Dự thảo tóm tắt Luận án - Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh và kiểu gen kháng kháng sinh của streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng kỹ thuật pcr đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam

ơng. Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Đặng Đức Anh 2. GS. TS. Phạm Văn Ty Phản biện 1: .............................................................................................................................................. .............................................................................................................................................. Phản biện 2: .............................................................................................................................................. .............................................................................................................................................. Phản biện 3: .............................................................................................................................................. .............................................................................................................................................. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án Tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi.. giờ ., ngày ..tháng ...năm 201..... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội 2 MỞ ĐẦU Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) là tác nhân vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm khuẩn nghiêm trọng ở trẻ em và người già như viêm phổi, viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết. Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae có thể có vỏ hoặc không có vỏ polysaccharide. Kháng nguyên vỏ là kháng nguyên quan trọng để phân loại S. pneumoniae, đồng thời kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh và lan truyền bệnh trong cộng đồng. Dựa trên sự khác biệt tính kháng nguyên vỏ, người ta phân loại vi khuẩn S. pneumoniae thành trên 90 typ huyết thanh khác nhau. Kháng thể kháng vỏ thường là kháng thể đặc hiệu và có hiệu lực bảo vệ. Vắc xin phế cầu đang sử dụng là vắc xin cộng hợp, bao gồm một số loại kháng nguyên vỏ polysaccharide của vi khuẩn S. pneumoniae. Phương pháp kinh điển cho chẩn đoán typ huyết thanh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae là phản ứng phồng vỏ Quellung. Phương pháp này thường rất tốn kém, mất nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng chéo giữa các kháng huyết thanh, lại không phát hiện các trường hợp đồng nhiễm nhiều typ. Phương pháp xác định typ huyết thanh sử dụng cho các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng chỉ là những kỹ thuật nuôi cấy kinh điển. Trong vài năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã phát triển kỹ thuật PCR để định typ huyết thanh có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện cao và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh nhiều hơn so với phương pháp thông thường. Tuy nhiên, các kỹ thuật PCR đã công bố thường chỉ phù hợp cho từng khu vực nghiên cứu cụ thể và còn hạn chế về số lượng các typ huyết thanh được phát hiện. Việc tìm ra một quy trình xét nghiệm không dựa trên nuôi cấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chẩn đoán phần lớn các typ huyết thanh lưu hành của phế cầu ở mỗi khu vực, mỗi quốc gia là vấn đề hết sức cần thiết. 3 Nhiễm trùng do S. pneumoniae có thể dự phòng vắc xin và điều trị bằng kháng sinh thích hợp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã làm xuất hiện và lan truyền gen kháng thuốc gây cản trở tiến trình và hiệu quả điều trị. Mặc dù tình hình kháng kháng sinh có thể thay đổi theo từng khu vực hay từng quốc gia, nhưng châu Á là một tâm điểm của kháng kháng sinh. Trong khi đó, nguồn lực cũng như cơ sở hạ tầng cho giám sát y tế cộng đồng còn rất nghèo nàn. Với hơn 70% dân số trên thế giới sống ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương thì kháng kháng sinh ở khu vực này trở thành một gánh nặng toàn cầu. Chương trình giám sát về tỉ lệ mắc, sự lưu hành các typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của S.pneumoniae đã được thiết lập ở nhiều nước trên thế giới nhưng chưa có ở Việt Nam. Xuất phát từ tính cần thiết và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh và kiểu gen kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định sự phân bố các typ huyết thanh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam; 2. Xác định tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu gây bệnh tại một số địa phương ở Việt Nam; 3. Mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu đã áp dụng và cải tiến được quy trình PCR đa mồi xác định typ huyết thanh phù hợp với điều kiện tại Việt Nam. Kỹ thuật này có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện cao và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh nhiều hơn so với phương pháp thông thường. 4 Đưa ra được số liệu tổng quan về các typ huyết thanh lưu hành và tình trạng kháng kháng sinh giúp hoạch định chiến lược triển khai vắc xin dự phòng và lựa chọn kháng sinh thích hợp. Cung cấp số liệu cho các chương trình giám sát trong nước và các nước trong khu vực. Hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam có những phân tích về mối liên quan giữa typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh. Phân tích này bên cạnh việc cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành các gen kháng kháng sinh, còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi trội sau khi triển khai tiêm vắc xin cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược dự phòng. CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 120 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục; gồm 3 chương, 30 bảng, 38 hình, tham khảo 185 tài liệu trong và ngoài nước. Bố cục luận án gồm: Mở đầu 4 trang, tổng quan 45 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết quả và bàn luận 50 trang, kết luận 1 trang, kiến nghị 1 trang; 3 bài báo có liên quan trực tiếp đến luận án đã được công bố. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1 Tổng quan chung về vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae), còn gọi là phế cầu khuẩn, là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tuỳ tiện, tan huyết alpha, có khả năng tan trong muối mật và không sinh enzym catalase. Phế cầu có thể có vỏ hoặc không vỏ. Vỏ polysaccharide là yếu tố độc lực của tế bào, đến nay đã phát hiện được trên 93 typ huyết thanh vỏ khác nhau. Chủng mang các typ huyết thanh khác nhau về độc lực, tỷ lệ lưu hành theo từng vùng địa lý và tính kháng kháng sinh. Ngoài viêm phổi, phế cầu còn là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh xâm lấn khác như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm xương, viêm tai 5 giữa, viêm phế quản, viêm xoang cấp, viêm tai giữa, viêm nội mạc tử cung, viêm màng ngoài tim, viêm màng não và áp xe não. 1 2 Typ huyết thanh của S.pneumoniae Các kháng nguyên vỏ của vi khuẩn S. pneumoniae được sản xuất bởi tổ hợp gen nằm trên cùng một vị trí cps của nhiễm sắc thể, xen kẽ giữa hai gen dexB và aliA. Bốn gen đầu tiên là bảo tồn và giống nhau ở tất cả các typ huyết thanh, trong khi phần trung tâm của locus chứa các gen đặc hiệu typ. Trình tự nucleotide của cps locus tương ứng với hơn 90 typ huyết thanh của vi khuẩn phế cầu đã được xác định và là cơ sở cho việc phân loại vi khuẩn S. pneumoniae dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Tại châu Á, có 7 kiểu typ huyết thanh 1, 5, 6A, 6B, 14, 19F và 23F là phổ biến nhất chiếm 58%-66% các bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở các quốc gia. Tiêm chủng cho trẻ từ sớm sẽ giúp giảm thiểu tác hại của các căn bệnh do phế cầu gây ra. Vắc xin phòng ngừa bệnh này sản xuất dựa trên vỏ polysaccharide. Vắc xin liên hợp PCV7, PCV10 và PCV13 đã lần lượt đưa vào triển khai áp dụng ở các nước/lãnh thổ khu vực châu Á nhưng chưa được áp dụng tại Việt Nam. Hiệu quả bảo vệ tại các khu vực này chưa công bố nhưng được ước tính dựa trên độ bao phủ các typ huyết thanh. 1 3 Kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae S. pneumoniae kháng kháng sinh lần đầu tiên xuất hiện từ những thập niên 70, sau đó gia tăng nhanh chóng trên toàn cầu. Sự xuất hiện các chủng Streptococcus pneumoniae kháng thuốc (drug-resistant Streptococcus pneumoniae - DRSP) gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và cộng đồng. Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae (chủ yếu là β-lactams và macrolides) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối với các protein gắn penicillin (chủ yếu là pbp1A, pbp2X, pbp2B) hoặc do vi khuẩn thay đổi cấu trúc đích (methyl hóa ribosom) do gen ermB (gây kháng 6 đồng thời nhiều dòng kháng sinh của macrolides, clindamycine và tetracycline) hoặc hình thành các bơm sinh học gây thay đổi tính thấm của kháng sinh do các gen mef A, mef E [21]. Vi khuẩn kháng thuốc thường lan truyền trong cộng đồng qua việc trao đổi các kiểu gen gây kháng thuốc giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài. Hiện nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu để xác định nguồn gốc lan truyền các vi khuẩn kháng thuốc và các đột biến mới liên quan đến kháng thuốc. CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Thiết kế nghiên cứu - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích. - Thời gian và địa điểm: Giai đoạn 2009 - 2013 tại 3 địa điểm: Bệnh viện đa khoa Khánh Hòa, bệnh viện đa khoa Hải Dương và bệnh viện Bạch Mai. - Đối tượng nghiên cứu: 331 chủng vi khuẩn S. pneumoniae phân lập từ trẻ dưới 5 tuổi viêm đường hô hấp cấp tính. 2 2 Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong nghiên cứu - Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy phân lập: Khuẩn lạc vi khuẩn S. pneumoniae trên môi trường thạch máu 5%: Tròn, nhỏ, dẹt, không màu và có xu hướng lõm ở giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha. Vi khuẩn hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đôi giống hình cặp kính, cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương. Nhạy cảm optochin (Đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14 mm), tan trong muối mật. - Kỹ thuật sàng lọc phế cầu khuẩn bằng PCR đa mồi Các chủng phế cầu phân lập từ kỹ thuật nuôi cấy được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR. Sử dụng cặp gen lytA và cpsA đặc hiệu. - Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh: Áp dụng và cải tiến quy trình của CDC Hoa Kỳ xác định 40 typ huyết thanh 7 của phế cầu. Tổ hợp các nhóm mồi được thiết lập lại sao cho các typ huyết thanh thường gặp ở Việt Nam sẽ được sắp xếp lần lượt theo tần suất xuất hiện từ cao xuống thấp, làm giảm chi phí khi xét nghiệm mẫu. - Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh: Áp dụng và cải tiến quy trình của Nagai 2001 phát hiện các gen đột biến gây kháng kháng sinh: các gen pbp1A, pbp2X, pbp2B liên quan đến kháng kháng sinh nhóm beta-lactam; các gen ermB và mefA gây kháng đồng thời nhiều dòng kháng sinh của macrolides, clindamycine và tetracycline. - Kỹ thuật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và có thể quan sát được bằng mắt thường. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3 1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn S.pneumoniae Hình 3.1. Tỷ lệ phân lập S. pneumoniae và H. influenzae Trong số 1076 trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do viêm đường hô hấp cấp tính, tỷ lệ phân lập được H.influenzae cao nhất ở khu vực Khánh Hòa, sau đó là Bạch Mai và Hải Dương với tỷ lệ tương ứng là 28,16%, 25,51% và 19,62%. Trong đó tỷ lệ đồng nhiễm cả Streptococcus pneumoniae và Heamophillus influenzae ở ba khu vực tương ứng là 14,7%, 12,6% và 10,8%. 3 2 Xác định sự phân bố các typ huyết thanh các chủng phế cầu 3.2.1. Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định typ huyết thanh 8 Trong nghiên cứu này, đã áp dụng phương pháp PCR đa mồi của CDC. Tuy nhiên do sự phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S.pneumoniae giữa hai quốc gia khác nhau, nên có sự khác biệt trong việc sắp xếp tổ hợp các mồi ở mỗi phản ứng PCR. Sử dụng 36 cặp mồi xác định 40 typ huyết thanh của phế cầu, được chia thành 8 nhóm phản ứng. Đây là những typ huyết thanh phổ biến gây bệnh của phế cầu. Hình 3.3. Ảnh điện di quy trình xác định typ huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi 9 Trong số 331 chủng S. pneumoniae có tới 83,7% số chủng chỉ cần thực hiện 1 phản ứng PCR, 8,5% số chủng thực hiện 2 phản ứng, 2,1% số chủng thực hiện 3 phản ứng, số chủng thực hiện 3 và 4 phản ứng đều chỉ có 1,5%. Chỉ có 33 chủng (9,97%) phải chạy hết cả 8 nhóm phản ứng. Với cách sắp xếp các typ nổi trội được đưa lên các nhóm phản ứng đầu như vậy sẽ tiết kiệm được rất nhiều thời gian và nguồn lực do hạn chế được số lần thực hiện xét nghiệm. Đây chính là điểm mới của luận án. 3 2 2 Kết quả phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae Trong tổng số 331 chủng S. pneumoniae được tiến hành xác định typ huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi đã xác định được 13 typ huyết thanh. Các typ huyết thanh chiếm tỷ lệ vượt trội là 19F (28,1%), 6A/B (25,4%), 23F(13%), 14(9,7%) và 11(7,6%). Các typ còn lại chiếm tỷ lệ thấp hơn là 15B/C (4,5%), 19A (3%), 17F (1,8%), 23A (1,5%), 10A (0,9%), 34 (0,9%), 3 (0,6%), và 18 (0,3%). Hình 3.7. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại 3 bệnh viện thuộc phạm vi nghiên cứu Các typ huyết thanh chiếm ưu thế gây bệnh khác nhau giữa các nhóm tuổi, quốc gia và thay đổi theo thời gian. Bảy kiểu typ huyết thanh (1, 5, 6A, 6B, 14, 19F và 23F) là phổ biến nhất chiếm 58%-66% các bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở các quốc gia. Các serotype này là nguyên nhân gây nên trên 300.000 10 ca tử vong ở Châu Phi và 200.000 ca tử vong ở châu Á. Trong nghiên cứu của chúng tôi phát hiện 5/7 kiểu typ huyết thanh thuộc nhóm này (6A, 6B, 14, 19F và 23F) và chiếm tới 76,2 % trong tổng số 331 chủng phân lập được. 3.2.5. Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin Trong số 331 trẻ viêm đường hô hấp cấp tính có 243 trẻ (73,4%) được bao phủ bởi vắc xin PCV7 và PCV10. Độ bao phủ các typ huyết thanh tăng dần ở vắc xin PCV13 và PPSV23 với số lượng và tỷ lệ tương ứng là 251(75,8%) và 291(87,9%). Bảng 3.5. Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin PCV7 PCV10 PCV13 PPSV23 Số lượng kiểu typ huyết 5 5 7 11 thanh Typ huyết 19F, 6B, 19F, 6B, 19F, 6B, 19F, 6B, 23F, thanh bao phủ 23F, 14, 18 23F, 14, 18 23F, 14, 14, 18, 19A, trong vắc xin 18, 19A, 3 3, 11, 17F, 10A, 15B/C Tuổi <1 tuổi 127 86(67,7%) 86(67,7%) 89(70,1%) 113(89%) <2 tuổi 238 174(73,1%) 174(73,1%) 179(75,2%) 213(89,5%) <3 tuổi 287 209(72,8%) 209(72,8%) 215(74,9%) 251(87,5%) <4 tuổi 315 232(73,7%) 232(73,7%) 239(75,9%) 278(88,3%) <5 tuổi 331 243(73,4%) 243(73,4%) 251(75,8%) 291(87,9%) Giới Nam 193 146(75,6%) 146(75,6%) 151(78,2%) 172(89,1%) Nữ 138 97(70,3%) 97(70,3%) 100(72,5%) 119(86,2%) Vắc xin PCV7 và PCV10 có hiệu quả bao phủ các typ huyết thanh như nhau, cùng là 73,4%. Vắc xin PCV13 có tỷ lệ bao phủ cao hơn (75,8%) và có khả năng bảo vệ thêm được typ huyết thanh 19A và 3. Đã có nhiều báo cáo cho thấy các bệnh xâm lấn gây ra bởi các typ huyết thanh không bao gồm 11 trong vắc xin PCV7 kháng penicillin tăng lên và hầu hết các chủng kháng kháng sinh hiện nay được gây ra bởi typ 19A. Hơn nữa, mức độ nghiêm trọng của các chủng mang typ huyết thanh 19A gây đa kháng kháng sinh là nguyên nhân của bệnh viêm màng não và các bệnh nhiễm khuẩn xâm lấn nghiêm trọng, bệnh viêm xương chũm do phế cầu và là nguyên nhân dẫn đến thất bại trong điều trị các bệnh viêm tai giữa. Như vậy về khả năng bao phủ các typ huyết thanh thì vắc xin PCV13 sẽ có hiệu quả nhất trong số các loại vắc xin hiện có. 3.3. Tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu 3.3.1. Áp dụng quy trình PCR xác định gen kháng kháng sinh Áp dụng và cải tiến quy trình của Nagai năm 2001 từ 3 phản ứng thành 2 phản ứng. Sự kết hợp này đã giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và công sức 1/3 lần so với quy trình ban đầu. Phản ứng 1 sử dụng 3 cặp mồi của các gen lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B với kích thước tương ứng là 319 bp, 238 bp, 197 bp và 147 bp. Phản ứng 2 sử dụng 2 cặp mồi là mefA và ermB với kích thước tương ứng là 293 bp và 224 bp. M: Marker, 1-4 và 6-7: đơn mồi, 5: lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B, 8: mefA, ermB, (-): chứng âm. Hình 3.12. Ảnh điện di quy trình xác định gen kháng kháng sinh 3.3.2. Kết quả tỷ lệ phân bố kiểu gen kháng kháng sinh bằng PCR đa mồi Sự biến đổi protein gắn với penicillin (PBPs) làm giảm ái lực đối với kháng sinh là cơ chế chủ yếu giúp vi khuẩn kháng kháng thuốc. Những biến đổi này là do đột biến điểm hoặc thể khảm (mosaic) trong các gen pbp2X, 12 pbp2B, và pbp1A. Trung bình ở châu Á, có 52,4% số chủng S.pneumoniae không nhạy cảm với penicillin. Trong đó Việt Nam có tỷ lệ cao nhất (92%). Trong nghiên cứu này tỷ lệ mang gen đột biến pbp2B và pbp2X lên tới trên 95%. Tỷ lệ mang gen kháng kháng sinh cũng tương ứng với tỷ lệ kháng kháng sinh penicillin lên tới 94,3% (I: 60,7%; R: 33,5%). Tỷ lệ kháng trung gian cao tương ứng với tỷ lệ mang kiểu gen kháng kháng sinh cao, dẫn tới xu hướng dịch chuyển kháng sinh nhóm penicillin mức trung gian sang nhóm kháng hoàn toàn. Kháng kháng sinh nhóm penicillin thường kéo theo đa khang với những kháng sinh nhóm beta-lactam khác. Bảng 3.6. Tỷ lệ phân bố kiểu gen kháng kháng sinh pbp1A_ pbp2x pbp2b_ BĐ _BĐ BĐ MefA ErmB Khu vực p-value 0,03 0,011 0,029 0,027 0,001 Khánh Hoà 154 94,2% 98,7% 98,1% 33,8% 90,9% Hải Dương 77 89,6% 96,1% 96,1% 51,9% 74% Bạch Mai 100 84% 91% 91% 38% 89% Tuổi ≤ 2 tuổi 238 90,3% 97,1% 97,1% 36,6% 89,9% >2 tuổi 93 89,2% 92,5% 91,4% 46,2% 77,4% Giới p-value 0,22 0,51 0,34 0,1 0,93 Nam 193 91,7% 96,4% 96,4% 43% 86,5% Nữ 138 87,7% 94,9% 94,2% 34,1% 86,2% Tổng 331 90%) 95,8% 95,5% 39,3% 86,4% Đối với cơ chế kháng kháng sinh nhóm macrolide, con đường ức chế quá trình dịch mã được quy định bởi ermB là cơ chế chính ở hầu hết các quốc 13 gia châu Á và châu Âu và cũng đang gia tăng ở Hoa Kỳ trong thời gian gần đây, trong khi đó gen mefA vẫn chiếm ưu thế ở Canada. Các nguyên nhân chính dẫn đến sự đề kháng macrolide cao ở các nước châu Á là việc lạm dụng macrolid trong thực hành lâm sàng và sự lan rộng dòng vi khuẩn mang gen kháng macrolid qua quá trình chọn lọc kháng sinh. Với tình hình dịch tễ học kháng kháng sinh như vậy, kinh nghiệm sử dụng phác đồ điều trị macrolide đơn dòng cho các bệnh viêm phổi cộng đồng hay viêm phổi do phế cầu khác không phải là sự lựa chọn thích hợp ở nhiều nước châu Á, nơi có thể gây ra thất bại trong liệu pháp kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn. 3 3 3 Kết quả tình trạng kháng kháng sinh theo kiểu hình bằng kỹ thuật nồng độ ức chế tổi thiểu 3.3.3.1. Tình trạng kháng kháng sinh chung ở cả 3 bệnh viện thuộc khu vực nghiên cứu Bảng 3.7. Tình trạng kháng sinh của các chủng S.pneumoniae (n = 331) Kh MI Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) MIC áng Range C5 90 S I R sinh 0 201(60,7 111(33,5 pcg 0.016-32 1 4 19(5,7%) %) %) amp 293(88,5 0.016-32 1 4 16(4,8%) 22(6,6%) c %) 110(33,2 56(16,9% 165(49,8 amp 0.016-128 1 8 %) ) %) 285(86,1 cav 0.008-16 0.5 2 19(5,7%) 27(8,2%) %) 124(37,5 46(13,9% 161(48,6 cxm 0.016-64 2 8 %) ) %) 165(49,8 122(36,9 44(13,3% ctx 0.008-4 0.5 2 %) %) ) cfp 264(79,8 65(19,6% 0.032-4 1 2 2(0,6%) m %) ) ipm 0.008-1 0.2 0.5 120(36,3 203(61,3 8(2,4%) 14 Kh MI Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) MIC áng Range C5 90 S I R sinh 0 5 %) %) 0.008- 61(18,4% 258(77,9 em 32 128 12(3,6%) >129 ) %) 0.064- 57(17,2% 263(79,5 azm 64 >129 11(3,3%) >129 ) %) 0.032- 55 260(78,5 cam 32 >129 16(4,8%) >129 (16,6%) %) cld 0.008- 88(26,6% 224(67,7 128 >129 19(5,7%) m >129 ) %) 194(58,6 137(41,4 cp 1-32 4 16 - %) %) 68(20,5% 258(77,9 tc 0.125-128 16 64 5(1,5%) ) %) 0.5- 309(93,4 cpfx 0.032-32 1 7(2,1%) 15(4,5%) 1 %) Trong nghiên cứu của chúng tôi đã lựa chọn phương pháp ức chế tối thiểu để xác định tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn S.pneumoniae. Bên cạnh xác định được tỷ lệ các chủng vi khuẩn nhạy cảm và kháng kháng sinh, còn xác định được nồng độ tối thiểu cần thiết để tiêu diệt vi khuẩn, từ đó làm cơ sở để lựa chọn các mức liều trong điều trị. Đã có sự dịch chuyển sang nhóm giảm nhạy cảm (60%) và kháng (33,5%) đối với penicillin, và tỷ lệ kháng là 49,8% đối với ampicillin (MIC,  2g/ml). Tuy nhiên trong nhóm penicillin, vẫn còn 88,5% nhạy cảm với amoxicillin (MIC,2g/ml) và 89,6% còn nhạy cảm với amoxicillin- clavunalic (MIC,  2/1g/ml). Chỉ có 5,7% số chủng S. pneumoniae còn nhạy với penicillin và 33,2% nhạy với ampicillin. Nồng độ ức chế tối thiểu của vi 15 khuẩn S.pneumoniae đối với kháng sinh nhóm penicillin ở mức thấp với MIC50 từ 0,5-1g/ml và MIC90 từ 2-8 g/ml. Tỷ lệ nhạy cảm với nhóm kháng sinh Cephalosporin tăng từ thế hệ thấp tới thế hệ cao. Chỉ có 37,5% còn nhạy cảm với cefuroxime (thế hệ II), tăng dần ở cefotaxime (thế hệ III) là 49,8% và 70,8% ở cefepime (thế hệ IV). Tỷ lệ kháng của cefotaxime thấp (13,3%) nhưng tỷ lệ giảm nhạy cảm lại khá cao (36,9%). Đề kháng ở nhóm carbapenem (đại diện là imipenem) chỉ 2,4% (MIC,  1g/ml), tuy nhiên có tới 61,3% số chủng kháng ở mức độ trung gian. Các chủng S. pneumoniae đã kháng lại kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp thuộc nhóm macrolide và lincosamide như: 77,9% kháng với erythromycin, 79,5% kháng với azithromycin, 78,5 kháng với clarithromycin và 67,7% kháng với chlindamycin. Dải kháng khuẩn trong nhóm kháng sinh này rộng từ 0,008 - >129 g/ml, và giá trị nồng độ tiêu diệt trên 90% số chủng rất cao với MIC90>129g/ml. Hình 3.15. Kháng kháng sinh hoàn toàn và kháng trung gian (n=331) Kháng sinh nhóm macrolide có tỷ lệ kháng hoàn toàn cao và tỷ lệ kháng trung gian thấp, như vậy nhóm giảm nhậy cảm đã dịch chuyển sang kháng hoàn toàn, kết hợp với kết quả các giá trị nồng độ MIC rất cao ở nhóm kháng sinh này (Bảng 3.7, và 3.8) chứng tỏ nhóm macrolide sẽ không còn tác dụng trong điều trị bệnh phế cầu nữa. 16 Một số kháng sinh nhóm beta-lactam có tỷ lệ kháng thấp như penicillin G, cefotaxim hoặc kháng sinh thế hệ cao và mạnh như cefepim, imipenem, ciprofloxacin nhưng lại có tỷ lệ kháng ở mức trung gian rất cao (Hình 3.15). Điều này dự báo khả năng dịch chuyển từ nhóm giảm nhạy cảm sang nhóm kháng hoàn toàn. Các loại kháng sinh này sẽ có khả năng gia tăng tính kháng trong tương lai gần. Dự báo khả năng gia tăng các chủng kháng thuốc nếu không có liệu pháp sử dụng kháng sinh hợp lý. Một trong các biện pháp làm giảm nhẹ xu hướng kháng kháng sinh đó là phối hợp kháng sinh đối với loại có tỷ lệ kháng trung gian cao hoặc luân phiên chuyển đổi sang nhóm kháng kháng sinh khác. Một số kháng sinh nhóm beta-lactam như amoxicillin, amoxicillin/ clavulanic, cefepim có tỷ lệ nhạy cảm cao tương ứng là 88,5%, 86,1% và 79,8%. Đây là các kháng sinh có thể điều trị hiệu quả các bệnh phế cầu. 3 3 5 Tình trạng đa kháng kháng sinh của các chủng S.pneumoniae Bảng 3.16. Đa kháng kháng sinh của vi khuẩn S.pneumoniae (n=331) Số kháng sinh Số lƣợng chủng Số chủng kháng cộng kháng kháng dồn 13 2(0,6%) 2(0,6%) 12 4(1,2%) 6(1,8%) 11 8(2,4%) 14(4,2%) 10 16(4,8%) 30(9,1%) 9 26(7,9%) 56(16,9%) 8 38(11,5%) 94(28,4%) 7 40(12,1%) 134(40,5%) 6 50(15,1%) 184(55,6%) 5 54(16,3%) 238(71,9%) 4 31(9,4%) 269(81,3%) 3 20(6,0%) 289(87,3%) 2 23(6,9%) 312(94,3%) 1 15(4,5%) 327(98,8%) 17 Số kháng sinh Số lƣợng chủng Số chủng kháng cộng kháng kháng dồn 0 4(1,2%) 331(100%) Các chủng vi khuẩn S.pneumoniae kháng từ 3 kháng sinh trở lên được gọi là đa kháng thuốc, các chủng kháng hoàn toàn tất cả các nhóm kháng sinh thử nghiệm là toàn kháng. Có tới 289/331 chủng phế cầu đa kháng kháng sinh, chiếm tỷ lệ lên tới 87,3%. Chỉ có 4 chủng (1,2%) không kháng với tất cả các loại kháng sinh. Có 2 chủng kháng với 13/15 loại kháng sinh. Không có chủng nào kháng với tất cả các loại kháng sinh, đồng nghĩa với tỷ lệ toàn kháng là 0%. Tỷ lệ các chủng đa kháng tập trung chủ yếu ở số loại kháng sinh kháng là từ 4 đến 8 loại kháng sinh. Có mối liên quan chặt chẽ giữa tỷ lệ mang đa gen với tỷ lệ đa kháng kháng sinh. Số chủng không mang gen kháng hoặc mang từ 1-3 gen chỉ tập trung ở số chủng kháng với ít loại kháng sinh hơn. Số chủng mang cả 5 loại gen kháng kháng sinh tỷ lệ thuận với số loại kháng sinh kháng. 100% số chủng mang cả 5 gen kháng trong nhóm có kiểu hình kháng với 12 và 13 loại kháng sinh thử nghiệm. Hình 3.17. Mối liên quan giữa đa kháng và mang đa gen kháng 18 Nguyên nhân dẫn đến tình trạng đa kháng nhiều loại kháng sinh cao chủ yếu do tình trạng lạm dụng kháng sinh phổ biến trong điều trị cũng như trong nông nghiệp, đặc biệt ở những nước khu vực châu Á và ở Việt Nam. Một phần khác do tỷ lệ các chủng kháng penicillin và các chủng mang các typ huyết thanh liên quan đến kháng kháng sinh tăng cao. Các chủng kháng kháng sinh nhóm penicillin thường liên quan đến đa kháng kháng sinh với nhiều nhóm kháng sinh khác. Trong nghiên cứu này tỷ lệ kháng penicillin G lên tới 94,3% (60,7% kháng ở mức độ trung gian và 33,5% kháng hoàn toàn). Đây có thể là nguyên nhân đầu tiên dẫn đến tỷ lệ đa kháng kháng sinh cao. Các typ huyết thanh (23F, 19F, and 6B), thường liên quan đến đa kháng nhiều dòng kháng sinh như kháng penicillin, các cephalosporin phổ rộng, và kháng sinh marolide tại nhiều nước khu vực châu Á giai đoạn trước khi tiêm vắc xin PCVs. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các typ huyết thanh 23F, 19F, 6A/B là phổ biến và chiếm tỷ lệ cao nhất. Đây cũng là nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ đa kháng kháng sinh ở Việt Nam. Như vậy của vắc xin PCVs bao phủ các typ huyết thanh phổ biến này còn có vai trò làm giảm tình trạng đa kháng kháng sinh. 3 4 Mối liên quan giữa typ huyết thanh và tình trạng kháng kháng sinh Bảng 3.17. Tỷ lệ phân bố các gen kháng kháng sinh theo typ huyết thanh có và không có trong vắc xin PCV10 mef pbp1 pbp2 pbp2 Tru pbp- mef erm A+ N a- x- b- ng BĐ A B erm ĐB ĐB ĐB bình B Phân nhóm typ huyết thanh 94,7 97,9 97,9 94,2 42,8 90,5 35,4 79,1 PCV 243 % % % % % % % % 19 non- 74,6 88,1 73,1 28,4 82,1 19,4 65,2 PCV 67 % 91% % % % % % % PCV10 100 98,9 100 98,9 89,2 83,9 73,1 19F 93 % % % % % % % 92% 96,4 100 100 96,4 11,9 100 11,9 73,8 6A/B 84 % % % % % % % % 97,7 97,7 69,1 23F 43 86% % % 86% 14% 93% 9,3% % 87,5 93,8 90,6 87,5 84,4 18,8 69,6 14 32 % % % % 25% % % % non- PCV10 100 100 100 100 100 11 25 % % % % 16% % 16% 76% 15B/ 86,7 86,7 53,3 C 15 60% % % 60% % 60% 20% 61% 100 71,4 19A 10 80% 90% 90% 80% 30% % 30% % Tổng 95.8 95.5 89.1 39.3 86.4 29.6 chung 90% % % % % % % PCV10: Các typ huyết thanh được bao phủ trong vắc xin PCV10 Non- PCV10: Các typ huyết thanh không được bao phủ trong vắc xin PCV10 Nhóm chủng mang typ huyết thanh có trong vắc xin PCV10 mang tỷ lệ gen kháng kháng sinh cao hơn so với nhóm typ không có trong vắc xin. Trong nhóm PCV10 tỷ lệ mang gen pbp từ 94,7%-97,9% trong khi trong nhóm non-PCV10 tỷ lệ này từ 74,6%-88,1%. Tỷ lệ đồng nhiễm cả 3 gen pbp ở nhóm PCV10 là 94,2%, nhóm non-PCV10 là 73,1%. Gen kháng kháng sinh nhóm macrolide cũng tương tự như vậy. Nhóm PCV10 có từ 42,8%-90,5%, nhóm non-PCV10 từ 28,4%-82,1% mang gen mefA hoặc ermB, tỷ lệ đồng 20 nhiễm cả gen tương ứng trong hai nhóm là 35,4% và 19,4%. Tỷ lệ khác biệt này có ý nghĩa thống kê với giá trị p <0,05 (0,013-0,0001). Trong nhóm PCV10, typ huyết thanh 19F và 6A/B có tỷ lệ mang gen kháng kháng sinh cao nhất. Hai typ huyết thanh 19F và 6A/B cũng là hai typ chiếm ưu thế nhất trong các typ huyết thanh tìm thấy ở cả 3 khu vực thuộc nghiên cứu. Khả năng mang gen kháng kháng sinh cao hơn ở typ 19F và 6A/B so với các typ khác và tỷ lệ hai typ này chiếm ưu thế trong nhóm trẻ mắc bệnh do phế cầu cho thấy khi chiến lược sử dụng vắc xin PCV10 được áp dụng sẽ giúp cho trẻ phòng ngừa mắc phế cầu khuẩn, làm giảm sự lưu hành các typ huyết thanh 19F và 6B (được bao phủ trong vắc xin PCV10) trong cộng đồng, điều này sẽ kéo theo làm giảm lưu hành các gen kháng kháng sinh trong cộng đồng. trong nhóm non-PCV10, tỷ lệ mang gen kháng kháng sinh của typ 11 và 19A rất cao, cao nhất là typ 11. 100% số chủng phế cầu có typ huyết thanh 11 mang cả 3 gen đột biến pbp1A, pbp2X, pbp2B và gen ermB. Có từ 80%- 100% số chủng phế cầu có typ huyết thanh 19A mang gen pbp đột biến và 100% mang gen ermB. Những trẻ nhiễm chủng phế cầu có typ huyết thanh không được bao phủ trong huyết thanh sẽ không được bảo vệ nên gia tăng số lượng trong cộng đồng. Typ huyết thanh mang gen kháng kháng sinh sẽ dẫn đến có kiểu hình kháng kháng sinh làm gia tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh. Dưới tác dụng của kháng sinh các cá thể đề kháng được chọn lọc, giữ lại và phát triển thành dòng vi khuẩn đề kháng; dòng vi khuẩn đề kháng mang gen kháng kháng sinh tiếp tục được lan truyền thông qua quá trình vận chuyển di truyền sẽ thay thế các dòng vi khuẩn nhạy cảm, làm cho vi khuẩn ngày càng kháng kháng sinh nhiều hơn và cao hơn. 21 Hình 3. 18. Phân bố các chủng phế cầu kháng kháng sinh theo typ huyết thanh chủ yếu không thuộc vắc xin PCV10 Một mối quan ngại lớn ở các nước đang cân nhắc áp dụng vắc xin cộng hợp phòng phế cầu sẽ dẫn đến sự xuất hiện của bệnh phế cầu do các typ huyết thanh không được bao phủ trong vắc xin. Trong số các typ huyết thanh nổi trội của nhóm non-PCV10, typ 11 có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất, kể cả giá trị trung bình và tỷ lệ cụ thể trong từng loại kháng sinh được thử nghiệm (Hình 3.18). Mặc dù các typ 11 không kháng kháng sinh thế hệ cao (imipenem, ciprofloxacin, cefepim) như