Error 6 3.513 0.5856 Total 8 54.864 Model Summary 59 S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 0.765223 93.60% 91.46% 85.59% Means Số vòng lắc N Mean StDev 95% CI CT2.3.1 3 8.460 0.894 (7.379, 9.541) CT2.3