Dự thảo tóm tắt Luận án - Nghiên cứu sự thay đổi của gen ahr và aip ở các nạn nhân nhiễm dioxin

bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Đại học Quốc gia họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi..ngàytháng...năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm Thông tin Thư viện - ĐHQGHN MỞ ĐẦU Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể tiếp nhận dioxin và nhiều chất ô nhiễm môi trường khác. Khi AhR được hoạt hóa bởi phối tử, dẫn đến điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cơ thể. Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi nhiễm với các chất độc trong môi trường như nhau, nhưng lại chịu ảnh hưởng cũng như có nguy cơ với ung thư là khác nhau. Điều này có liên quan đến đa hình gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein). Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và AIP chủ yếu trên người không phơi nhiễm dioxin. Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về gen trên đối tượng phơi nhiễm dioxin.Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng như đa hình/đột biến trên toàn bộ exon gen AhR ở người phơi nhiễm có nồng độ dioxin trong máu cao. Ảnh hưởng tác động của dioxin cũng như các chất ô nhiễm môi trường qua con đường tín hiệu AhR vẫn được coi là phức tạp, chưa được biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau. Hiện nay cũng chưa có dữ liệu đầy đủ về các gen chịu ảnh hưởng của tác động dioxin. Xuất phát từ thực tễ trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân nhiễm dioxin”nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến các gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và người có nồng độ dioxin trong máu cao; (2) Tìm hiểu mối liên hệ giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó có các bệnh liên quan đến dioxin; (3) Bước đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên quan đến chuyển hóa dioxin. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN 1.1.1. Khái niệm dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin Thuật ngữ “Dioxin” thường được sử dụng để nói đến 2 nhóm chất là policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) và policlodibenzofuran (PCDF). Trong các chất dioxin có 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-p- dioxin (TCDD) là chất độc nhất. 1.1.2. Đặc tính của dioxin Dioxin có độ bền vững cao. Thời gian bán hủy trong cơ thể người là từ 5-12 năm. Khoảng 90% dioxin hấp thụ vào cơ thể qua con đường ăn uống. 1.1.3. Ảnh hƣởng của dioxin đối với sức khỏe con ngƣời Dioxin gây tổn thương đa dạng và phức tạp, làm phát sinh nhiều bệnh lý ở các cơ quan khác nhau. Dioxin không chỉ gây tổn hại tới sức khỏe của người bị phơi nhiễm mà còn gây ảnh hưởng tới con cái họ ở những thế hệ kế tiếp trong tương lai. 1.1.4. Một số phƣơng pháp định lƣợng dioxin 1.1.3.1. Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ độ phân giải cao, 1.1.3.2. Phương pháp DR CALUX 1.2. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN 1.2.1. Thụ thể Aryl hydrocarbon receptor (AhR) 1.2.1.1. Cấu trúc của thụ thể AhR Thụ thể AhR - thụ thể của dioxin được hoạt hóa bởi các phối tử (ligand). Phối tử điển hình của AhR là TCDD. AhR là một thành viên của họ protein thuộc nhân tố điều hòa phiên mã (transcription factor), có cấu trúc basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim 1 (bHLH/PAS). AhR có các vùng cấu trúc đảm nhiệm các chức năng: liên kết với phối tử, liên kết với DNA của gen đích, liên kết các protein thành phần và chức năng hoạt hóa phiên mã. 1.2.1.2. Vai trò của protein AhR trong cơ thể AhR là yếu tố điều hòa biểu hiện các gen tham gia đảm nhiệm các chức năng sinh lý quan trọng của cơ thể. AhR tham gia biệt hóa nhiều loại tế bào trong giai đoạn sớm của quá trình phát triển cá thể (Li Y, 2011; Gargaro, 2016). AhR đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng nội môi trong tế bào. Khi cơ thể tích tụ dioxin có thể chứa protein AhR được hoạt hóa lâu dài, thường xuyên, dẫn đến trạng thái ức chế miễn dịch thường xuyên và liên tục (Ridolfi, 2010). 1.2.1.3. Vai trò protein AhR đối với bệnh ung thư Thông qua thụ thể AhR, dioxin ảnh hưởng lên các giai đoạn của ung thư. Mức độ biểu hiện cao của AhR có liên quan lớn với sự tiến triển ung thư cũng như với tỷ lệ mắc ung thư (Dietrich, 2010; Safe, 2013). Ngoài ra, AhR đóng vai trò quan trọng trong giảm kết dính tế bào dẫn đến gia tăng sự xâm lần mô và di căn của tế bào ung thư. Mặt khác, AhR có thể hoạt động như một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) và gen trở nên không hoạt động trong quá trình hình thành khối u ở một số điều kiện nhất định (Fan Y, 2010). 1.2.2. Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR 1.2.2.1. Con đường tín hiệu cổ điển (canocial signaling pathway) Trong điều kiện không có phối tử, AhR trong tế bào chất, liên kết với các protein thành phần như: AIP (aryl hydrocarbon receptor interacting protein), p23 và 2 phân tử HSP90 (90-kDa heat shock 2 protein). Khi dioxin khuếch tán qua màng tế bào vào liên kết với AhR, phức hệ AhR được hoạt hóa, thay đổi cấu hình và vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân, AhR được giải phóng khỏi hệ thống phức hợp các protein thành phần và tương tác với nhân tố dẫn truyền nhân ARNT (AHR nuclear translocator-ARNT). Phức hệ AHR/ARNT sau đó liên kết với vị trí DNA đặc biệt trên gen đích, gọi là yếu tố đáp ứng với các chất lạ (xenobiotic respone element, XRE) hay yếu tố đáp ứng dioxin (dioxin response element, DRE), qua đó điều hòa biểu hiện các gen đích (Quintuna, 2013; Wright, 2017). 1.2.2.2. Con đường tín hiệu phi cổ điển (non-canocial signaling pathway) AhR còn điều hòa phiên mã gen đích thông qua con đường khác không liên quan đến trình tự đáp dioxin (DRE) trên gen đích, mà qua vị trí DRE (non-consensus DRE, NC - DRE) trên vùng promoter của gen đích. Để liên kết được với trình tự này, AHR cần kết hợp một protein Kruppel-like Factor 6 (KLF6) và có sự đồng tham gia của protein carbamoyl phosphate synthase 1 (CPS1) (Wright, 2017). 1.2.3. Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền Dioxin là tác nhân môi trường gây tổn thương vật chất di truyền và phát sinh đột biến gen thông qua hình thành các gốc tự do chứa oxy hoạt động (reactive oxygen species, ROS) (Mates, 2010; Franken, 2017). 1.3. TỔNG QUAN VỀ GEN AHR 1.3.1. Đặc điểm gen AhR ở ngƣời Gen AHR ở người có kích thước khoảng 50 kb, nằm trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 7 (7p21.1), gồm 11 exon và 10 intron, mã hóa protein AhR có 848 acid amin. 3 1.3.2. Vai trò của đa hình gen AhR trong chuyển hóa dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng Đa hình gen AHR thúc đẩy hoặc kìm hãm hoạt động của thụ thể AhR. Đa hình gen AHR có thể điều chỉnh đáp ứng của cơ thể đối với các nhân tố gây tổn hại gen có trong môi trường sống (Ridolf, 2014). Mặc dù ô nhiễm môi trường và dioxin làm gia tăng nghiêm trọng tỷ lệ ung thư, vẫn có nhiều cư dân sống trong vùng ô nhiễm lại không mắc ung thư hay các bệnh liên quan đến dioxin. Điều này được giải thích dựa trên cơ sở ái lực liên kết giữa dioxin với receptor AHR. Các cá thể khác nhau trong nhạy cảm với dioxin có thể là do các đa hình gen AHR mã hóa các receptor có ái lực khác nhau với TCDD (Ridolf, 2014; Kovalova 2016). 1.4. TỔNG QUAN VỀ GEN AIP 1.4.1. Đặc điểm gen AIP Gen AIP nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) có 6 exon mã hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lượng phân tử là 37 kDa. 1.4.2. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở ngƣời Các thể đột biến protein AIP mất khả năng ức chế phân bào và không có khả năng liên kết với các protein thành phần, bao gồm cả các protein trong con đường thụ thể AhR (Igreja, 2010). AIP hoạt động như là nhân tố áp chế khối u ở hầu hết các mô. Đột biến gen AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên (Hernandez, 2017). 1.5. VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU THÔNG QUA THỤ THỂ AHR AIP có vai trò ổn định phức hợp của AhR gắn kết với phối tử, duy trì AhR trong bào tương, ngăn chặn sự phân giải AhR bởi proteasome. AIP có thể ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn của AhR 4 hoặc sự truyền tín hiệu của thụ thể AhR (Jaffrain, 2009). AIP còn điều hòa hoạt động phiên mã của gen AhR. Sự nhạy cảm của tế bào với dioxin có liên quan tới protein AIP. Đột biến mất chức năng AIP dẫn đến bất thường trong điều hòa biểu hiện các gen đích của con đường tín hiệu AhR (Nukaya, 2010; Rowland, 2011). 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM Tại Việt Nam, đã có các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi nội tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trong máu, trong sữa mẹ ở những người dân sống trong vùng ô nhiễm chất da cam/dioxin. Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cơ cấu bệnh tật trên đối tượng nạn nhân dioxin. Các nghiên cứu phân tử đã chỉ ra những thay đổi trong biểu hiện/đột biến ở một số gen trên đối tượng phơi nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1... Đối với các gen AhR, chưa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa hình/đột biến trên toàn bộ vùng biểu hiện gen AhR. Với gen AIP, cho đến nay chưa có nghiên cứu về biến đổi gen AIP ở người nhiễm dioxin nói riêng và quần thể người Việt Nam nói chung. 1.7. NGHIÊN CỨU HỆ GEN (GENOME) VÀ HỆ GEN BIỂU HIỆN (EXOME) TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các đối tượng nạn nhân dioxin đã được tiến hành ở tài cấp Nhà nước 33 (KHCN-33/11- 15), theo mô hình trio (bố - con – mẹ) đã giải mã hệ gen một số gia đình nạn nhân chất độc da cam. Giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) được thực hiện trên đối tượng con/cháu của các nạn nhân chất độc da cam bị thiểu năng trí tuệ trong đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34). 5 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu phơi nhiễm dioxin là 93 người đã được xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu (thuộc đề tài Nhà nước KHCN-33.04/11-15). Đối tượng không phơi nhiễm dioxin là 20 người dân sống ở khu vực quận Hà đông, Hà Nội. Đối tượng nghiên cứu giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là 1 cựu chiến binh bị nhiễm dioxin (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.01-2014.34). 2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ Hóa chất của các hãng: Sigma, Quiagen, FermentasTrang thiết bị của Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 6 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số 2.3.2. Đo quang phổ DNA 2.3.3. Điện di DNA trên gel Agarose 2.3.4. Nhân gen bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.5. Giải trình tự gen tự động 2.3.6. Phương pháp giải trình tự toàn bộ exon (WES) Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Chúng tôi phân tích chỉ số sinh học của 114 mẫu (94 mẫu phơi nhiễm và 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin). Các mẫu phơi nhiễm dioxin được phân thành 3 nhóm: Bảng 3.1. Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu Nhóm đối tƣợng n Tổng Không phơi nhiễm dioxin 20 20 Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt và bị bệnh liên quan dioxin 27 Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt Phơi nhiễm 34 và không bị bệnh liên quan dioxin 94 dioxin Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt và không bị bệnh liên quan 33 dioxin Tổng 114 Trong các bệnh liên quan đến dioxin mà đối tượng trong nghiên cứu mắc phải, bệnh ung thư và đái tháo đường type II chiếm tỷ lệ cao nhất, trong đó các đối tượng đa phần bị mắc đồng thời cả 7 bệnh ung thư và đái tháo đường type II (9/27 mẫu; 33,33%). Độ tuổi trung bình của đối tượng phơi nhiễm và không phơi nhiễm tương đương nhau. Độ tuổi trung bình của 3 nhóm trong vùng phơi nhiễm có sự chênh lệch, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nữ giới chiếm tỷ lệ cao hơn nam giới trong cả 2 nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin. Tuy nhiên, ở nhóm có dioxin ≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin thì nam chiếm tỷ lệ cao hơn nữ khoảng 1,5 lần. Trong khi ở 2 nhóm còn lại, nữ giới nhiều gấp 1,6 đến 1,7 lần so với nam giới. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index, BMI) liên quan đến nồng độ dioxin trong cơ thể cũng như khả năng đào thải dioxin. Chỉ số BMI ở 3 nhóm đối tượng trong vùng phơi nhiễm dioxin không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0,05. Tỷ lệ người thừa cân, béo phì tương đương nhau giữa nhóm 1 và nhóm 2. Trong nhóm 3 tỷ lệ người béo phì thấp hơn, tuy nhiên khác biệt này không có ý nghĩa thống kê . 3.2. ĐA HÌNH CÁC GEN AHR VÀ AIP 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số 3.2.2. Nhân bản gen các gen AHR và AIP Sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR và 6 exon gen AIP là đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. 3.2.3. Phân tích đa hình gen AHR Xác định được 4 đa hình trên exon và exon 10; 1 đa hình intron 5 gen AhR. Các đa hình đều xuất hiện riêng lẻ ở các cá thể khác nhau. 8 Bảng 3.6. Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu Thay Nhóm đối tƣợng Số hiệu Thay đổi Số mẫu Vị trí đổi PN Không PN đa hình nucleotide (n) protein % (n) % (n) rs17779352 Exon 2 c.132T>C N44N 22 8,3% (1) 0 rs3802082 Intron 5 c. 575-199A>T - 22 75,0% (9) 60% (6) rs2066853 Exon 10 c.1661G>A R554K 114 63,8% (60) 65% (13) rs75519181 Exon 10 c.1459A>G N487D 114 2,10% (2) 0 rs779531731 Exon 10 c.1541T>C I514T 114 1,10% (1) 0 Chú thích: PN - phơi nhiễm. Không PN - không phơi nhiễm. Dấu - biểu thị đa hình không làm thay đổi protein Phân tích so sánh tần số các đa hình gen AR trong nghiên cứu này và một số quần thể người trên thế giới theo Human Genetic Varition Database (HGVD), vói n=100 cho mỗi quần thể. Người Việt Nam trên HGVD là người Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh Bảng 3.7. Tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với đa hình ở các quần thể ngƣời (theo HGVD ) Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể Số hiệu Nghiên cứu Việt Nhật Trung Nam Châu Châu Châu đa hình n (%) Nam bản quốc Á Phi Mỹ Âu rs17779352 1/22 (4,5) 8,1 5,8 5,6 18,8 4,1 6,3 14,1 rs3802082 15/22 (68,2) 57,4 70,2 70,4 73,8 24 30,9 30,3 rs2066853 73/114 (64) 56,6 71,2 67,6 27,4 70,7 31,7 20,9 rs75519181 2/114 (1,8) 0.0 2,9 2,9 0 0 0 0 rs779351731 1/114 (0,9) --- --- --- --- --- --- --- Ký hiệu ---là không có thông tin tần số đa hình trên Human Genetic Varition Database 9 3.2.3.1. Đa hình trên exon 2 gen AhR Đa hình trên exon 2 được phát hiện là c.132T>C, p.N44=, số hiệu rs17779352, có ở một mẫu vùng phơi nhiễm, đối tượng có nồng độ TCDD trong máu cao (53,57ppt), chẩn đoán mắc bệnh ung thư khí quản và tiểu đường type II. 3.2.3.2. Đa hình trên intron 5 gen AhR Đa hình được phát hiện là rs3802082 (c.575-199A>T), tần số 68,2%. Tần số đa hình ở quần thể người Việt Nam là 57,4 % . Ở các quần thể người đa hình đều xuất hiện với 3 kiểu gen AA, AT và TT. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, đa hình chỉ thấy có 2 kiểu gen TA và TT, không có kiểu (AA) ở tất cả các mẫu nghiên cứu. 3.2.3.3. Đa hình trên exon 10 gen AhR Phát hiện thấy có 3 điểm đa hình exon 10 đều dẫn đến thay đổi amino acid (Bảng 3.8). Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg. Bảng 3.8. Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR Kiểu gen Allele Đa hình HWpval Kiểu gen n, (%) allele % GG 36% (41) rs2066853 G 61,8% GA 51,8% (59) 0.4317 Đa hình (1) A 38,2% AA 12,3% (14) rs75519181 GA 1,8% (2) G 99,1% 1 Đa hình (2) AA 98,2% (112) A 0,9% rs779351731 TT 99,1% (113) T 99,6% 1 Đa hình (3) CT 0,9% (1) C 0,4% HWpval (Hardy-Weinberg p value): giá trị cân bằng Hardy-Weinberg, tần số các kiểu gen đạt trạng thái cân bằng khi p>0.001. 10 Đa hình (1) exon 10 gen AhR: rs2066853 Đa hình rs2066853 (c.1661G>A, p.R554K) chiếm tỷ lệ cao (64%), xuất hiện ở cả 3 kiểu gen là GG, GA và AA. Tỷ lệ % Phơi nhiễm 55 60 51 Không phơi nhiễm 36 40 35 20 13 10 0 Kiểu gen GG GA AA Hình 3.10. Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu. Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA và AA) của đa hình rs206853 gen AhR. Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin. Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng không phơi nhiễm dioxin. Kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG ở cả vùng phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin (Hình 3.10). Bảng 3.10. Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853 gen AhR ở 3 nhóm vùng phơi nhiễm dioxin Kiểu gen: %, (n) Nhóm nghiên cứu P GG GA AA Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, 55,6 % 29,6% 14,8% bị bệnh liên quan dioxin (15 (8) (4) Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt, 23,5% 64,7% 11,8% P=0.083 không bị bệnh liên quan dioxin (8) (22) (4) Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt, 33,3% 54,6% 12,1 không bị bệnh liên quan dioxin ( 11) (18) (4) 11 Tần số các kiểu gen GG, GA và AA giữa 3 nhóm trong vùng phơi nhiễm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0.05, (bảng 3.10). Tuy nhiên, ở nhóm 1 tần số kiểu gen GG cao hơn 1,88 lần kiểu gen GA. Ngược lại, ở nhóm 2, tần số kiểu gen GA lại cao hơn 2.75 lần so với kiểu gen GG. Để đánh giá sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê hay không, chúng tôi phân tích riêng tần số kiểu gen GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 (bảng 3.11) Bảng 3.11. Tần suất kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853 gen AhR ở nhóm 1 và nhóm 2 vùng phơi nhiễm dioxin Kiểu gen: %, (n) Nhóm nghiên cứu p, OR, 95%CI GG GA 65,2 % Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, bị 34,8% (15) (8) bệnh liên quan dioxin p = 0.005 OR = 5.156 26,7% Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt, 73,3% 95%CI: (8) (22) không bị bệnh liên quan dioxin (1.585 - 16.1771) 2 Chú thích: p thu được từ kiểm định χ , OR (Odd ratio): tỷ số chênh. 95%CI (95% confidnece interval): khoảng tin cậy 95%. Sự khác biệt kiểu gen GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 có ý nghĩa thống kê (OR = 5.156; 95%CI: 1.585 - 16.1771; p<0.01). Các đối tượng ở nhóm 1 và nhóm 2 đều có nồng độ dioxin trong máu cao, ở nhóm 1 các cá thể bị bệnh liên quan dioxin, có tần suất kiểu GA chiếm tỷ lệ thấp, trong khi ở nhóm 2, các cá thể không bị bệnh liên quan dioxin, kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao. Điều đó cho thấy, đa hình rs2066853 kiểu gen GA có thể có vai trò làm giảm ảnh hưởng gây hại của dioxin ở những người bị nhiễm dioxin, so với những người nhiễm dioxin không có kiểu gen GA. Ngoài ra, đa hình gen AhR được cho là có ảnh hưởng làm giảm sự nhạy cảm và ái lực của thụ 12 thể AhR với các phối tử (Frericks, 2008; Chen, 2009). Trong nghiên cứu này, nhóm có dioxin trong máu <10 ppt (nhóm 3) tần suất kiểu gen GA (54,6%) cao hơn kiểu gen GG (33,3%) (Bảng 3.10). Điều này cũng có thể là do kiểu gen GA liên quan đến giảm nhạy cảm và ái lực của thụ thể AhR với dioxin ở những người bị phơi nhiễm. Để đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853 với ung thư trong nhóm có dioxin trong máu cao, chúng tôi phân tích tần suất kiểu gen GG và GA các đối tượng dioxin trong máu ≥10 ppt bị ung thư và dioxin trong máu ≥10 ppt không bị ung thư (Hình 3.11). Tỷ lệ % GA 120 GG 100 GA 80 23.1% GA 60 67.5% 40 GG 76.9 % 20 GG 32.5% 0 Ung thư Không ung thư Hình 3.11. Phân bố kiểu gen GG và GA đa hình rs2066853 gen AhRở các đối tƣợng có dioxin trong máu cao (ung thƣ và không ung thƣ) Trục tung: Tỷ lệ % các kiểu gen (GG, GA) của đa hình rs2066853.. Trục hoành: biểu thị 2 nhóm ung thư và không ung thư ở đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao ≥10 ppt. Cột màu đỏ biểu thị kiểu gen GA. Cột màu xanh biểu thị kiểu gen GG. Trong nhóm đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao và bị ung thư, tỷ lệ kiểu gen GA (23,1%; 3/13 mẫu) thấp hơn GG (76,9%; 10/13 mẫu). Ngược lại, ở đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao và không bị ung thư, kiểu gen GA tỷ lệ 67,5% (27/49 mẫu), cao hơn GG (32,5%; 13/40 mẫu), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (OR = 13 6.923; 95%CI: 1.624 - 29.513; p<0.01). Điều này cho thấy, đa hình R554K (GA) có thể liên quan đến giảm nguy cơ ung thư ở những người có nồng độ dioxin trong máu cao. Khi xảy ra thay thế Arg554 thành Lys554 dẫn đến mất đi một liên kết hydro trong phân tử protein. Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như tương tác của thụ thể AhR với các protein thành phần trong con đường tín hiệu AhR. Đa hình (2) exon 10 gen AhR: rs75519181 Đa hình rs75519181 (c.1459A>G, p.N487D) trong nghiên cứu của chúng tôi xuất hiện với 2 kiểu gen là AA và GA. Bảng 3.12. Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs75519181 gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời (theo HGVD) Allele Trong Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể Kiểu gen nghiên cứu Việt Nhật Trung Nam Châu Châu Châu n=114 Nam bản quốc Á Phi Mỹ Âu Allele A 99,1 100 98,6 98,6 100 100 100 100 G 0,9 0 1,4 1,4 0 0 0 0 Kiểu AA 98,2 100 97,1 97,1 100 100 100 100 gen GA 1,8 0 2,9 2,9 0 0 0 0 Hầu hết các quần thể người trên thế giới, đều không có đa hình rs75519181 (Bảng 3.12). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này phát hiện thấy đa hình rs75519181 ở 2 mẫu trong vùng phơi nhiễm, nhóm 2 (1,8%). Không phát hiện thấy đa hình này ở các mẫu không phơi nhiễm dioxin. Phân tích đánh giá ảnh hưởng của đa hình rs75519181 cho thấy, khi Asp thay thế Asn tại vị trí 487 dẫn đến mất đi một cầu nối hydro trong phân tử. Ngoải ra, Asn là amino acid trung tính, 14 không tích điện, được thay bằng một amino acid mang tính acid và tích điện âm (Asp). Điều này có thể làm thay đổi ái lực liên kết ion trong phân tử protein. Đa hình (3) exon 10 gen AhR: rs779351731 Đa hình rs779351731 (c.1541T>C, p.I514T) có 2 kiểu gen TT và CT. Cho đến nay chưa có dữ liệu về tần số đa hình cũng như tần số các allele và kiểu gen của đa hình trên các chủng tộc người trên thế giới. Trong nghiên cứu này, đa hình rs779351731 (kiểu gen CT) có ở 1 /114 mẫu (tỷ lệ 0,88%), đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao, được xác nhận là không mắc bệnh liên quan đến dioxin. Phân tích cấu trúc protein cho thấy, khi thay thế I (Isoleucine) dẫn đến mất một liên kết hydro tai vị trí Gl516, hình thành mới liên kết hydro tại His511. Ngoài ra, Isoleucine có đặc tính không phân cực, kị nước được thay bằng Threonine có tính phân cực. 3.2.4. Phân tích đa hình gen AIP Phiện thấy 5 đa hình/đột biến ở các exon 2, exon 4 và exon 5. Bảng 3.13. Các đa hình gen AIP phát hiện trong nghiên cứu Nhóm đối tƣợng Số hiệu Thay đổi Thay đổi Số mẫu Vị trí PN Không PN đa hình nucleotide protein (n) % (n) % (n) rs747233720 Exon2 c.120 G>A - 114 8,5% (8) 10% (2) Đột biến mới Exon2 c.124C>A H42N 114 3,2% (3) 0 rs138902236 Exon 4 c.517G>A E173K 114 10,6 (10) 15% (3) rs2276020 Exon 4 c.516C>T p.D172D 114 23,4% (22) 20% (4) rs641081 Exon 5 c.682C>A p.Q228K 114 94 (100%) 20 (100%) Trong 4 đa hình gen AIP, đa hình rs641081 xuất hiện ở 100% ở đối tượng nghiên cứu. Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình còn lại 15 (rs747233720, rs138902236, rs2276020) đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg, với giá trị Hwpval =1 (>0.001) (bảng 3.14). Bảng 3.14. Tần suất allele, kiểu gen 3 đa hình gen AIP trong nghiên cứu Kiểu gen Allele Đa hình HWpval kiểu gen n (%) allele % GG 104 (91,2) G 95,6 1 rs747233720 GA 10 (8,8) A 4,4 GG 101 (88,6) G 94,6 1 rs138902236 GA 13 (11,4) A 5,4 CC 88 (77,2) C 87,7 CT 24 (21,1) 1 rs2276020 T 12,3 TT 2 (1,7) 3.2.4.1. Đa hình trên exon 2 gen AIP Đa hình rs747233720 có ở 10/114 mẫu (8,8%). Chưa có dữ liệu công bố về tần số đa hình cũng như tần số allele và kiểu gen của đa hình này ở các quần thể người trên thế giới. Một biến đổi khác được phát hiện trên exon 2 là c.124C>A, p.H42N, biến đổi có thể coi là đột biến mới (chưa có trên dbSNP). Đột biến xuất hiện ở ba mẫu (DN30, DN34, DN52), nhóm có nồng độ dioxin cao và bị bệnh liên quan dioxin. Đột biến H42N dẫn đến mất 1 liên kết hydro trong phân tử protein, đồng thời thay thế một một amino acid vòng, tích điện dương (Histidine) thành một amino acid trung tính, không tích điện (Asparagine). Đa hình H42N nằm ở đầu cuối N của protein. Đầu N của AIP đóng vai trò quan trọng trong tương tác của AIP với các protein khác cũng như duy trì cấu trúc và sự ổn định của AIP trong tế bào (Linnert, 2013). 16 3.2.4.2. Đa hình trên exon 4 gen AIP Đa hình rs138902236 (c.517G>A, p.E173K) xuất hiện ở 2 kiểu gen GG và GA. Hầu hết các quần thể người trên thế giới đều không có đa hình này. Trong nghiên cứu này, đa hình rs138902236 (GA) xuất hiện với tỷ lệ khá cao (13/114 mẫu, 11,4%). Đa hình dẫn đến thay thế amino acid có tính acid, tích điện âm (Glutamic acid) thành amino acid có tính kiềm, tích điện dương (Lysine). 3.2.4.3. Đa hình trên exon 5 gen AIP Đối với exon 5 phát hiện thấy đa hình rs641081 (c.682C>A, p.Q228K) ở 100% mẫu nghiên cứu. Kết quả này phù hợp với tần số đa hình rs641081 quần thể người Việt Nam trên cơ sở dữ liệu HGVD. Ở nhóm đối tượng dioxin ≥ 10 ppt và mắc các bệnh liên quan đến dioxin, có 2 trường hợp mang đồng thời đa hình H42N gen AIP và đa hình R554K gen AhR (mẫu DN34, DN52). Cả 2 trường hợp đều mắc bệnh tiểu đường type II, trong đó 1 trường hợp mắc đồng thời ung thư khí quản (DN52). Ngoài ra, 2 trường hợp khác có đa hình E173K gen AIP, trong đó 1 người có đa hình R554K gen AhR kiểu gen GA (mẫu DN53) mắc bệnh thần kinh ngoại biên và 1 người có đa hình R554K gen AhR kiểu gen AA (DN56) mắc ung thư khí quản. 3. GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƢỜI CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO Từ kết quả WES mẫu có nồng độ dioxin trong máu cao (mẫu ThN). Chúng tôi đã sàng lọc được 40 biến thể di truyền ở 8 gen (AhR, AIP, AhRR, CYP1A1, ARNT, CYP1B1, HEMGN, CENPE) liên quan đến con đường chuyển hóa dioxin thông qua thụ thể AhR (Bảng 3.18) 17 Bảng 3.18: Các biến thể di truyền sàng lọc từ kết quả giải trình tự toàn bộ exon (WES) Gene Rank/ dbSNP142 #Chrom Zygosity Effect HGVS.c HGVS.p Name Total _ID AhR chr7 HOM upstream_gene_variant . c.-614C>T . rs10249788 AhR chr7 HOM upstream_gene_variant . c.-614_-614insGGGCGGGGCG . rs71010234 AhR chr7 HOM 5_prime_UTR_variant 1/11 c.-459A>G . rs7796976 AhR chr7 HOM intron_variant 7/10 c.908+33G>T . rs2074113 AhR chr7 HOM missense_variant 10/11 c.1661G>A p.Arg554Lys rs2066853 rs20219851 AhR chr7 HOM 3_prime_UTR_variant 11/11 c.*1887delG . 8 AIP chr11 HOM intron_variant 3/5 c.469-236G>T . rs611697 rs13890223 AIP chr11 HOM missense_variant 4/6 c.517G>A p.Glu173Lys 6 AIP chr11 HOM missense_variant 5/6 c.682C>A p.Gln228Lys rs641081 AhRR chr5 HET intron_variant 3/11 c.257-8756G>A . rs76301536 c.257-107_257- 106insTGAGAACCGTGGGGTGAA AhRR chr5 HOM intron_variant 3/11 CGCGGGGAAACACAGGAAAGA . . TGTGAATGAA rs18714198 AhRR chr5 HET 3_prime_UTR_variant 12/12 c.*992A>G . 7 CYP1A1 chr15 HET missense_variant 7/7 c.1384A>G Ile462Val rs1048943 CYP1A1 chr15 HET missense_variant 2/7 c.134G>A Gly45Asp rs4646422 ARNT chr1 HET 3_prime_UTR_variant 22/22 c.*559_*562dupTGTG . rs71580328 ARNT chr1 HET 3_prime_UTR_variant 22/22 c.*562_*563insTGCG . rs71580328 ARNT chr1 HET 3_prime_UTR_variant 22/22 c.*512A>G . rs11552229 ARNT chr1 HOM intron_variant 15/21 c.1506-52T>A . rs3894771 ARNT chr1 HET intron_variant 12/21 c.1167+103A>G . rs3738483 ARNT chr1 HET intron_variant 9/21 c.870-50T>G . rs10305704 ARNT chr1 HET synonymous_variant 7/22 c.567G>C p.Val189Val rs2228099 18 ARNT chr1 HET intron_variant 6/21 c.486+123A>G . rs2256355 ARNT chr1 HET intron_variant 2/21 c.138-229G>A . rs10305673 CYP1B1 chr2 HOM synonymous_variant 3/3 c.1347T>C Asp449Asp rs1056837 CYP1B1 chr2 HOM missense_variant 3/3 c.1294G>C Val432Leu rs1056836 CYP1B1 chr2 HET missense_variant 2/3 c.355G>T Ala119Ser rs1056827 CYP1B1 chr2 HET missense_variant 2/3 c.142C>G Arg48Gly rs10012 HEMGN chr9 HET missense_variant 4/5 c.966A>C p.Lys322Asn . CENPF chr1 HOM missense_variant 16/20 c.8186G>A p.Arg2729Gln rs335524 CENPF chr1 HOM intron_variant 16/19 c.8322+32G>A . rs335523 CENPF chr1 HOM intron_variant 16/19 c.8322+479delT . rs11303309 CENPF chr1 HOM intron_variant 17/19 c.8485+66A>G . rs435043 CENPF chr1 HOM missense_variant 18/20 c.8827A>G p.Arg2943Gly rs438034 CENPF chr1 HOM missense_variant 20/20 c.9318C>G p.Asn3106Lys rs7289 CENPF chr1 HOM missense_variant 16/20 c.8186G>A p.Arg2729Gln rs335524 CENPF chr1 HOM intron_variant 16/19 c.8322+32G>A . rs335523 CENPF chr1 HOM intron_variant 16/19 c.8322+479delT . rs11303309 CENPF chr1 HOM intron_variant 17/19 c.8485+66A>G . rs435043 CENPF chr1 HOM missense_variant 18/20 c.8827A>G p.Arg2943Gly rs438034 CENPF chr1 HOM missense_variant 20/20 c.9318C>G p.Asn3106Lys rs7289 Chú thích: - Cột 1 (Gene name): tên gen - Cột 2 (#Chrom): tên nhiễm sắc thể chứa gen. - Cột 3 (Zygosity): HOM (thể đồng hợp), HET (thể dị hợp) - Cột 4 (Effect): upstream_gene_variant (biến thể ngược hướng – trình tự hướng về phía đầu 5’ của DNA; 5_prime_UTR_variant (biến thể vùng 5’ không dịch mã); intron_variant (biến thể vùng intron); missense_variant (biến thể làm thay đổi amino aicd); synonymous_variant (biến thể không làm thay đổi amino acid) - Cột 5 (Rank/total): exon/tổng số exon của gen - Cột 6 (HGVS.c): ký hiệu thay đổi nucleotide trên trình tự mã hóa DNA (c.DNA) - Cột 7 (HGVS.p): ký hiệu thay đổi amino acid trong phân tử protein. Ký hiệu chấm (.) trong cột biểu thị không có thay đổi amino acid trong protein. - Cột 8 (dbSNP142_ID): mã hiệu của đa hình trên cơ sở dữ liệu dbSNP phiên bản 142. 19 . 3.3.1. Phân tích biến đổi gen AhR, gen AIP từ kết quả giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES), so s