Dự thảo tóm tắt Luận án - Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh trên cây hồ tiêu piper nigrum l. nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng

Tuyên Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vào hồi giờ ngày tháng năm 20... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tuyến trùng ký sinh thực vật (Plant-parasitic nematodes - PPN) gây bệnh trên hàng loạt các loại rau, cây nông nghiệp, cây công nghiệp. Mỗi năm ƣớc tính gây thiệt hại trị giá hơn 157 tỷ USD trên toàn thế giới. Trong nhiều thập kỷ, việc kiểm soát tuyến trùng phụ thuộc rất nhiều vào các chất hóa học nhƣ Furadan, Marshal, Oncol, Nokap, Vimoca với hiệu quả làm giảm mật số tuyến trùng nhƣng vƣờn cây vẫn bị bệnh và phải áp dụng thuốc trong thời gian dài. Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chƣa mang lại hiệu quả cao thƣờng dẫn tới khả năng kháng thuốc, mất cân bằng giữa hệ vi sinh vật có lợi và vi sinh vật đất. Hiện nay, một số chất hóa học đang bị rút khỏi danh mục thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng vì độc tính của chúng đối với động vật và sức khỏe con ngƣời. Hiệu quả của luân canh cây trồng bị hạn chế trong một số hệ thống cây trồng do phạm vi vật chủ rộng hoặc tỷ lệ sống lâu dài của hầu hết các PPN. Hơn nữa, sự đa dạng di truyền cao trong/giữa các quần thể tuyến trùng làm hạn chế hiệu quả của các loại cây trồng kháng bệnh do tuyến trùng gây nên. Do đó, sản xuất cây trồng toàn cầu vẫn đang bị đe dọa nặng nề từ PPNs. Cùng với việc phát triển các biện pháp kiểm soát sinh học, các vi sinh vật tiêu diệt tuyến trùng nói chung và nấm sợi nói riêng đƣợc coi nhƣ một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để kiểm soát các loài gây hại tuyến trùng. Tại Việt Nam, theo quy hoạch lý thuyết, diện tích trồng cây Hồ tiêu của tỉnh Đắk Lắk đến năm 2020 đạt 15.000 ha, tuy nhiên tháng 1 năm 2017 diện tích trồng Hồ tiêu đã tăng lên tới 38.616 ha. 3 Việc tăng nhanh diện tích trồng Hồ tiêu cũng kèm theo số diện tích bị sâu, dịch hại tăng nhanh. Theo Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật, từ đầu năm 2016 đến đầu năm 2017, tỉnh Đắk Lắk có hơn 2.776 ha trồng Hồ tiêu bị sâu bệnh gây hại, chiếm 10% tổng diện tích Hồ tiêu toàn tỉnh: Trong đó, hơn 579 ha bị bệnh vàng lá chết nhanh, 1.113 ha bệnh vàng lá chết chậm, 1.083 ha bị các loại sâu bệnh khác gây hại. Diện tích trồng Hồ tiêu bị bệnh tập trung tại các huyện Buôn Đôn (515 ha), Ea H’leo (183 ha), Ea Kar (hơn 156 ha), Krông Năng (45,5 ha), thị xã Buôn Hồ (216 ha) Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan và bùng phát, Chi cục đã hƣớng dẫn ngƣời dân thực hiện nhiều biện pháp phòng trừ dịch bệnh nhƣ thƣờng xuyên thăm vƣờn để nắm bắt tình hình sinh trƣởng của cây trồng, thực hiện bón phân hợp lý, quản lý sâu bệnh hại tổng hợp IPM Ngoài ra, một số chi nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp các enzym và độc tố nhằm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp. . Những chi nấm này đƣợc sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng. Ví dụ nhƣ chế phẩm sinh học Biocon có thành phần chính là nấm Paecilomyces lilacinus, đây là loài có khả năng ký sinh, tiêu diệt tuyến trùng và trứng của chúng. Nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết để tìm kiếm các chủng nấm sợi đối kháng cao với nấm diệt tuyến trùng hại Hồ tiêu vừa thân thiện với môi trƣờng vừa tăng hiệu quả để kiểm soát bệnh gây ra bởi tuyến trùng, đề tài đƣợc tiến hành với tiêu đề nhƣ sau: “Nghiên cứu vi nấm kháng bệnh trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng” 4 2. Mục tiêu của đề tài  Tuyển chọn đƣợc một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. và tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng năng suất cây Hồ tiêu tối thiểu là 15%.  Tạo đƣợc chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 3 lần so với chủng tự nhiên. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Trong ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng phân lập đƣợc trên đất trồng Hồ tiêu, Paecilomyces lilacinus P1 (hay còn gọi là Purpureocillium lilacinum) là chủng đƣợc quan tâm nghiên cứu bởi hoạt lực diệt tuyến trùng cao và tính an toàn của chủng. Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô hình tại tỉnh Đăk Lăk đã có tác dụng điều hòa tăng năng suất lên 20% đối với vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh; 48% đối với vƣờn Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng nhất. Chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng sẽ góp phần bảo vệ môi trƣờng và phát triển bền vững ngành sản xuất Hồ tiêu ở nƣớc ta. Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự nhiên trong vòng 48 giờ. Sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ mở ra những triển vọng về nghiên cứu vai trò, chức năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces. 4. Những đóng góp mới của luận án +) Tuyển chọn đƣợc 1 chủng vi nấm bản địa từ đất trồng Hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk có hoạt lực diệt tuyến trùng cao, an toàn với con ngƣời. 5 +) Chế phẩm sinh học đƣợc thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô hình, đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm tăng lên 20% đối với những vƣờn Hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh, 48% so với vƣờn Hồ tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng nhất. +) Lần đầu tiên đã xây dựng quy trình chuyển gen bằng phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dựa trên cơ chế trợ dƣỡng uridine/uracil đạt hiệu quả cao gấp 10 lần so với nghiên cứu trƣớc đây. 5. Bố cục của luận án Bố cục của luận án gồm 132 trang, 18 bảng và 32 hình. Cụ thể: Mở đầu 3 trang; Chƣơng 1 Tổng quan tài liệu 39 trang; Chƣơng 2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 25 trang; Chƣơng 3 Kết quả và thảo luận 48 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình 1 trang; Tài liệu tham khảo 19 trang. Chƣơng 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ TUYẾN TRÙNG VÀ BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. 1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, tính đến tháng 10 năm 2016, bệnh gây ra bởi tuyến trùng chủ yếu là bệnh chết chậm và bệnh vàng lá. Diện tích cây bị bệnh tập trung ở một số địa phƣơng nhƣ Quảng Trị, Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc,...lên đến hàng ngàn ha. Theo báo cáo của 3 tỉnh trọng điểm trồng cây Hồ tiêu của Tây Nguyên là Đăk Lăk, Gia Lai và Đắk Nông, hàng năm, mỗi tỉnh đều có vài ngàn ha tiêu bị nhiễm bệnh 6 vàng lá, tuyến trùng sần rễ Tỉnh Gia Lai năm 2016 đã có trên 6.155 ha Hồ tiêu bị nhiễm bệnh làm thiệt hại cho các gia đình trồng Hồ tiêu cả ngàn tỷ đồng. 1.1.2. Giới thiệu về tuyến trùng Meloidogyne sp. Tuyến trùng gây hại thực vật thuộc nhóm động vật không xƣơng sống, có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật gây hại nhiều nhất đối với nền nông nghiệp trên toàn thế giới. Trên cây Hồ tiêu, tuyến trùng Meloidogyne gây ra bệnh sần rễ, vàng lá, chết chậm. Tuyến trùng ký sinh trên tất cả các bộ phận của cây, nhƣng vùng rễ là nơi tuyến trùng tập trung nhiều nhất. Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn thƣơng, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá và gây chết. Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2); ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trƣởng thành với con cái và con đực. Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp. Hiện nay, nông dân thƣờng xử lý khi cây đã chớm biểu hiện bệnh khi đó tuyến trùng đã xâm nhập và mức độ bệnh đã nặng nên rất khó chữa trị hoặc mất nhiều thời gian và cây phục hồi cho năng suất thấp. Có một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng nhƣ: Tuyển chọn ngay từ khâu chọn giống: chọn cây khỏe, có khả năng kháng bệnh (i) Vật lý: Đa số tuyến trùng không sống đƣợc ở nhiệt độ 60oC; vì vậy biện pháp xử lý nhiệt sẽ triệt để nhƣng chi phí cao và thời gian dài (ii) Hóa học: Biện pháp này cho hiệu quả cao nhƣng gây ô nhiễm 7 môi trƣờng, độc hại đối với ngƣời và động vật; (iii) Sinh học: mang lại hiệu quả lâu dài hƣớng tới môi trƣờng phát triển bền vững. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG Nấm diệt tuyến trùng là loại vi sinh vật có thể bắt, tiêu diệt và tiêu hóa tuyến trùng. Có hơn 200 loài nấm sợi đƣợc biết đến khác nhau về khả năng hoại sinh/ký sinh tuyến trùng. Các chi nấm này đều có khả năng diệt tuyến trùng từ dạng trƣởng thành, dạng ấu trùng và trứng, đồng thời sử dụng tuyến trùng làm chất dinh dƣỡng. Nhiều loại nấm diệt tuyến trùng hình thành bẫy và ký sinh trứng tuyến trùng có thể tồn tại trong đất ở dạng hoại sinh nhƣng loại nội ký sinh thì sử dụng tuyến trùng là chất dinh dƣỡng (ký sinh bắt buộc). Hình 1.1 biểu diễn sơ đồ khái quát hóa sự tƣơng tác giữa nấm sợi (vi khuẩn) tiêu diệt tuyến trùng với tuyến trùng, các phƣơng thức dẫn dụ và diệt tuyến trùng. Hình 1.1. Sự tƣơng tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn 1.2.1. Vai trò kiểm soát sinh học của nấm diệt tuyến trùng Kiểm soát sinh học theo Cook và cs., (1993) là việc con ngƣời sử dụng các vi sinh vật đối kháng không gây bệnh để ức chế mầm gây bệnh theo cách thân thiện với môi trƣờng. Dựa trên các cơ chế và tác dụng, các sản phẩm từ chủng này có thể đƣợc sử dụng làm phân bón sinh học, làm chất tăng cƣờng thực vật và làm thuốc trừ sâu sinh học. Theo nghiên cứu của Wu và cs., (2015), thị trƣờng toàn cầu về thuốc trừ sâu sinh học sẽ tăng lên tới 83,7 tỷ USD vào năm 2019. 1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng Các nhà khoa học đã phân loại nhóm nấm diệt tuyến trùng dựa trên kiểu tấn công con mồi và do đó chia thành năm nhóm: (1) 8 bẫy/bẫy động vật, (2) nấm diệt tuyến trùng “ăn thịt”, (3) nội ký sinh, (4) nấm sản xuất độc tố, (5) nấm sử dụng các thiết bị tấn công đặc biệt. 1.2.2.1. Nấm bẫy tuyến trùng Hầu hết các loại nấm bẫy tuyến trùng đƣợc công bố đều thuộc Ascomycota. Những loại nấm này có thể sống hoại sinh trong đất. Tuy nhiên, với sự có mặt của tuyến trùng, những loài nấm này trở thành kẻ săn mồi thông qua việc sản xuất các bẫy cụ thể, bao gồm các vòng, núm dính, mạng dính, cột dính. 1.2.2.2. Nấm ký sinh tuyến trùng Chính vì khả năng hoại sinh hạn chế của chúng trong đất làm cho nấm nội ký sinh sử dụng tƣơng đối hẹp trong các ứng dụng kiểm soát sinh học. Trong số các loại nấm nội ký sinh, Drechmeria coniospora đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. 1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng Giới thiệu về Paecilomyces sp.:Các loài thuộc chi Paecilomyces là nấm sợi xuất hiện trong môi trƣờng đất khá phổ biến. Với cơ chế là ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng đồng thời sản sinh ra các enzym nhƣ chitinase, protease có khả năng phân hủy lớp kitin bên ngoài của ấu trùng và ức chế nở trứng. Các công bố cho thấy chitinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình diệt tuyến trùng, protease và các enzym khác có vai trò hỗ trợ chitinase nhằm thúc đẩy nhanh quá trình diệt. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua đã cho thấy sợi nấm xâm nhập trực tiếp vào lớp biểu bì của trứng, ấu trùng của M. javanica. 9 Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng Vào những năm 1980, lần đầu tiên các nghiên cứu nhằm sàng lọc các chủng nấm diệt tuyến trùng trong đất đã chứng minh đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt tính chitinase của nấm diệt tuyến trùng nhƣ Pochonia sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp. Theo Yang và cs., (2007), nhiều loài nấm diệt tuyến trùng nhƣ Pochonia sp., Arthrobotrys sp., Paecilomyces sp. đƣợc coi nhƣ các tác nhân sinh học diệt tuyến trùng. Dackman và cs., (1989) đã công bố hai loài thuộc chi Verticillium có khả năng diệt Heterodera schachtii nhờ hoạt tính chitinase và protease của chi nấm này. Protease từ nấm diệt tuyến trùng Cho đến nay, hơn 20 protease serine đã đƣợc tinh sạch hoặc xác định trọng lƣợng phân tử từ các loại nấm diệt tuyến trùng khác nhau. Các nghiên cứu cơ chế tiêu diệt tuyến trùng đã chỉ ra rằng các protease này có thể làm suy giảm hiệu quả các lớp biểu bì tuyến trùng. Do đó, chúng còn đƣợc gọi là protease phân hủy tuyến trùng. Các cấu trúc tinh thể của hai protease phân hủy lớp biểu bì, Ver112 (tìm thấy từ Lecanicillium psalliotae) và PL646 (tìm thấy từ Paecilomyces lilacinus), cho các cấu trúc khác nhau dẫn tới chức năng của chúng khác nhau. 1.3. CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG 1.3.1. Các phƣơng pháp chuyển gen Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học đang sử dụng các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi nhƣ chuyển gen bằng tế bào trần, chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mỗi phƣơng pháp chuyển gen đều có 10 những ƣu nhƣợc điểm riêng tuy nhiên tùy thuộc vào từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phƣơng pháp. 1.3.2. Một số gen chỉ thị dùng cho chuyển gen ở nấm Gen chỉ thị đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả chuyển gen vào chủng đƣợc chuyển hoặc để sàng lọc các thể chuyển gen. Chuyển các gen chỉ thị vào chủng cần nghiên cứu nhằm tạo ra các chủng có kiểu hình khác với chủng tự nhiên (WT). Các gen chỉ thị giúp các nghiên cứu dễ dàng hơn trong việc nhận biết thể chuyển gen dƣới kính hiển vi điện tử mà không làm thay đổi hoạt tính sinh lý, sinh hóa của chủng. Một số gen chỉ thị thƣờng dùng là DsRed, GFP, GUS, lacZ 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình chuyển gen Quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua A. tumefaciens là phƣơng pháp đƣợc áp dụng phổ biến bởi tính ổn định và chi phí thấp. Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: (1) Agrobacter tumefaciens; (2) Thời gian, cấu trúc màng đồng nuôi cấy quyết định thành công hay thất bại của quá trình chuyển gen (3) Vật liệu chuyển gen (4) Nồng độ chất cảm ứng. 1.3.4. Một số nghiên cứu cải biến di truyền đối với nấm diệt tuyến trùng Một cách để cải thiện khả năng kiểm soát sinh học của nấm diệt tuyến trùng là sử dụng kỹ thuật di truyền để tăng khả năng gây bệnh và khả năng sống sót của loại nấm diệt tuyến trùng. Nhờ đột biến gen xảy ra với nấm diệt tuyến trùng A. oligospora, gen PII - mã hóa protease serine (phân hủy lớp biểu bì tuyến trùng) đã đƣợc biểu hiện quá mức ở A. oligospora. Ahman và cs., (2002) đã nghiên cứu 11 gen PII của Arthrobotrys oligospora và nhận thấy nếu xóa gen PII do tái tổ hợp tƣơng đồng có ảnh hƣởng đến khả năng diệt tuyến trùng của nấm này. Đồng thời, nếu biểu hiện quá mức PII thì nhận thấy tốc độ diệt tuyến trùng tăng hơn so với chủng dại. 1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM Hiện nay, có một số khó khăn liên quan đến các ứng dụng kiểm soát sinh học, bao gồm hiệu quả tƣơng đối thấp và sự không thống nhất trong môi trƣờng nông lâm nghiệp. Một số biện pháp sử dụng nhằm kiểm soát bệnh tuyến trùng cây Hồ tiêu tại Việt Nam Một trong những vấn đề lớn thƣờng gặp đối với đa số hộ trồng Hồ tiêu là sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật và tự ý tăng liều lƣợng. Mục đích của ngƣời trồng Hồ tiêu là mong muốn tăng cao năng suất nhƣng họ lại không quan tâm đến chất lƣợng sản phẩm. Đây cũng chính là nguyên nhân khiến cho tình trạng hồ tiêu thành phẩm của nƣớc ta xuất khẩu ra thị trƣờng quốc tế có tồn dƣ chất bảo vệ thực vật vƣợt quá giới hạn cho phép. Mặc dù tiềm năng kiểm soát sinh học bệnh tuyến trùng của chi Paecilomyces là rất lớn nhƣng việc nghiên cứu sử dụng chi này ở Việt Nam còn nhiều hạn chế. Các nghiên cứu gần đây nhƣ đã đề cập ở trên cho thấy hiệu quả diệt tuyến trùng ở cây Hồ tiêu của chế phẩm chƣa cao, vì vậy việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học nhằm tiêu diệt tuyến trùng là rất cần thiết. Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1.VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: 15 mẫu đất thu thập tại vùng trồng Hồ tiêu khu vực tỉnh Đăk Lăk, E.coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens AGL1; Tuyến trùng Meloidogyne sp; Cây Hồ tiêu: 3,5 tháng tuổi; Vƣờn Hồ tiêu thời kỳ kinh doanh (từ 5 – 7 năm tuổi) thuộc xã Eabar, huyện Buôn Đôn, tỉnh Đăk Lăk. 2.1.2. Hóa chất Hygromycin B; Phleomycin; Nourseothricin; Geneticin (G418); Kanamycin; Ampilixilin; Cefotaxime; Acetosyringone AS (Merck); kít tinh sạch DNA (Thermo, Pro MEGA, Intron); enzym Phusion®; pJET 1.2/blunt – Cat. Nos. K1231 (Thermo); Casein (Merck); chitin (Biobasic); CMA (Merck); PDA, 5 – fluoroorotic acid (5-FOA), Uridine,Uracil (Merck). 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị sinh học phân tử thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Phòng Công nghệ lên men, Phòng Công nghệ sinh học enzyme/Viện Công nghệ sinh học. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập và quan sát hình thái 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu enzyme/protein Phƣơng pháp xác định hoạt tính chitinase bằng phản ứng màu với DNSA theo Miller 1959; Xác định hoạt tính protease đƣợc xác định theo phƣơng pháp Anson cải tiến. 2.2.3. Phƣơng pháp điện di trên Gel polyacrylamid (SDS-PAGE) theo Laemmli U.K., (1970); Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein tổng số theo Bradford. 2.2.4. Tách chiết DNA hệ gen và PCR các đoạn DNA 13 2.2.5. Phản ứng nối ghép gen (Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR (50-100 ng/µl) 2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli DH5α 2.2.7. Tách DNA plasmid 2.2.8. Đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5 – FOA của chủng Paecilomyces lilacinus P1 2.2.9. Phƣơng pháp thu bào tử và hệ sợi nấm P. lilacinus P1 2.2.10. Phƣơng pháp tạo chủng đột biến gen pyrG bằng UV sử dụng môi trƣờng chọn lọc 5-fluoroorotic acid (5-FOA) từ chủng P1 2.2.11. Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi bằng Agrobacterium tumefaciens AGL1 2.2.3. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase của P. lilacinus P1 2.2.4. Các phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG 3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi Từ 15 mẫu đất và rễ quanh cây Hồ tiêu thu thập tại Đăk Lăk. Mẫu đƣợc pha loãng và đƣợc cấy gạt trên môi trƣờng CDA. Qua tổng quan tài liệu, dựa trên hình thái, màu sắc khuẩn lạc, cấu trúc sinh bào tử, các chủng nấm sợi phân lập đƣợc sàng lọc định hƣớng tới chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng. Bảng 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi Bảng 3.2. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. 14 ST Tên chủng Tỉ lệ tuyến trùng chết (%) T 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 0 Đối chứng 1 - - - - - (nƣớc cất) 1 ĐC 2 (CD - - - ± ± dịch thể) 2 P1 - 10,81± 30,7 ± 58,5 ± 58,5 ± 0,75 2,71 2,39 2,41 3 NV01 - 2,31 ± 15,6 ± 50,4 ± 50.4 ± 0,24 1,82 2,84 2,97 4 NV20 - 20,80 ± 40,17 ± 55,23 ± 55,23 2,51 3,28 4,12 ± 3,96 Ghi chú: ( ± ): chết rất ít, không đáng kể, (-): chết Bảng 3.2 cho thấy, trong thời gian thử nghiệm đến 96 giờ, tuyến trùng cho tỷ lệ chết cao nhất đến 58% đối với P1; 55,23% đối với NV20; 50,4% đối với NV01. Trong khoảng thời gian 72 - 96 giờ lƣợng trứng nở và ấu trùng sống sót bắt đầu giảm nhiều, có thể là tại thời điểm này các enzym phân hủy cùng với các độc tố bắt đầu đƣợc sản sinh nhiều hơn nên đã có tác động đến khả năng tồn tại và phát triển quần thể của tuyến trùng so với mẫu đối chứng. Sau 96 giờ trở đi, lƣợng trứng và ấu trùng sống sót thay đổi không đáng kể, có thể do lƣợng enzym ủ lâu đã mất đi một phần hoạt tính. Nhƣ vậy, cả ba chủng nấm đƣa vào khảo sát đều có khả năng diệt tuyến trùng. Ở Việt Nam hiện nay các công bố về sử dụng chế phẩm bào tử nấm để diệt tuyến trùng còn hạn chế. Tuy nhiên, đây là 15 bƣớc đầu thử nghiệm và khẳng định tính hiệu quả trong các nghiên cứu về chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng. 3.1.2. Định danh các chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 bằng trình tự ITS1/ITS4 Các chủng P1, NV01, NV20 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng CD dịch thể trong thời gian từ 3 -5 ngày; nhiệt độ nuôi cấy 28oC ± 2oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Hệ sợi nấm đƣợc thu để phục vụ tách chiết DNA hệ gen. Chủng NV20 có mức độ tƣơng đồng về trình tự ITS với chủng Pleurotus giganteus (KT956125) là 99%, do vậy đƣợc gọi là Plerotus giganteus NV20. P1 có mức độ tƣơng đồng về trình tự ITS với chủng Paecilomyces lilacinus KY549673.1 là 99%. NV01 thuộc loài P. variotii và đƣợc đặt tên là P. variotii NV01. 3.1.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào của chủng P. variotii NV01 và P. lilacinus P1 Kết quả cho thấy, hoạt độ chitinase và protease của P1 đều cao hơn so với NV01 trong cùng điều kiện nuôi cấy. Cụ thể hoạt độ chitinase lần lƣợt là 61,7 U/ml và 37,7 U/ml. Hoạt độ chitinase của chủng P1 gấp 3 lần so với nghiên cứu của Homthong và cs., (2016) khi nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trƣờng cơ bản. 3.2.1. Tinh sạch chitinase từ chủng P1 Bảng 3.3. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng P. lilacinus P1 Bƣớc tinh sạch HL HT tổng Hoạt độ Độ sạch Hiệu pr.TS số (U) riêng (lần) suất (ml) (U/ml) (%) Enzym thô 0,76 47,6 62,63 1,0 100 (NH4)2SO4 0,065 5,53 85,08 1,35 11,6 DEAE- 0,006 0,8 133,3 2,1 1,68 16 Sephadex A-50 3.2.2. Tính an toàn của chủng P. lilacinus P1 Theo một số công trình nghiên cứu, P. lilacinus là chủng an toàn đối với con ngƣời. P. lilacinus cho thấy không có độc tính hoặc khả năng gây bệnh khi thử nghiệm trên động vật gặm nhấm và các động vật không xƣơng sống khác nhau. P. lilacinus không tồn tại ở nhiệt độ cơ thể con ngƣời. 3.4.1. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên men Ở nồng độ cơ chất 0,75% hoạt tính chitinase cao hơn cả cụ thể gấp 2,7 lần so với không bổ sung cơ chất (70,3 U/ml so với 25,8 U/ml); gấp 1,8 lần so với nồng độ chitin là 0,1%. Điều đó chứng tỏ rằng, khi không có hoặc nồng độ chitin quá thấp thì lƣợng cơ chất này không đủ để chủng P1 vừa sinh trƣởng vừa tổng hợp chitinase. Khi tăng nồng độ cơ chất thì hoạt tính chitinase tăng lên rõ rệt, tuy nhiên khi tăng đến 1,5% thì hoạt tính chitinase lại giảm, điều này cho thấy khi tăng nồng độ cơ chất vào môi trƣờng quá cao, thì pha tăng trƣởng của nấm sợi có thể kéo dài hơn, sản phẩm cuối và thứ cấp sẽ tích tụ nhiều hơn gây ức chế sự tổng hợp chitinase, nồng độ chitinase 0,75% là thích hợp cho chủng P1 sinh chitinase cao và sử dụng nồng độ này cho nghiên cứu kế tiếp. 3.1.7.2. Ảnh hưởng của nguồn các bon Glucose cho hoạt tính chitinase cao nhất trong các nguồn khảo sát 58,2 đến 62,7 U/ml. Do đó, glucose đƣợc chọn nguồn carbon trong quá trình sinh tổng hợp chitinase. 3.1.7.3. Ảnh hƣởng của nguồn ni tơ Giống nhƣ carbon, việc lựa chọn nguồn nitơ và nồng độ của nó trong môi trƣờng cũng đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất 17 chất chuyển hóa. Bởi vì, chủng P1 này có thể sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và / hoặc hữu cơ. Trong nghiên cứu này, ảnh hƣởng của một số nguồn nitơ nhƣ pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3 ở nồng độ 0,5% đã đƣợc nghiên cứu. Kết quả nhận thấy pepton cho hoạt tính chitinase cao nhất, nguồn nitơ vô cơ cho hoạt tính thấp hơn; kết quả này cũng trùng với các công bố của Farag A., (2014), Dhar P., (2010), Jha S., (2016) 3.1.7.4. Phân tích ý nghĩa của mô hình với thí nghiệm Sử dụng phƣơng án đáp ứng bề mặt – phƣơng pháp cấu trúc có tâm nhằm tìm kiếm sự kết hợp tối ƣu của các thành phần này trong môi trƣờng nuôi cấy. Giới hạn nồng độ phù hợp của các yếu tố đã đƣợc xác định sơ bộ. Nhƣ vậy năm yếu tố với tổng số 63 thí nghiệm đƣợc tiến hành. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Hình 3.19. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chitinase của chủng P. lilacinus P1 3.1.7.5. Đánh giá tính thực tế của mô hình Môi trƣờng CHY3 (chitin cơ chất: 0,75%, glucose 1,93%, 2+ 2+ pepton 0,33%, K2HPO4 0,1%, Ca /Mg : 3:4) đã đƣợc chọn làm môi 18 trƣờng thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp chitinase chủng P1: cụ thể là hoạt tính chitinase tăng lên 17% so với khi chƣa tối ƣu; đồng thời gấp 3,5 lần so với nghiên cứu của Homthong và cs., (2016). 3.2. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG 3.2.1. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh cây Hồ tiêu Chế phẩm dạng dịch thể của chủng P1 đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 20oC – 30oC và đƣợc kiểm tra mật độ sau các khoảng thời gian bảo quản: 10 ngày, 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng. 3.2.2. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại Hồ tiêu trong điều kiện nhà lƣới của chế phẩm sinh học Tại các thời điểm kiểm tra sau xử lý, mật độ tuyến trùng trong các chậu đối chứng có tăng thêm từ 4,7% đến 9,9%. Trong các chậu thí nghiệm mật độ tuyến trùng còn sống giảm xuống còn 56- 82% do tác động của chế phẩm. Hiệu lực diệt tuyến trùng dao động trong khoảng 20-53%. Xét về hiệu lực diệt tuyến trùng ở các mức pha loãng 50 và 100 lần gần giống nhau, còn ở mức 150 và 200 lần hiệu lực giảm hẳn, nên chọn mức pha loãng chế phẩm 100 lần. 3.2.3. Đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm Chế phẩm sinh học có tác dụng điều hòa tăng năng suất tới trên 20%. Các vƣờn chớm bị bệnh vàng lá, năng suất cả bên đối chứng và mô hình đều giảm nhiều so với vƣờn không bị vàng lá, nhƣng do vƣờn mô hình có sử dụng chế phẩm nên hạn chế đƣợc 19 tuyến trùng và nấm gây bệnh do đó năng suất tăng hơn nhiều so với đối chứng, tới trên 30%. 3.3. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG P. lilacinus P1 Khả năng diệt tuyến trùng cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp enzym hoặc các chất có hoạt tính sinh học ở chủng P. lilacinus tự nhiên là có hạn. Việc tăng cƣờng khả năng diệt tuyến trùng hay sinh enzym có thể thực hiện thông qua việc cải biến di truyền. Trong nghiên cứu này, hệ thống chuyển gen vào chủng P1 bƣớc đầu đƣợc xây dựng nhằm tạo ra một công cụ hữu hiệu hơn để thực hiện việc cải biến di truyền. Chủng P1 kháng với cả 4 loại kháng sinh là phleomycin; nourseothricin; hygromycin; geneticin (G418) với nồng độ kháng sinh từ 600 – 1000 µg/ml. Tuy nhiên, đối với 5-FOA chủng P1 không sinh trƣởng đƣợc trên tất cả các nồng độ thử nghiệm. Điều đó đƣợc giải thích rằng gen PyrG mã hóa cho enzym decarboxylase orotidine-5’-monophotphate (OMP) xúc tác cho quá trình tổng hợp pyrimidin tác dụng với 5-FOA (khi có mặt 5 – FOA) không độc thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil dẫn tới tế bào chết. 3.3.2. Tạo chủng nấm P. lilacinus đột biến kháng 5-FOA và trợ dƣỡng uracil/uridine 3.3.2.1. Gây đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uracil/uridine bằng phương pháp chiếu UV Từ kết quả đánh giá khả năng kháng kháng sinh và 5-FOA của chủng P1, môi trƣờng chứa 5-FOA, uracil, uridine đƣợc sử dụng để chọn lọc thu nhận các thể đột biến kháng 5-FOA và trợ dƣỡng uracil và uridine. Phƣơng pháp chiếu UV đã đƣợc áp dụng để tạo ra 20 một số đột biến trong phòng thí nghiệm. Tác nhân gây đột biến là UV đƣợc tiến hành trên máy cố định gen Vilber Lourmat. Những khuẩn lạc sống sót đƣợc chọn lọc qua 5 thế hệ cấy chuyền liên tiếp trên môi trƣờng CDA + 5- FOA + uracil + uridine. 3.3.2.2. Xác nhận thể đột biến 424 bằng giải trình tự vùng ORF gen PyrG Từ những vị trí đột biến nucleotid, sự sai khác của 3 aminoaxit trong vùng ORF gen pyrG đƣợc phát hiện, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino axit Vị trí Nucleotide Amino axit biến đổi 205 (WT) T C L S (Leucine – Serine) 251 (WT) T G S R (Serine – Arginin) 795 (WT) T A Thêm R (Arginin) 3.3.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu vào thể đột biến 424 pyrG(-) Cải biến di truyền ở chủng P1 bằng phƣơng pháp chuyển gen ATMT sử dụng marker trợ dƣỡng là một bƣớc tiến vƣợt trội đồng thời thí nghiệm đã chuyển gen thành công gen DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 với các thông số tối ƣu là nồng độ uridine bổ sung cho môi trƣờng IM đồng nuôi cấy là 0,005%; nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml; nhiệt độ đồng nuôi cấy là 22oC; nồng độ AS cho giai đoạn cảm ứng là 200 µM AS; thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ. 3.3.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen Kết quả cho thấy gen huỳnh quang DsRed đã biểu hiện thành công vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 và điều này sẽ mở ra 21 triển vọng mới cho nghiên cứu về cơ chế diệt tuyến trùng, biểu hiện protein, enzym tái tổ hợp cũng nhƣ sản xuất các chất có hoạt tính sinh học của chi nấm tiềm năng này. 3.3.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease và khả năng diệt tuyến trùng cao Hình 3.23. Tỷ lệ chết của tuyến trùng A. Hình ảnh tuyến trùng sống B. Hình ảnh tuyến trùng chết C. Đồ thị tỷ lệ chết của tuyến trùng. (Ghi chú: hình A, B đƣợc chụp trên KHV Olympus CX 41 độ phóng đại 150x) Kết quả thử nghiệm cho thấy trong vòng 48 giờ, dịch nuôi cấy PE858 cho tỷ lệ tuyến trùng Meloidogyne sp. bị chết lên đến 72%, trong đó chủng tự nhiên (P1) cho tỷ lệ chết 11%. Điều đó chứng tỏ hoạt tính chitinase cao ảnh hƣởng đáng kể đến tốc độ diệt tuyến trùng. Việc cải biến di truyền tạo các thể đột biến cho khả năng diệt tuyến trùng cao ở chủng P1 mở ra hƣớng nghiên cứu mới nhằm điều tra vai trò, chức năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng cũng nhƣ các gen tham gia vào quá trình trao đổi chất của chủng nấm sợi tiềm năng này. 22 KẾT LUẬN 1. Đã tuyển chọn đƣợc ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng - Từ 15 mẫu đất bản địa khu vực trồng Hồ tiêu tỉnh ĐăkLăk đã phân lập đƣợc ba chủng nấm sợi và đƣợc định danh là Paecilomyces lilacinus P1; Paecilomyc