Đề tài Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois

iệc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Đình Thành i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai người thầy của tôi PGS. TS. Nguyễn Bá Mùi và TS. Đỗ Văn Thu người đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật ngiệp vụ (K204) - Bộ Công an đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã dạy dỗ, chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt khóa học và nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, gia đình, bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đặng Đình Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. vi Danh mục bảng ............................................................................................................... vii Danh mục hình ............................................................................................................... viii Danh mục sơ đồ ............................................................................................................... ix Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x Thesis abstract .................................................................................................................. xi Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .............................................................................................................. 2 1.3. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................................ 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Tổng quan về chó Malinois ................................................................................ 3 2.2. Tinh dịch chó ...................................................................................................... 3 2.2.1. Tinh thanh ........................................................................................................... 4 2.2.2. Tinh trùng ........................................................................................................... 4 2.2.3. Hình thái- cấu tạo của tinh trùng. ...................................................................... 4 2.2.4. Đặc tính của tinh trùng chó. ................................................................................ 5 2.3. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó ................................................................ 7 2.3.1. Lượng tinh dịch (Vml) ........................................................................................ 7 2.3.2. Hoạt lực tinh trùng (A%). ................................................................................... 8 2.3.3. Nồng độ tinh trùng (C) ....................................................................................... 9 2.3.4. Tinh trùng kỳ hình (K%) .................................................................................... 9 2.3.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh (V.A.C) .......................... 10 2.3.6. Tỷ lệ tinh trùng sống (Ls%) .............................................................................. 10 iii 2.4. Đặc điểm lý hoá của tinh dịch chó ................................................................... 11 2.4.1. Tỷ trọng của tinh dịch (d). ................................................................................ 11 2.4.2. Áp lực thẩm thấu (posm). ................................................................................. 11 2.4.3. Năng lực đệm của tinh dịch (β). ....................................................................... 11 2.4.4. Độ nhớt của tinh dịch.(η) .................................................................................. 11 2.4.5. pH của tinh dịch. ............................................................................................... 11 2.5. Nguyên tắc xây dựng môi trường đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó ................. 12 2.6. Nghiên cứu môi trường đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó ................................. 13 2.7. Thụ tinh nhân tạo cho chó ................................................................................ 15 2.7.1. Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh. .................................................. 15 2.7.2. Các chu kỳ động dục của chó cái. .................................................................... 16 2.7.3. Thụ tinh nhân tạo. ............................................................................................. 17 2.8. Tình hình phát triển và sử dụng chó malinois tại Việt Nam ............................. 19 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 20 3.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 20 3.2. Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 20 3.3. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 20 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 21 3.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois ..................................................................................................... 21 3.4.2. Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C.................................................. 21 3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh .............................................................. 21 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22 3.5.1. Phương pháp lấy tinh ........................................................................................ 22 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó .............................................. 22 3.5.3. Nghiên cứu môi trường bảo tồn ........................................................................ 23 3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 29 Phần 4. Kết quả vào thảo luận ..................................................................................... 30 4.1. Sinh học tinh dịch chó Malinois ....................................................................... 30 4.1.1. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois ............................................ 30 iv 4.1.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois .................................................... 35 4.2. Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và ứng dụng sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh bảo tồn ở -196c ................................... 36 4.2.1. Tính chất hóa - lý của một số môi trường đông lạnh tinh dịch ........................ 36 4.2.2. Ảnh hưởng của glycerol và dimethyl sulfoxide (DMSO) lên chất lượng tinh đông lạnh ................................................................................................... 36 4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh ..................... 38 4.2.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh ......................................................................................... 40 4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh .......................................................................................................... 41 4.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh ................... 43 4.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh ....................... 44 4.2.8. Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó .................................................. 46 4.2.9. Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh .................. 49 4.3. Kết quả thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois ..................................................... 51 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................... 53 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 53 5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 53 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 54 Phụ lục .......................................................................................................................... 57 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt  Độ nhớt  Năng lực đệm A Hoạt lực tinh trùng C Nồng độ tinh trùng D Tỷ trọng DMSO Dimethyl sulfoxide K Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình OEP Orvus ES Paste Posm Áp lực thẩm thấu SL Tỷ lệ tinh trùng sống TTNT Thụ tinh nhân tạo V Lượng tinh dịch V.A.C Tổng số tinh trùng tiến thẳng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Malinois (n=54) .............................. 31 Bảng 4.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois (n= 54) ................................... 35 Bảng 4.3. Một số tính chất hoá - lý của các môi trường đông lạnh tinh dịch (n=20) ........................................................................................................... 36 Bảng 4.4. So sánh ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên chất lượng tinh dịch (n=54) ........................................................................................................... 37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol trong môi trường lên chất lượng tinh đông lạnh (n=54) .......................................................................................... 39 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên chất lượng tinh chó đông lạnh (n=30) ................................................................. 40 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh (n=30)................................................................................... 42 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh (n=30) ........................................................................................................... 43 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượng tinh đông lạnh – giải đông (n=40)................................................................ 44 Bảng 4.10. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) ................................. 47 Bảng 4.11. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh (n=30) .......................... 48 Bảng 4.12. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) ........................ 49 Bảng 4.13. Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 0 196 C (n=16) ................................................................................................ 49 Bảng 4.14. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 0 196 C (n=16) ................................................................................................ 50 Bảng 4.15:. Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Malinois đông lạnh ...................... 52 vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Chó Malinois đực tham gia nghiên cứu ....................................................... 20 Hình 4.1. Tinh trùng sống - chết .................................................................................. 33 Hình 4.2. Tinh trùng kỳ hình của chó Malinois ........................................................... 34 Hình 4.3. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ..... 38 Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên hoạt lực tinh trùng trước và sau đông lạnh ...................................................................................................... 39 Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ............................................................................... 41 Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước khi đông lạnh lên hoạt lực tinh trùng ...................................................................................................... 42 Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên hoạt lực của tinh trùng ................... 44 viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Quy trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ ....... 29 Sơ đồ 4.1. Quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois ................................................ 46 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đặng Đình Thành Tên Luận văn: “Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois” Ngành: Chăn nuôi Mã số: 60.62.01.05 Tên cơ sở đào tạo : Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xây dựng công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịnh chó Malinois, phục vụ thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gene. Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an. Sử dụng 07 chó Malinois đực và 10 chó Malinois cái. Chó đực trong độ tuổi từ 1,5 – 3 tuổi, khỏe mạnh; chó cái từ 2 - 3 tuổi, đã đẻ 1 – 2 lứa, khỏe mạnh. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois. - Nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Malinois và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196C. - Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh. Phương pháp nghiên cứu - Theo phương pháp của Chemineau (1991) để đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois: Lượng tinh dịch (V), Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C), Tỷ lệ tinh trùng sống (LS), Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K). - Môi trường đông lạnh tinh dịch chó bao gồm: Tris(hydroxylmethyl), citric acid, fructosse, lactose, raffinose, lòng đỏ trứng, glycerol, streptomycin, penicillin và nước cất hai lần. Kết quả chính và kết luận - Chọn được môi trường 1 làm môi trường đông lạnh phù hợp với tinh dịch chó Malinois. - Đã sản xuất và bảo tồn được 219 liều tinh chó Malinois đông lạnh cọng rạ (hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 38 - 40%). Tinh chó đông lạnh có chất lượng ổn định trong thời gian bảo tồn ở nitơ lỏng -1960C. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Đang Đinh Thanh Thesis title: “Research technology preserving frozen semen Malinois dogs” Major: Aliman Sciece Code: 60.62.01.05 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives : Construction technology conservation frozen semen Malinois dog, served artificial insemination and genetic resource conservation. Materials and Methods Malinois dog breeding at the Police management Department management, training and professional animal use (K204) - The Ministry of Public Security. Malinois dogs used 07 male and 10 female Malinois dogs. Males aged 1.5 to 3 years old, healthy; bitch from 2-3 years old, was laying 1-2 litters, healthy. Research content Evaluation of biological indicators of chemical and physical properties of semen Malinois dogs. - Technology research Malinois dog frozen semen and sperm production applications preserved frozen dog in -196C. - Production of frozen crystals Malinois dogs. Methods: According to the method of Chemineau (1991) to evaluate biological indicators of chemical and physical properties of the Malinois dog semen: semen volume (V), sperm motility (A), sperm concentration (C), total sperm straight (VAC), Proportion of live sperm (LS), sperm abnormality Ratio (K). - The semen extender was used for freezing containing: Tris (hydroxylmethyl) aminomethane, citric acid, fructosse, lactose, raffinose, egg yolk, glycerol, streptomycin, penicillin and bidistilled water. Main findings and conclusions - Select one the freezing extender for Malinois dog semen. - Has the production and conservation are 219 frozen semen straws Malinois dogs (motile sperm frozen after 38-40%). Dog frozen crystals with stable quality during conservation in liquid nitrogen -196C. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Malinois là giống chó chăn cừu của Bỉ có ngoại hình khá giống chó chăn cừu của Đức nên thường được gọi là Berger Bỉ. Giống chó này linh hoạt và có chỉ số thông minh cao. Chúng được lực lượng Cảnh sát huấn luyện, sử dụng vào các chuyên khoa như: bảo vệ - truy tìm dấu vết hơi, giám biệt mùi hơi người, lùng sục phát hiện các chất đặc định (ma túy, thuốc nổ), tìm kiếm cứu nạn, chống khủng bố... Chó Malinois mới được nhập khẩu vào nước ta khoảng 4 năm gần đây. Sau một thời gian nuôi dưỡng, huấn luyện chó Malinois được đánh giá là thích hợp với điều kiện của Việt Nam. Hiện nay, nhu cầu sử dụng chó Malinois vào mục đích an ninh, quốc phòng tương đối lớn. Tuy nhiên, giá thành nhập khẩu của giống chó này cao, đồng thời mất nhiều chi phí cho việc nuôi thích nghi sau khi nhập về. Hiện nay, tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an đang nuôi dưỡng một đàn chó Malinois thuần chủng. Ở ngoài dân, cũng có 1 số lượng chó Malinois được nuôi dưỡng sử dụng cho việc bảo vệ và làm kinh tế. Tuy nhiên, do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát và phối giống thiếu kiểm soát đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó này. Công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và phương pháp thụ tinh nhân tạo cho chó được cho là giải pháp hiệu quả với những khó khăn trong công tác lưu giữ và phát triển đàn chó thuần chủng đã được các nhà khoa học thuộc Phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học tiến hành nghiên cứu từ những năm 2005. Trải qua hơn 1 thập kỉ nghiên cứu và phát triển, các nhà khoa học đã nhận được những kết quả nghiên cứu khả quan và từng bước đang hoàn thiện những kết quả nghiên cứu của mình. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu về đông lạnh tinh dịch chó hiện đang áp dụng chung cho một số giống chó nghiên cứu như: Berger (Đức), Labrado, Cooker, Phú Quốc... Do vậy, việc nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ đông lạnh tinh dịch cho từng giống chó là rất cần thiết để có thể nâng cao hiệu quả của việc lưu giữ và bảo tồn tinh dịch chó. 1 Việc phát triển đàn chó Malinois thuần chủng có chất lượng cao là vấn đề cấp thiết và đang được quan tâm đặc biệt bởi các đơn vị an ninh, quốc phòng. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài. “Nghiên cứu công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịch chó Malinois” 1.2. MỤC TIÊU Xây dựng công nghệ đông lạnh bảo tồn tinh dịnh chó Malinois, phục vụ thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gene. 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu có hệ thống một số đặc điểm sinh học tinh dịch và một số tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Malinois. - Xây dựng môi trường và quy trình đông lạnh tinh cọng rạ của chó Malinois. Từ đó nâng cao hiệu quả của việc bảo tồn tinh dịch chó Malinois đồng thời góp phần phát triển đàn chó Malinois có chất lượng cao phục vụ công tác an ninh, quốc phòng. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ CHÓ MALİNOİS Malinois là giống chó được đặt tên theo thành phố Malines của Bỉ. Nó là một trong bốn loài chó chăn cừu của Bỉ: Chó Malinois linh hoạt và có chỉ số thông minh cao, vượt trội trong những công việc như truy tìm ma túy, phát hiện bom mìn, vật liệu nổ, bảo vệ, canh gác, tìm kiếm cứu nạn, chăn gia súc, kéo xe, kéo vật nặng, dẫn đường cho người khiếm thị và hỗ trợ người khuyết tật. Chó Malinois có một cơ thể vuông vắn: chó đực cao từ 61 - 66 cm, trọng lượng khoảng 25 – 30 kg; chó cái cao 56 – 61 cm, trọng lượng khoảng 20 –25 kg. Ngực sâu, lưng hơi thoải dần từ vai xuống, kích cỡ toàn bộ đầu thủ phù hợp với cơ thể, hộp sọ phẳng với độ dài và rộng tương đồng nhau. Mõm hơi nhọn và dài bằng chiều dài của hộp sọ, mặt hơi gãy, mũi đen và cặp môi khít, mắt nâu, tai dựng hình tam giác, đuôi khỏe xương đuôi tiến tới sát khuỷu chân sau, bàn chân hình như chân mèo. Chó Malinois có bộ lông kép ngắn, thẳng chống chịu được thời tiết khăc nhiệt, màu lông có thể là nâu sẫm tới đỏ, màu gụ tới đen. Mặt và tai màu đen. Bộ lông mượt và ngắn của Malinois dễ chăm sóc, thường thay lông theo mùa, hai lần trong năm (mùa hè và mùa đông). Tuổi thọ của chó Malinois khoảng từ 12 - 14 năm, lứa đẻ trung bình 06 - 10 con. Giống chó này khỏe mạnh, cứng cáp không có những vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe nào. Chó Malinois có thể biểu hiện hành vi chăn gia súc một cách bản năng như rượt đuổi và chạy quanh, di chuyển dễ dàng trong nhiều giờ. 2.2. TINH DỊCH CHÓ Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục đực khi con đực thực hiện thành công phản xạ sinh dục. Tinh dịch được sinh ra ở dịch hoàn và nó được hoàn thiện chức năng ở mào tinh, giữ lại ở đó. Tinh dịch gồm hai phần: Tinh thanh chiếm 95-97% và tinh trùng chiếm 3-5%. 3 2.2.1. Tinh thanh Tinh thanh là hỗn hợp những chất lỏng được tiết ra từ các tuyến sinh dục phụ, nó không giống dịch thể của cơ thể. Tinh thanh chủ yếu là nước. Tuỳ theo từng loại gia súc khác nhau mà lượng nước khác nhau. Tinh thanh có tác dụng rửa tuyến niệu đạo sinh dục, đóng cửa cổ tử cung, kích thích cơ quan sinh dục của con cái hoạt hoá, nuôi sống tinh trùng ngoài cơ thể. Thành phần chất tiết của các tuyến sinh dục phụ cũng như thứ tự tiết của chúng trong phóng xạ phóng tinh có ý nghĩa sinh lý đặc biệt. Đầu tiên tuyến cầu liệu đạo tiết, thứ đến tinh trùng cùng với chất tiết của tuyến tiền liệt, và tinh hoàn phụ, cuối cùng là chất tiết của tuyến tinh nang. Tuyến tiền liệt ở chó rất phát triển. Tuyến tiền liệt có những lỗ đổ vào niệu đạo, dịch tiết của tuyến không trong suốt, có tính kiềm nhằm tác dụng trung hoà độ axit trong lòng niệu đạo và H2CO3 do tinh trùng sản sinh ra trong quá trình hoạt động. Tuyến tinh nang tiết ra một thứ keo màu trắng hoặc vàng chứa men Vegikinaza và globulin. Chất keo này gặp dịch tiết của tuyến tiền liệt thì kết lại tạo ra một cái nút để đóng cổ tử cung sau quá trình giao phối trực tiếp. Mục đích không cho tinh trùng chảy ngược ra ngoài. Trong thụ tinh nhân tạo người ta nhanh chóng lọc bỏ keo phèn đó vì nếu không nó sẽ hấp thụ nước và một số lượng lớn tinh trùng làm tinh trùng bị kết dính. Trong dịch tiết này còn có cả đệm phosphate và carbonate là hợp chất quan trọng vì chúng giữ tinh dịch được ổn định. 2.2.2. Tinh trùng Tinh trùng được sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn. Tinh trùng là tế bào sinh dục đực (đây là tế bào duy nhất có khả năng tự vận động) đã hoàn chỉnh về hình thái, cấu tạo và đặc tính sinh lý, sinh hoá học bên trong và có khả năng thụ tinh. Nói cách khác tinh trùng là tế bào sinh dục đực đã qua kỳ phân chia giảm nhiễm, đã thành thục và có khả năng thụ tinh. 2.2.3. Hình thái- cấu tạo của tinh trùng. Hình thái tinh trùng của chó nói chung có dạng con nòng nọc. Chiều dài đầu gấp đôi chiều rộng và bề dày không đáng kể. Tinh trùng gồm 3 phần khác nhau: Đầu, cổ- thân, đuôi 4 * Phần đầu Trong màng trên cùng của đầu là hệ thống acrosom Phần trước của đầu được bao phủ một mũ mỏng, tức bao đầu (Galea Capitis). Dưới lớp này có cấu tạo hình dải gọi là thể ngọn. Trong bao đầu tập trung enzyme hyaluronidara, enzyme này giúp tinh trùng chui qua màng phóng xạ của trứng trong quá trình thụ tinh. Khi bảo tồn, hệ thống acrosom dễ bị trương phồng lên, rời khỏi đầu tinh trùng, làm tinh trùng mất khả năng thụ tinh, nhất là trong môi trường nhược trương. Sau hệ thống acrosom là nhân tinh trùng. Nhân chiếm 76,7-80,3%, nó là kho duy nhất chứa nhân tố di truyền của con đực. * Phần cổ- thân Phần cổ thân dính với phần đầu rất lỏng lẻo, điều đó phù hợp với quá trình thụ tinh là khi xâm nhập vào trứng thì cổ bị gẫy và đuôi rơi ra. Nhưng chính vì nó dễ bị đứt bởi tác động cơ giới, nhiệt và hoá chất dẫn đến giảm tỉ lệ thụ tinh hoặc tinh trùng không có khả năng thụ tinh. * Phần đuôi Bao quanh phần đuôi là màng chung của tinh trùng. Cấu tạo của đoạn đuôi gồm 2 sợi dọc ở trung tâm và 9 đôi sợi dọc khác bao quanh, ngoài ra còn có sợi xoắn, các sợi này được xếp theo như vòng tròn đồng tâm. Ở phía trên xếp mau hơn, to hơn và chúng được duỗi ra ở phần đuôi tạo thành chùm tơ đuôi. Chùm tơ đuôi không bi màng bao phủ, chúng được tự do hoạt động như một mái chèo giúp tinh trùng vận động. 2.2.4. Đặc tính của tinh trùng chó. a. Đặc tính chuyển động: Đuôi ngoằn ngoèo uốn khúc dao dộng gây xung động để tự tiến tới trước. Ngoài tinh trùng có đầu giống như quả lê nên tự nó chuyển động quanh trục của thân nó. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự quay của trục giữa làm cho tinh trùng có khả năng vận động. + Các phương thức vận động: 5 -Vận động tiến thẳng: Đây là phương thức vận động đặc trưng của tinh trùng, có vectơ chuyển động không thay đổi. Chỉ có những tinh trùng chuyển động tiến thẳng mới có khả năng thụ tinh cho nên chỉ tiêu vận động tiến thẳng chính là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh trùng. -Vận động xoay tròn: Đây là phương thức hoạt động với vectơ chuyển động thay đổi, do vậy chúng không có khả năng gặp được tế bào trứng trong đường sinh dục cái. -Vận động lắc lư: Đây là phương thức hoạt động không có vectơ, đó là tinh trùng vận động lắc lư tại chỗ, sức sống yếu nên cũng không có khả năng thụ tinh. b. Đặc tính lội ngược dòng nước: Tinh trùng chuyển động được nhờ đuôi lái, do đó nó có thể chuyển động ngược dòng nước và cũng có xu hướng lội ngược dòng nước. c. Đặc tính tiếp xúc: Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính bao vây xung quanh vật lạ ấy d. Đặc tính tiếp xúc với hoá chất: Trong ống dẫn trứng có tiết ra chất hoá học, kích thích tinh trùng hưng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hoá học này là chất fertilizing. e. Đặc tính tiếp xúc với điện: Trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ cao tới thấp nên tinh trùng chuyển động có phương hướng nhất định. f. Khả năng trao đổi chất: Sự trao đổi chất điển hình trong tinh trùng gồm có 2 phần: Glycose và hô hấp + Glycose: pH tinh dịch bảo tồn trong invitro giảm dần theo thời gian, đó là vì tinh trùng phân huỷ fructose trong tinh thanh để tạo axit lactic, axit lactic được sản sinh theo con đường Ebden-meyerhof. 6 Trong điều kiện yếm khí một số axit lactic được sản sinh ra và đi vào chu trình tricacbonxylic và được phân huỷ thành cacbonic và nước. Chỉ số phân huỷ fructose được sử dụng để đánh giá chất lượng tinh dịch. + Hô hấp: Tinh trùng nhận năng lượng chủ yếu thông qua hô hấp trong điều kiện hiếu khí. Quá trình hô hấp của tinh trùng chủ yếu là sử dụng oxy để đốt cháy cơ chất có trong bản thân nó hoặc sẽ oxy hoá triệt để hơn đường có trong tinh dịch. 2.3. MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ Nghiên cứu các đặc điểm sinh học tinh dịch của chó có vai trò rất quan trọng, là cơ sở khoa học để pha chế các môi trường pha loãng và đông lạnh. Căn cứ vào các chỉ tiêu sinh học tinh dịch, có thể đánh giá phẩm chất tinh dịch, giúp tuyển chọn được đực giống có phẩm giống tốt phục vụ cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn quỹ gen. Nghiên cứu về đặc điểm tinh dịch chó, Kojima (2001) đã nhận thấy rằng: thể tích tinh dịch và tổng số tinh trùng trong một lần lấy tinh thấp, nhưng nồng độ tinh trùng, hoạt lực, sức sống và hình thái của tinh trùng chó là tương đương với các loài khác. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch đã được nghiên cứu: pH 7,6; thể tích tinh dịch 0,212 ml; nồng độ tinh trùng 361 triệu/ ml; tổng số tinh trùng 84 triệu/ ml; hoạt lực tinh trùng 77 %; sức sống tinh trùng 77 %; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 11 % (Đỗ Văn Thu, 2010). 2.3.1. Lượng tinh dịch ...h đông lạnh - Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và DMSO lên chất lượng tinh đông lạnh. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh - Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh. 3.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch và tốc độ đông lạnh giải đông lên chất lượng tinh đông lạnh - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh. - Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh. - Nghiên cứu tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) tinh chó đông lạnh. 3.4.3. Sản xuất tinh chó Malinois đông lạnh 3.4.3.1. Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -1960C - Đánh giá chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C thông qua các chỉ tiêu: hoạt lực của tinh trùng, sức sống của tinh trùng sau giải đông và ủ ở 37C, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. 21 3.4.3.2. TTNT cho chó Malinois để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được - Thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh. - Đánh giá khả năng sinh sản của chó cái được TTNT. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp lấy tinh Sau khi xem xét, lựa chọn chó Malinois đực đạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch. Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối trực tiếp ít nhất là 03 ngày trước thời điểm lấy tinh. Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh. Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau: - Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh. - Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này. - Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực. Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha khác thì bỏ qua. 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó 3.5.2.1. Lượng tinh dịch (V) Theo phương pháp của Chemineau (1991), xác định thể tích tinh dịch qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia độ, đặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của mặt tinh dịch. 3.5.2.2. Hoạt lực tinh trùng (A) Theo phương pháp của Chemineau (1991), sức hoạt động được tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát được. 22 3.5.2.3. Nồng độ tinh trùng (C) Theo phương pháp của Chemineau (1991), dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha loãng hồng cầu. Pha loãng tinh dịch 100 - 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 - 1,0 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101). 3.5.2.4. Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C) Theo John B.Herrick and Self (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml) x nồng độ tinh trùng/ml x hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%) (Đỗ Văn Thu, 2010). 3.5.2.5. Tỷ lệ tinh trùng sống (LS) Theo phương pháp của Chemineau (1991). Dung dịch nhuộm: Eosin: 1g; Nigrosin: 2g; Natri – citrate: 5,5g; H20: 3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml. pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp suất thẩm thấu 310 miliosmol/kg. 3.5.2.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) Theo phương pháp của William (1921), kết hợp vơi phương pháp Cheminau (1991) (Đỗ Văn Thu, 2010). 3.5.3. Nghiên cứu môi trường bảo tồn 3.5.3.1. Xác định pH Đo bằng giấy đo pH của Trung Quốc hoặc máy đo pH Mettler 320. 3.5.3.2. Áp lực thẩm thấu (posm) Đo bằng máy đo áp lực thẩm thấu (Osmometre), đơn vị: miliosmol/kg 3.5.3.3. Tỷ trọng (d) Dùng bình đo tỷ trọng (picrometre). Công thức tính: M d = Mo Trong đó: d: tỷ trọng M: khối lượng chất lỏng cần đo cùng thể tích M0: khối lượng nước cất 2 lần 23 3.5.3.4. Độ nhớt (  ) Sử dụng nhớt kế Oswald hoặc micropipet, xác định độ nhớt ở 200C. Công thức tính: d.t  = do .t o Trong đó: : độ nhớt tương đối so với nước cất 2 lần d0: tỷ trọng nước cất 2 lần d: tỷ trọng chất lỏng cần đo t0: thời gian chảy của nước cất qua phần phình hoặc qua mao quản t: thời gian chảy của chất lỏng qua phần phình hoặc qua mao quản. 3.5.3.5. Năng lực đệm ( ) Theo phương pháp của Salisbury (1978), đối với HCl 0,1N, dùng một lọ con khô, sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10 ml. Cho vào đó 1 ml (hoặc 0,5 ml) chất lỏng cần kiểm tra, đo pH chất lỏng. Dùng ống hút vi lượng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho đến khi pH = 4,0. Ghi lại độ chênh lệch pH (dpH). Công thức tính: a.n.1000   100 dpH.v Trong đó: : Năng lực đệm tính trong 1000 lít chất lỏng a: Lượng axit đã dùng (lượng HCl 0,1N ) n: Đương lượng gam của axit HCl 0,1N dpH: Chênh lệch pH trước và sau sử lý v: Lượng chất lỏng đã dùng 3.5.3.6. Môi trường đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C - Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol. 24 - Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng đỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13% (v/v) Glycerol. 3.5.3.7. Đông lạnh tinh dịch chó ở -1960C Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất: a. Dụng cụ: Các dụng cụ cần thiết gồm: dụng cụ pha môi trường, thu nhận tinh dịch, kiểm tra tinh dịch. Dụng cụ pha môi trường: các ống đong, bình tam giác có thể tích tương ứng với lượng môi trường cần pha, đũa thuỷ tinh. Dụng cụ thu nhận tinh dịch: cốc hứng tinh, các lọ thu mẫu bằng thuỷ tinh có thể tích 20 - 30 ml, các pipet pasteur nhựa, pipet thuỷ tinh 5 ml, nhiệt kế có thang đo 1000C. Dụng cụ kiểm tra tinh dịch: kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 đến 1000 lần, lam kính, lamen, bộ đếm hồng cầu, các ống eppendorf 1,5ml. Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất sau đó bằng cồn, và sấy khô. Các dụng cụ bằng nhựa được rửa sạch, tráng bằng nước cất và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên. b. Hoá chất: Tris(hydroxymethyl)aminomethane, citric acid, fructose, Raffinose, penicillin, streptomycin, glycerol, lòng đỏ trứng gà, nước cất hai lần, eosin 5%, dung dịch nước muối sinh lý 0.85%, dung dịch nước muối 3%, cồn sát trùng 70%. Pha môi trường đông lạnh Chuẩn bị môi trường đông lạnh: môi trường đông lạnh có các thành phần gồm: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml. Để pha môi trường, nước cất hai lần được đun cách thuỷ đến sôi. Pha tris, citric acid, fructose với lượng nước vừa đủ, dùng đũa thuỷ tinh đánh tan, để nguội, sau đó bổ sung các kháng sinh, lòng đỏ trứng gà và dùng khuấy từ khuấy đều trong 30 phút. Sau khi pha, môi trường được chia làm 2 phần (môi trường A và môi trường B), 25 môi trường B được bổ sung glycerol với nồng độ 13 % (v/v) sau đó tiếp tục dùng khuấy từ khuấy đều trong 45 phút (chú ý: không khuấy quá mạnh để không làm chín lòng đỏ trứng). Môi trường sau khi pha được bảo quản ở 40C. Thu nhận tinh dịch Cần thiết có tối thiểu 1 người tham gia lấy tinh dịch và 1 người sẵn sàng kiểm tra mẫu. Tinh dịch được thu nhận bằng phương pháp massage, tinh được phóng trực tiếp vào cốc thuỷ tinh đã làm ấm ở 340C. Chỉ thu tinh dịch ở pha thứ hai của quá trình xuất tinh (pha giàu tinh trùng nhất). Kiểm tra tinh dịch Ngay sau khi thu nhận, tinh dịch được ghi lại thể tích trên cốc hứng tinh, chuyển tinh dịch vào cốc đựng mẫu, đưa vào nước ấm 340C đã chuẩn bị sẵn. Kiểm tra ngay pH của tinh dịch bằng giấy đo pH (pH của tinh dịch chó ổn định và dao động trong khoảng 6,5 - 7,0. Khi pH tinh dịch nằm ngoài khoảng dao động đó, tinh dịch thường có chất lượng không tốt). Kiểm tra hoạt lực tinh trùng tiến thẳng: một giọt tinh dịch được lấy ra và nhỏ lên lam kính, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi kiểm tra ở độ phóng đại 100 và 400 lần. Hoạt lực được đánh giá theo phần trăm, với thang điểm 100%. Kiểm tra nồng độ tinh trùng: tinh dịch được pha loãng 200 lần với dung dịch NaCl 3% bằng ống trộn hồng cầu và được đếm ngay, sử dụng buồng đếm Newbouer. Tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: lấy một giọt tinh dịch được nhuộm bằng thuốc nhuộm eosin, làm tiêu bản quét. Tỷ lệ tinh trùng sống được đếm ngay lập tức trong vòng 1 - 2 phút sau khi nhuộm, đếm tối thiểu 200 tinh trùng có trên tiêu bản. Sau 2 phút, không nên đếm tiếp vì có thể sẽ không còn chính xác. Tiêu bản kỳ hình được làm cùng với tiêu bản sống chết, nhưng được để lại kiểm tra trong thời gian ủ mẫu ở 40C. Pha loãng tinh dịch với môi trường Sau khi đã xác định được nồng độ tinh dịch, pha loãng tinh dịch với môi trường A đã được cân bằng nhiệt trong cùng bể nước ấm ủ tinh dịch ở 34oC. Khi pha môi trường nên để môi trường chảy từ từ theo thành cốc đựng mẫu và lắc nhẹ cốc để tinh dịch hoà tan vào môi trường một cách từ từ. Lượng môi trường được tính toán để sao cho trong một cọng rạ có tổng số khoảng 150 triệu tinh trùng. Cốc 26 chứa tinh đã pha loãng được đặt vào trong một cốc khác có chứa nước được lấy từ chính bể cân bằng tinh dịch và được chuyển vào tủ bảo ôn ở nhiệt độ 40C. Chú ý: tất cả các thao tác kiểm tra tinh dịch và pha loãng nên được làm trong khoảng từ 5 - 10 phút. Các bước chuẩn bị và đông lạnh tinh dịch chó Bước 1. In cọng rạ Đưa cọng rạ vào máy in, các thông số trên cọng rạ gồm: giống, tên (số hiệu), nơi lấy tinh, ngày sản xuất tinh, nơi sản xuất. Bước 2. Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40 C trong 2 giờ. Sau đó bổ sung môi trường B và tiếp tục ủ thêm 2 giờ. Bước 3. Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ: Đưa cọng rạ đã được in số liệu vào máy, sau đó đưa tinh pha loãng của những con có số hiệu tương ứng lên máy lắc từ và để máy đóng cọng tự động. Sau khi nạp tinh, các cọng rạ được xếp lên khay và đưa ngay vào tủ cân bằng ở 40C. Bước 4. Ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt độ 40 C trong thời gian 3 giờ. Bước 5. Đông lạnh tinh cọng rạ: Nhiệt độ buồng đông lạnh được hạ dần xuống -165oC trong 10 phút. Bước 6. Thả tinh cọng rạ ở -1650C vào nitơ lỏng -1960C. Tinh cọng rạ được đựng trong các ống. Tinh cọng rạ sau 24 giờ bảo tồn trong nitơ lỏng, một cọng rạ được lấy ra một cách ngẫu nhiên từ mỗi mẫu tinh để giải đông và đánh giá hoạt lực tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ tinh sống của tinh trùng Bước 7. Giải đông tinh cọng rạ ở nước ấm 370C trong khoảng 30 giây - 60 giây. Bước 8. Kiểm tra chất lượng định kỳ: tinh cọng rạ bảo tồn ở -196 0C được kiểm tra sau 1 tháng, sau 3 tháng và sau 4 tháng . 3.5.3.8. Phương pháp TTNT chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh a. Dụng cụ, hoá chất và vật liệu - Súng bắn tinh. - Vaseline. - Cồn khử trùng 70%. - Nitơ lỏng và hộp đựng, panh sắt, kéo - Tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng ở -1960C. 27 - Nước ấm 370C. - Đồng hồ bấm giờ. - Nhiệt kế có thang độ 100. - Các thiết bị khác phục vụ cho giải đông, đánh giá chất lượng tinh dịch và thụ tinh nhân tạo. b. Tiến hành - Kiểm tra chất lượng tinh dịch trước khi sử dụng thụ tinh nhân tạo (chỉ sử dụng tinh dịch có hoạt lực tinh trùng sau giải đông ≥ 30%). - Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông bằng cách nhúng vào nước ấm ở 370C trong 1 phút. - Lắp cọng rạ vào súng bắn tinh đã được khử trùng bằng cồn 70% và được bôi trơn bằng vaseline. Thao tác thụ tinh nhân tạo Giữ chó cái ở tư thế đứng, toàn bộ thân tạo thành một đường thẳng, điều này giúp cho việc đưa súng bắn tinh vào tử cung một cách dễ dàng. Tay thuận cầm súng bắn tinh, tay còn lại kích thích nhẹ vào âm đạo của chó cái. Tay thuận đưa súng bắn tinh vào âm đạo. Hướng súng bắn tinh chết từ dưới lên trên với góc 45 độ, sau khi đưa được súng bắn tinh vào âm đạo, súng bắn tinh có hướng song song với lưng của chó cái, tay kia vẫn kích thích nhẹ nhàng vào âm đạo. Súng bắn tinh được đưa vào khoảng 15-30 cm thì gặp cổ tử cung (cảm giác khựng lại do gặp cổ tử cung). Thao tác nhẹ nhàng đưa đầu súng bắn tinh qua cổ tử cung. Tiếp theo đó tay kia cố định súng bắn tinh ở điểm gần âm đạo, tay thuận nhẹ nhành đẩy tinh dịch trong cọng rạ vào trong tử cung của chó cái. Sau đó nhẹ nhàng đưa súng bắn tinh ra khỏi âm đạo, vỗ nhẹ vào hông để tạo phản xạ đóng cổ tử cung, tránh tinh dịch chảy ra ngoài. Theo dõi chó cái đã phối giống. Sau một tháng phối giống, khám thai cho chó. Toàn bộ qui trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây: 28 QUY TRÌNH THỤ TINH NHÂN TẠO CHÓ SỬ DỤNG TINH ĐÔNG LẠNH Giải đông tinh cọng rạ bằng 0 Chuẩn bị dụng cụ nước ấm 37 C trong 1 phút thụ tinh nhân tạo A ≥ 30% Lắp tinh cọng rạ vào Khử trùng và bôi vaseline súngbắn tinh cho súng bắn tinh Dẫn tinh cho chó cái Theo dõi chó cái thụ tinh nhân tạo sau phối giống Sơ đồ 3.1. Quy trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ 3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo chương trình phần mềm Excel 2007 và minitab 16.0. 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN 4.1. SINH HỌC TINH DỊCH CHÓ MALINOIS 4.1.1. Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó Malinois trình bày ở bảng 4.1, cho thấy: 4.1.1.1. Thể tích tinh dịch Thể tích tinh dịch chó ít và khác nhau giữa các cá thể trong cùng giống chó Malinois và giữa các lần khai thác tinh. Thể tích tinh dịch trung bình của giống chó Malinois là 1,94 ml. Trong đó, chó Ken có thể tích tinh dịch cao nhất (2,58 ml), thấp nhất là chó Kaido (1,3 ml). Các chó: Ken (2,58ml), Zon (2,05 ml), Fido (2,17ml), Miki (2,46 ml) cao hơn có ý nghĩa so với Kaido (1,3 ml), Cori (1,65ml) và Nick (1,35 ml). Thể tích tinh dịch chó Malinois trong nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với nghiên cứu của Riselaere et al. (2002), thể tích tinh dịch chó thu được trong một lần lấy tinh là 3,9 ml. Tuy nhiên, thể tích tinh dịch phụ thuộc vào lượng tinh thanh. Vì vậy, thể tích tinh dịch chó Malinois thu được không phản ảnh rõ phẩm chất tinh dịch. Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy: nếu mẫu tinh dịch chứa nhiều tinh thanh thì phẩm chất tinh dịch thường kém. 4.1.1.2. Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc nhiều vào chế độ dinh dưỡng, chăm sóc, tần suất khai thác tinh dịch và đặc biệt phụ thuộc vào sự thay đổi thời tiết (nhiệt độ và ẩm độ), sự thay đổi thời tiết giữa các mùa. Trong cùng giống chó Malinois, các cá thể khác nhau thì hoạt lực tinh trùng khác nhau. Các chó nghiên cứu thì chó Ken, Cori, Fido, Miki, hoạt lực tương ứng là 75,21%; 73,58%; 74,09; 74,02 cao hơn không có ý nghĩa (P >0,05) so với các chó Kaido (70,45%), Zon (72,09%) và Nick (71,42%). Kết quả chúng tôi thu được về hoạt lực tinh trùng tiến thẳng của chó Malinois thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả của Riselaere và Cộng sự (2002), hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng chó là 78,7%. 30 Bảng 4.1. Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Malinois (n=54) Tên chó Kaido Ken Zon Cori Fido Nick Miki Trung bình V (ml/lần) 1,30a ± 0,20 2,58b± 0,52 2,05b ± 0,34 1,65c ± 0,75 2,17b ± 0,45 1,35a ± 0,21 2,46b± 0,50 1,94 ± 0,45 A (%) 70,45 ± 3,75 75,21 ± 8,17 72,09 ± 7,07 73,58 ± 9,22 74,09 ± 6,21 71,42 ± 3,64 74,02 ± 8,25 72,86 ± 7,07 C(Triệu/ml) 240,48 ±14,15 241,30 ± 9,25 250,16± 9,18 265,73 ± 20,14 253,52± 7,89 245,43 ±14,52 239,30 ± 9,18 245,53 ± 10,66 V.A.C(Triệu/lần) 211,70a ± 24,16 445,28b ± 30,53 369,70b ± 22,6 322,62c ± 26,06 372,70b ± 19,5 215,77a ± 24,37 439,28b ± 30,09 329,42 ± 25,73 SL (%) 79,63 ± 27,34 85,44 ± 19,25 79,22 ± 13,52 87,61 ± 11,30 78,29 ± 13,17 80,35 ± 27,28 84,36 ± 29,22 81,55 ± 20,34 K (%) 18,45a ± 9,22 17,45a ± 6,28 20,02b ± 8,30 18,85a ± 5,97 20,56b ± 7.59 18,64a ± 9,17 17,52a ± 6,42 18,85 ± 7,47 Ph 6,50 ± 0,14 6,76 ± 0,31 6,73 ± 0,08 6,63 ± 0,17 6,84 ± 0,12 6,62 ± 0,15 6,68 ± 0,35 6,71 ± 0,32 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng có chữ cái (a, b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) 31 4.1.1.3. Nồng độ tinh trùng Nồng độ tinh trùng phụ thuộc vào từng cá thể và các lần khai thác tinh khác nhau, kỹ thuật khai thác tinh dịch và chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng. Qua theo dõi chúng tôi thấy những mẫu tinh dịch có nồng độ tinh trùng cao thường có hoạt lực tinh trùng tiến thẳng tốt, phẩm chất tinh dịch tốt. Nồng độ tinh trùng của các chó nghiên cứu thu được cao nhất ở chó Cori (265,73 triệu/ml) và thấp nhất ở chó Miki (239,30 triệu/ml). Nồng độ tinh trùng khác nhau không có ý nghĩa (P> 0,05) giữa các chó Malinois được nghiên cứu. Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Farstadw (2000), Andersen (1975). Tác giả cho rằng nồng độ tinh trùng của chó không cao, khoảng 250 triệu/ ml nhưng kết quả này lại cao hơn nghiên cứu cuả Riselaerevà Cộng sự (2002) nồng độ tinh trùng 204 triệu/ ml. Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy: những mẫu tinh dịch có nồng độ tinh trùng cao thường tinh trùng có hoạt lực tiến thẳng cao, phẩm chất tinh dịch tốt. 4.1.1.4. Tổng số tinh trùng tiến thẳng Các chó được chọn để nghiên cứu là giống chó Malinois, được nuôi trong cùng điều kiện chuồng trại, chế độ thức ăn và chế độ luyện tập của Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ công an. Tuy vậy, do phụ thuộc vào các yếu tố cá thể, độ tuổi nên tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh của các chó khác nhau có ý nghĩa (P < 0,05). Cụ thể, trong 07 chó Malinois được nghiên cứu, chó Ken có tổng số tinh trùng tiến thẳng cao nhất (445,28 triệu/ lần), sau đó đến các chó Miki (439,28 triệu/ lần), Fido (372,70 triệu/ lần), Zon (369,70 triệu/ lần), Cori (322,62 triệu/ lần), Nick (215,77 triệu/ lần) thấp nhất là tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác của chó Kaido (211,70 triệu/ lần). Vì tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác tinh xác định chất lượng tinh dịch, chỉ số V.A.C cao thì phẩm chất tinh dịch tốt và ngược lại. Vậy qua việc so sánh chỉ số V.A.C của 07 chó Malinois được nghiên cứu, có thể rút ra kết luận chó Ken có phẩm chất tinh dịch tốt nhất, chó Kaido có phẩm chất tinh dịch kém nhất. Kết quả của chúng tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của của Riselaere và Cộng sự (2002), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh là 780,30 triệu/ ml. 32 4.1.1.5. Tỷ lệ tinh trùng sống Trong 07 chó Malinois được nghiên cứu, tỷ lệ tinh trùng sống cao nhất ở chó Cori (87,61%) và thấp nhất ở Fido (78,29%). Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng sống khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa các chó được nghiên cứu (P > 0,05) Tỷ lệ tinh trùng sống trung bình của chó Malinois là 81,55% thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Riselaere và cs. (2002) là 94%. Hình 4.1. Tinh trùng sống - chết 4.1.1.6. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy các mẫu tinh dịch có nồng độ tinh trùng thấp hoặc khai thác với mật độ dày thường có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao. Bảng 4.1 cho thấy: tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao nhất ở chó Fido (20,56%) và thấp nhất ở chó Ken (17,45%). Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở các chó Fido (20,56%), Zon (20,02%) cao hơn có ý nghĩa (P< 0,05) so với các chó Kaido (18,45%), Ken (17,45%), Cori (18,85%), Nick (18,64 %) và Miki (17,52%). Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của các chó: Kaido, Ken, Cori, Nick, Miki khác nhau không có ý nghĩa (P> 0,05). Với tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của các chó nêu trên, thì tinh dịch của các chó này đều đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong thụ tinh nhân tạo. Tuy nhiên, vì tỷ lệ tinh trùng kỳ 33 hình phản ánh chất lượng tinh dịch, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao thì chất lượng tinh dịch kém, từ đây có thể kết luận phẩm chất tinh dịch của chó Fido là kém nhất. Hình 4.2. Tinh trùng kỳ hình của chó Malinois 4.1.1.7. pH tinh dịch Qua nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy pH của tinh dịch chó Malinois nằm trong khoảng 6,50 – 6,84. Cụ thể, chó Kaido (6,50); Ken (6,76), Zon (6,73), Cori (6,63), Fido (6,84), Nick (6,62), Miki (6,68). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch, đã giúp sơ bộ đánh giá phẩm chất tinh dịch của giống chó Malinois nuôi tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) – Bộ Công an. Nhờ việc kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dịch chó Malinois, có thể xác định được chó đực có phẩm chất tinh dịch tốt, sẽ sử dụng tối đa để khai thác tinh dịch phục vụ cho việc đông lạnh tinh dịch và TTNT, chó có phẩm chất tinh dịch kém thì hạn chế sử dụng tinh dịch của những con này, đồng thời tìm biện pháp để nâng cao phẩm chất tinh dịch của những con chó Malinois này. Đặc biệt, với những con đực giống tốt, nhưng trong một thời gian, phẩm chất tinh dịch đột nhiên kém, chúng ta có thể nhận thấy sự thay đổi về phẩm chất tinh dịch chó, nhờ đó đưa ra những khuyến cáo cho người trực tiếp nuôi dưỡng, huấn luyện chó Malinois để cải thiện chế độ tập luyện, khẩu phần ăn, chế độ khai thác tinh dịch nhằm phục hồi phẩm chất tinh dịch chó, tránh để mất đi những đực giống tốt. Trước khi tiến hành đông lạnh tinh dịch để bảo tồn và TTNT, nếu không tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch thì không thể xác định được có 34 những mẫu tinh dịch chỉ chứa tinh thanh, hoàn toàn không có tinh trùng, vẫn tiến hành cho phối giống tự nhiên thì dù chó cái có tốt, thời gian phối giống thích hợp cũng không thể thành công. Như vậy, để quá trình đông lạnh tinh dịch bảo tồn ở -1960C và TTNT được hiệu quả cần thiết phải đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch của chó Malinois trước khi thực hiện. 4.1.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois Chúng tôi nghiên cứu tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois, từ đó làm cơ sở nghiên cứu môi trường phù hợp để đông lạnh tinh dịch chó Malinois. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Malinois (n= 54) Tên đực Áp lực thẩm thấu Năng lực đệm đối Tỷ trọng so Độ nhớt so giống (miliosmol/kg) với axit HCl 0,1N với nước cất với nước cất Kaido 335,43 ± 4,51 1278,75a ± 7,26 1,04 ± 0,31 3,27a ± 0,37 Ken 342,85 ± 5,65 1251,89a ± 9,35 1,03 ± 0,28 3,25a± 0,28 Zon 354,55 ± 5,16 1326,65b ± 6,29 1,02 ± 0,36 3,27a ± 0,43 Cori 368,69 ± 3,87 1359,53b ± 8,24 1,02 ± 0,35 2,87b ± 0,19 Fido 345,85 ± 6,85 1342,87b ± 8,38 1,03 ± 0,42 3,37a± 0,34 Nick 371,52 ± 4,73 1324,52b ± 7,36 1,02 ± 0,19 3,35a ± 0,28 Miki 346,18 ± 3,56 1297,45a ± 6,26 1,02 ± 0,45 2,85b ± 0,32 Trung bình 349,12 ± 4,27 1321,19 ± 8,38 1,03 ± 0,18 3,12 ± 0,23 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Từ kết quả của bảng 4.2, chúng ta thấy: Áp lực thẩm thấu tinh dịch của chó Nick cao nhất (371,52 miliosmol/kg), sau đó đến chó Cori (368,69 miliosmol/kg), chó Zon (354,55 miliosmol/kg), Miki (346,18 miliosmol/kg), Fido (345,85 miliosmol/kg), Ken (342,85 miliosmol/kg), thấp nhất là ALTT của chó Kaido (335,43 miliosmol/kg). Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Vậy khi lựa chọn môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois, môi trường phù hợp phải có ALTT không quá chênh lệch khoảng giá trị: 335,43 – 371,52 miliosmol/kg. Năng lực đệm đối với axit HCl 0,1N của chó Cori cao nhất (1359,53) và thấp nhất ở chó Ken (1251,89). Như vậy, môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois phải có năng lực đệm không quá chênh lệch khoảng giá trị: 1251,89 – 1359,53. 35 Tỷ trọng so với nước cất của tinh dịch các chó Malinois được nghiên cứu lần lượt là: Kaido (1,04), Ken (1,03), Zon (1,02), Cori (1,02), Fido (1,03), Nick (1,02), Miki (1,02). Như vậy, khi lựa chọn môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois, những môi trường có tỷ trọng so với nước cất tương đương với khoảng giá trị 1,02 - 1,04 thì phù hợp. Độ nhớt tinh dịch so với nước cất của các chó Malinois được nghiên cứu nằm trong khoảng 2,85 – 3,37. Cụ thể, độ nhớt tinh dịch của các chó nghiên cứu lần lượt là Kaido (3,27), Ken (3,25), Zon (3,27), Cori (2,87), Fido (3,37), Nick (3,35) và Miki (2,85). Vậy những môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois phải không quá chênh lệch khoảng giá trị 2,85 – 3,27. 4.2. NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH CHÓ VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT TINH CHÓ MALINOIS ĐÔNG LẠNH BẢO TỒN Ở -196C 4.2.1. Tính chất hóa - lý của một số môi trường đông lạnh tinh dịch Bảng 4.3. Một số tính chất hoá - lý của các môi trường đông lạnh tinh dịch (n=20) Áp lực Môi thẩm thấu Năng lực đệm Tỷ trọng Độ nhớt pH trường (miliosmol/kg) MT 1 360,50  5,45 1331  144 1,025  0,05 3,225  0,62 6,62  0,09 MT 2 445,96 10,40 1344  269 1,040  0,09 2,758  0,72 6,96  0,06 Từ kết quả bảng 4.3, nghiên cứu đã cho thấy một số tính chất lý hoá học của 2 môi trường đông lạnh tinh dịch chó. Trong đó môi trường 1 và môi trường 2 có các chỉ số lần lượt là: áp lực thẩm thấu là 360,5 và 445,96; năng lực đệm 1331 và 1344; tỷ trọng 1,025 và 1,040; độ nhớt 3,225 và 2,758; pH 6,62 và 6,96. Căn cứ trên các chỉ số lý hóa học của tinh dịch chó Malinois thì môi trường 1 hoàn toàn phù hợp để đông lạnh tinh dịch chó Malinois. 4.2.2. Ảnh hưởng của glycerol và dimethyl sulfoxide (DMSO) lên chất lượng tinh đông lạnh Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh khi môi trường có bổ sung glycerol (74,25%) và DMSO (72,50%) tương đương nhau và cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh khi môi trường được bổ sung glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (67,45%). 36 Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh khi môi trường có bổ sung glycerol (39,80%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khi môi trường bổ sung DMSO (34,05%) và khi bổ sung glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (30,55%). Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước và sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa dưới ảnh hưởng của các chất bảo vệ lạnh được bổ sung vào môi trường. Tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh thấp hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) trong trường hợp bổ sung glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (76.70%) so với bổ sung riêng glycerol (82,50%) hoặc dimethyl sulfoxide (83,25%). Tỷ lệ sống của tinh trùng trước khi đông lạnh trong trường hợp bổ sung glycerol khác nhau không có ý nghĩa so với bổ sung dimethyl sulfoxide. Glycerol có ảnh hưởng tích cực lên tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp môi trường có glycerol (65,45%) so với môi trường có dimethyl sulfoxide (59,55%) và môi trường glycerol kết hợp với dimethyl sulfoxide (52,50%). Bảng 4.4. So sánh ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên chất lượng tinh dịch (n=54) Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình của tinh Tỷ lệ sống của tinh (%) trùng (%) trùng (%) Chất bảo vệ lạnh Trước Sau Trước Sau Trước Sau đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh 74,25a 39,80a 19,05 21,65 82,50a 65,45a Glycerol 6,5% ± 3,15 ± 3,32 ± 2,055 ± 2,45 ± 3,20 ± 3,25 72,50a 34,05b 18,50 21,60 83,25a 59,55b DMSO 6.5% ± 4,15 ± 2,35 ± 3,25 ± 2,10 ± 4,40 ± 2,54 b c b c Glycerol 3,25% 67,45 30,55 19,40 23,85 76,70 52,50 + DMSO 3,25% ± 3,55 ± 3,05 ± 2,25 ± 3,55 ± 3,40 ± 3,14 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Với kết quả nhận được, cho thấy: glycerol là chất bảo vệ lạnh có ảnh hưởng tích cực trong đông lạnh tinh dịch chó. 37 Hình 4.3. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh Kết quả cho thấy glycerol có ảnh hưởng tích cực hơn trong quá trình đông lạnh tinh dịch chó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh dịch. Bổ sung glycerol vào môi trường đông lạnh với nồng độ 6,5%, 7% hoặc 8% thu được hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông (40,61%, 39,03%, 37,03%) cao hơn có ý nghĩa so với bổ sung glycerol nồng độ 4% hoặc 10% (31,84%; 27,17%). Nồng độ glycerol 10% cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông thấp, nhưng với nồng độ glycerol 10% có tác dụng tốt bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn ở -1960C. Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh, giải đông đạt 23,96% trong trường hợp bổ sung 10% glycerol vào môi trường. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa trong các trường hợp bổ sung glycerol với các nồng độ 4%, 6,5%, 7%, 8%. Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Trần Xuân Khôi (2013) trên chó Berger, bổ sung glycerol 6,5% - 7% cho tác dụng tốt nhất khi đông lạnh tinh dịch. 38 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol trong môi trường lên chất lượng tinh đông lạnh (n=54) Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng kỳ Tỷ lệ tinh trùng sống Nồng độ (%) hình (%) (%) Glycerol (%) Trước Sau động Trước Sau động Trước Sau động động lạnh lạnh động lạnh lạnh động lạnh lạnh 70,84a  31,84a  20,54  26,49  81,63a  54,14a  Glycerol 4,0 5,18 3,65 1,48 1,42 3,42 2,...lycerol 8,0 3.85 2,68 2,57 1,23 4,11 2,35 Glycerol 66,92b  27,17a  20,51  23,96  76,42b  45,56c  10,0 3,82 1,54 1,51 1,19 3,84 4.71 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên hoạt lực tinh trùng trước và sau đông lạnh Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh, giải đông cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp bổ sung glycerol với nồng độ 6,5 hoặc 7% so với nồng độ 4%, 8% hoặc 10%. Kết quả cho thấy bổ sung glycerol vào môi trường với nồng độ 6,5% 39 hoặc 7% có ảnh hưởng tốt lên sức sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn ở -1960C. 4.2.4. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa ở các thời điểm bổ sung glycerol. Bổ sung phần môi trường có glycerol vào tinh dịch ở thời điểm sau 2 giờ ủ tinh pha loãng ở 40C, cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh cao nhất (43,48%) và cao hơn có ý nghĩa so với với bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 0 giờ (31,56%), 1giờ (37,65%), 3 giờ (35,49%) và 4 giờ (32,54%). Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh thấp nhất (31,56%) trong trường hợp bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 0 giờ. Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên chất lượng tinh chó đông lạnh (n=30) Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình Tỷ lệ sống Thời điểm (%) của tinh trùng (%) của tinh trùng (%) bổ sung Trước Sau đông Trước Sau đông Trước Sau đông glycerol đông lạnh lạnh đông lạnh lạnh đông lạnh lạnh 70,25 31,56a 18,65 24,25 82,42 55,43a 0 giờ ± 3,12 ± 4,34 ± 2,35 ± 2,23 ± 4,35 ± 3,28 73,60 37,65b 20,24 25,45 80,71 62,47b 1 giờ ± 4,15 ± 3,39 ± 3,16 ± 3,09 ± 3,26 ± 3,36 72,28 43,48c 19,58 24,45 85,57 65,04b 2 giờ ± 3,47 ± 3,27 ± 2,42 ± 2,27 ± 4,46 ± 2,57 70,75 35,49b 21,70 23,40 82,25 58,45a 3 giờ ± 3,35 ± 2,42 ± 2,24 ± 2,37 ± 4,08 ± 3,42 70,90 32,54a 19,29 25,85 80,68 59,39a 4 giờ ± 2,54 ± 3,39 ± 3,08 ± 3,25 ± 5,32 ± 2,24 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước và sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa (P>0,05) ở các thời điểm bổ sung môi trường có glycerol. Tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh (85,57%) trong trường hợp bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 2 giờ cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với thời điểm bổ sung môi trường có glycerol ở thời điểm 0, 1, 3 hoặc 4 giờ (tỷ lệ 40 sống của tinh trùng tương ứng là 82,42%, 80,71%, 82,25%, 80,68%). Với kết quả nhận được cho thấy bổ sung phần môi trường có glycerol ở thời điểm sau 2 giờ ủ tinh dịch ở 40C cho phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh tốt hơn so với bổ sung ở thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 3 giờ hoặc 4 giờ. Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng trước đông lạnh, nhưng ảnh hưởng có ý nghĩa lên hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh ở 4 giờ (32,45%), 6 giờ (38,65%), 8 giờ (38,78%) hoặc 10 giờ (36,96%) cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh khi ủ với thời gian 2 giờ (26,54%) trước đông lạnh. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh 6 giờ cho hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh khác nhau không có ý nghĩa so với thời gian ủ tinh dịch 8 giờ hoặc 10 giờ. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng trước đông lạnh. Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh có sự sai khác có ý nghĩa thống kê khi ủ tinh dịch ở các khoảng thời gian khác nhau. Cụ thể, ủ tinh dịch trong thời gian 2 giờ trước đông lạnh cho tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là 27,29%, cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ tinh trùng kỳ hình khi ủ tinh dịch trong thời gian 4,6,8,10 giờ (24,34%, 23,46%, 24,85%, 22,74). 41 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh (n=30) Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Tỷ lệ tinh trùng sống Thời gian (%) (%) (%) ủ tinh dịch trước Trước Sau Trước Sau Trước Sau đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh đông lạnh 69,25 26,54a 20,87 27,29a 75,67 47,45a 2 giờ  2,13  1,26  2,35  2,18  2,15  4,36 70,18 32,45b 20,78 24,34b 75,58 67,29b 4 giờ  0,86  2,38  1,72  1,34  0,46  2,41 69,23 38,65c 20,59 23,46b 74,76 69,39b 6 giờ  1,38  1,35  2,15  2,24  2,35  1,46 70,24 38,78c 19,46 24,85b 76,49 68,27b 8 giờ  2,18  2,12  2,27  3,57  2,24  2,43 70,69 36,96c 20,45 22,74b 74,57 67,54b 10 giờ  2,52  2,27  2,41  2,29  3,29  2,29 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b,c) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước khi đông lạnh lên hoạt lực tinh trùng 42 Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ sống của tinh trùng trước đông lạnh, nhưng ảnh hưởng có ý nghĩa lên tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh cao hơn có ý nghĩa trong trường hợp ủ tinh dịch 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ so với ủ tinh dịch trong khoảng thời gian 2 giờ. Tỷ lệ sống của tinh trùng khác nhau không có ý nghĩa khi ủ tinh dịch ở các khoảng thời gian 4 giờ (67,29%), 6 giờ (69,39%), 8 giờ (68,27%), 10 giờ (67,54%). Với kết quả nhận được, cho thấy thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh là 6 - 8 giờ cho hoạt lực của tinh trùng sau đông lạnh tốt. Kết quả của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Trần Xuân Khôi (2013) khi nghiên cứu trên chó Berger (thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh trong 7 giờ). 4.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh (n=30) Trước đông lạnh Sau đông lạnh Sau đông lạnh Chỉ tiêu theo dõi 50C -1300C -1650C Hoạt lực tinh trùng (%) 70,70  1,22 32,42a  3,27 39,70b  3,71 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%) 21,07  1,83 25,92  0,99 23,84  1,61 Tỷ lệ tinh trùng sống (%) 73,18  2,61 49,14a  4,54 68,15b  1,39 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một hàng có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và ngược lại Tinh dịch sau khi nạp vào cọng rạ và tiếp tục ủ ở 40C trong 3 giờ được chuyển vào buồng đông lạnh. Hai chương trình đông lạnh tinh dịch được thực hiện: làm lạnh tinh cọng rạ đến -1300C hoặc -1650C sau đó nhúng vào nitơ lỏng - 1960C. Kết quả về ảnh hưởng của hai nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh sau đông lạnh - giải đông được thể hiện ở bảng 4.8. Kết quả cho thấy: phương pháp đông lạnh tinh dịch ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê lên phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh. Phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C có tác dụng duy trì hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh (39,70%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau đông lạnh (32,42%) khi giảm nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C trước khi nhúng tinh cọng rạ vào nitơ lỏng -1960C. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh (68,15%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) khi hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C so với tỷ lệ 43 sống của tinh trùng sau đông lạnh (49,14%) trong trường hợp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C. Phương pháp đông lạnh tinh dịch ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh (25,92% so với 23,84%). Kết luận phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1650C trước khi nhúng tinh cọng rạ vào nitơ lỏng có ảnh hưởng tốt hơn lên phẩm chất tinh trùng sau đông lạnh so với phương pháp hạ nhiệt độ tinh dịch xuống -1300C. T1: Trước đông lạnh T2: Đông lạnh xuống -130 C T3: Đông lạnh xuống -165 C 80 70.7 70 60 50 39.7 40 32.42 30 Hoạt lực tinh trùng(%) tinh lực Hoạt 20 10 0 T1 T2 T3 Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên hoạt lực của tinh trùng 4.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượng tinh đông lạnh – giải đông (n=40) Nhiệt độ Thời gian Hoạt lực tinh Tỷ lệ tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng giải đông giải đông trùng sau giải kỳ hình sau giải sống sau giải (0C) (giây) đông (%) đông (%) đông (%) 37 15 39,50  2,35 24,36  2,67 62,29a  3,35 37 30 39,38  3,57 26,58  2,49 72,41b  2,85 37 60 39,80  2,69 26,42  2,58 71,48 b 3,47 70 8 40,65  3,35 27,37  3,34 73,59 b 2,56 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái (a,b) khác nhau thì sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) 44 Tinh đông lạnh cọng rạ được giải đông theo hai phương pháp (giải đông chậm và giải đông nhanh). Giải đông chậm: nhúng tinh cọng rạ vào nước ấm 370C trong khoảng thời gian 15 giây, 30 giây, 60 giây. Giải đông nhanh: nhúng tinh đông lạnh vào nước nóng 700C trong khoảng thời gian 8 giây. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp giải đông và tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh trùng sau đông lạnh giải đông được thể hiện ở bảng 9. Kết quả cho thấy: phương pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh. Tuy nhiên, trong thực tế nên chọn phương pháp giải đông chậm, vì phương pháp này có độ an toàn cao hơn phương pháp giải đông nhanh. Các phương pháp giải đông tinh đông lạnh ảnh hưởng không có ý nghĩa lên tỷ lệ tinh trùng kỳ hình và hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh. Tốc độ giải đông tinh đông lạnh có ảnh hưởng lên tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh - giải đông. Giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C, trong các khoảng thời gian 30 giây hoặc 60 giây và giải đông ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 8 giây cho tỷ lệ tinh trùng sống cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với giải đông ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 15 giây. Qua phân tích kết quả cho thấy giải đông tinh đông lạnh ở nhiệt độ 370C với thời gian là 30 giây, 60 giây cho kết quả tốt về phẩm chất tinh trùng sau giải đông và dễ áp dụng trong thực tiễn thụ tinh nhân tạo cho chó. Tóm lại, nghiên cứu đã cho thấy, bổ sung Glycerol nồng độ 6,5% hoặc 7% sau 2 giờ ủ có khả năng duy trì sức sống của tinh trùng tốt nhất. Thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh tối thiểu là 4 giờ. Giải đông tinh cọng dạ ở 370C trong 30 giây hoặc 60 giây cho kết quả phẩm chất tinh dịch tốt. Dựa trên các kết quả nghiên cứu có được, chúng tôi đã xây dựng quy trình công nghệ đông lạnh tinh dịch Malinois nhằm bảo tồn tinh dịch, phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và thụ tinh nhân tạo. 45 Sơ đồ 4.1. Quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois 4.2.8. Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó 4.2.8.1. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh Dựa trên phẩm chất tinh dịch của 7 chó Malinois nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn 4 cá thể chó Malinois chó phẩm chất tinh dịch tốt nhất để sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ. 46 Sau khi ổn định quy trình đông lạnh tinh dịch chó, đã thử nghiệm sản xuất được 219 liều tinh đông lạnh của 4 chó Malinois (chó Ken 60 liều, chó Zon 54 liều, chó Fido 50 liều, chó Miki 55 liều ). Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông đạt trung bình 40,45% (chó Ken: 40,52%, chó Zon: 38,29%, chó Fido: 41,36%, chó Miki: 40,58%). Bảng 4.10. Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) Chỉ tiêu Ken Zon Fido Miki TB Hoạt lực tinh trùng của 74,58 ± 3,47 73,59 ± 2,52 74,36 ± 2,72 73,69± 2,34 74,05 ± 2,27 tinh nguyên (%) Hoạt lực tinh trùng trước 70,36 ± 2,43 69,48 ± 3,27 68,96 ± 2,45 68,53±2,86 69,47 ± 3,42 đông lạnh (%) Hoạt lực tinh trùng sau 40,52 ± 4,46 38,29 ± 2,17 41,36 ± 3,67 40,58 ± 2,53 40,45 ± 3,74 đông lạnh (%) Số cọng có hoạt lực tinh 60 54 50 55 219 trùng sau đông lạnh ≥30%. Hoạt lực tinh trùng giảm dần trong quá trình ủ tinh dịch trước đông lạnh. Trong quá trình đông lạnh tinh dịch, sự giảm nhiệt độ đã gây hiện tượng sốc nhiệt đối với tinh trùng là nguyên nhân làm giảm hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh so với trước đông lạnh. Tuy nhiên hoạt lực của tinh trùng sau đông lạnh giải đông đạt tiêu chuẩn bảo tồn phục vụ cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gen chó Malinois. So sánh với kết quả nghiên cứu của Đỗ Văn Thu (2010), hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của chó Malinois(40,45%) tương đương với kết quả trên chó Berger (40,84%) và Labrador(41,62%) nhưng cao hơn trên chó Cocker (38,75%). 4.2.8.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh Tinh nguyên sử dụng để đông lạnh có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình là: 18,39%. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tăng dần trong khoảng ủ tinh dịch ở 40C trước đông lạnh (21,48%), như vậy với nhiệt độ 40C đã có ảnh hưởng đến cấu trúc hình thái của tinh trùng. Đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ âm là nguyên nhân chính làm tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau giải đông (25,23%). Kết quả này tương đồng với kết quả của Đỗ Văn Thu (2010) khi sản xuất tinh đông lạnh chó Berger và Labrador (25,31%). Trong thành phần của môi trường đông lạnh tinh dịch có chất bảo vệ lạnh glycerol có tác dụng bảo vệ cấu trúc của tế bào tinh 47 trùng, tránh được hiện tượng kết tinh của nước trong quá trình đông lạnh, vì vậy tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh tuy tăng nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép để bảo tồn. Bảng 4.11. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh (n=30) Chỉ tiêu đánh giá Ken Zon Fido Miki TB Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 18,25 ± 2,74 17,53 ± 2,41 18,62 ± 2,43 18,15 ± 2,26 18,39 ± 2,74 của tinh nguyên (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh pha loãng trước 20,63 ± 3,38 21,28 ± 2,58 22,42 ± 2,46 21,56 ± 2,52 21,48 ± 3,67 đông lạnh (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh sau đông lạnh - 25,49 ± 3,19 23,76 ± 4,37 26,53 ± 4,59 25,87± 3,46 25,23 ± 4,38 giải đông (%) 4.2.8.3. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh Sự vận động của tinh trùng trong thời gian ủ tinh dịch đã làm tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, đặc biệt sự hạ nhiệt độ xuống dưới âm độ là nguyên nhân giảm tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh tinh dịch. Tỷ lệ sống của tinh trùng ngay sau khai thác tinh đạt giá trị trung bình 87,69%. Tỷ lệ sống của tinh trùng giảm trong thời gian ủ trước đông lạnh và đạt giá trị trung bình 82,12%. Sự giảm nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh dịch và sự tăng nhiệt độ trong quá trình giải đông tinh đông lạnh là những yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến giảm tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông. Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông đạt giá trị trung bình 69,34%. Kết quả này thấp hơn không đáng kể so với kết quả sản xuất tinh đông lạnh trên chó Berger của Đỗ Văn Thu (2010) là 70,52%. Với kết quả nhận được, cho thấy quy trình đông lạnh tinh dịch chó Malinois mà chúng tôi đã nghiên cứu có tính ổn định và đã sản xuất được 219 liều tinh cọng rạ có chất lượng tốt đảm bảo cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn nguồn gen của chó Malinois. 48 Bảng 4.12. Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (n=30) Chỉ tiêu Ken Zon Fido Miki TB Tỷ lệ tinh trùng sống 87,43 ± 2,18 88,75 ± 3,35 86,38 ± 3,42 87,19 ± 2,58 87,69 ± 3,35 của tinh nguyên (%) Tỷ lệ tinh trùng sống của tinh dịch pha 81,29 ± 3,34 84,21 ± 2,26 80,41 ± 2,57 81,13 ± 3,17 82,12 ± 2,67 loãng trước đông lạnh (%) Tỷ lệ tinh trùng sống của tinh sau đông 70,46 ± 5,46 68,24 ± 4,15 69,54 ± 5,36 68,96 ± 3,65 69,34 ± 4,52 lạnh - giải đông (%) 4.2.9. Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó Malinois đông lạnh 4.2.9.1. Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng chó Malinois đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C Tinh dịch chó Malinois sau khi đông lạnh được giải đông để đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông và trong thời gian bảo tồn ở -1960C. Chúng tôi giải đông tinh ở các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng. Kết quả đánh giá hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông của tinh đông lạnh chó Malinois được thể hiện ở bảng 4.13. Bảng 4.13. Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16) Mẫu tinh Hoạt lực tinh trùng tương ứng với thời gian bảo tồn đông lạnh Sau đông lạnh Sau 01 tháng Sau 03 tháng Sau 04 tháng Ken 40,85% 40,50% 40,00% 40,00% Zon 38,75% 38,00% 38,00% 38,00% Fido 41,62% 40,25% 40,00% 40,00% Miki 40,50% 40,00% 40,00% 40,00% Trung bình 40,43% 39,69% 39,50% 39,50% 49 Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng sau giải đông giảm không có ý nghĩa trong thời gian bảo tồn. Ở cả 4 chó Malinois, hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng sau giải đông tương đối ổn định ở tất cả các thời điểm giải đông: sau đông lạnh, sau 1 tháng, sau 3 tháng, sau 4 tháng bảo tồn. Cụ thể hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki lần lượt là 40.85%; 38,75%; 41,62% và 40,05%. Hoạt lực tinh trùng của 4 chó trên ở thời điểm sau 3 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%, 40,00%, 40,00% và ở thời điểm sau 4 tháng bảo tồn là 40,00%, 38,00%, 40,00%, 40,00%. Với kết quả kiểm tra hoạt lực của tinh trùng sau giải đông cho thấy tinh đông lạnh có chất lượng ổn định trong quá trình bảo tồn ở -1960C. 4.2.9.2. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở - 1960C Chúng tôi tiến hành giải đông tinh cọng rạ đông lạnh tại các thời điểm: ngay sau khi đông lạnh, sau 01 tháng, sau 03 tháng và sau 04 tháng, kết quả được trình bày ở bảng 4.14. Bảng 4.14. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C (n=16) Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông tương ứng Mẫu tinh với thời gian bảo tồn đông lạnh Sau đông lạnh Sau 01 tháng Sau 03 tháng Sau 04 tháng Ken 24,27% 24,35% 24,59% 24,55% Zon 25,39% 25,62% 25,77% 25,80% Fido 23,41% 23,78% 23,98% 23,98% Miki 24,36% 24,51% 24,85% 24,90% Trung bình 24,36% 24,56% 24,80% 24.80% Số liệu thu được cho thấy, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong cùng một giống chó ở các thời điểm giải đông khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Cụ thể, đối với chó Ken, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình được giải đông ngay sau khi đông lạnh là 24,27%. Sau 03 tháng bảo tồn, tỷ lệ này là 24,59%, và sau 4 tháng là 24,55%. Tương tự đối với 3 chó còn lại, sự khác nhau về tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông khác nhau không có nghĩa thống kê. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình sau đông lạnh – giải đông giữa các chó thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). 50 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chất lượng của tinh trùng bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố thời gian khai thác, chất lượng con giống và môi trường bảo quản. Môi trường bảo quản có vai trò quan trọng trong việc duy trì chất lượng của tinh dịch trong thời gian bảo tồn, đảm bảo khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi giải đông. Ở nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành giải đông tinh đông lạnh ở nhiều thời điểm khác nhau, kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng kỳ hình khác nhau không có ý nghĩa ở tinh dịch được giải đông ở thời điểm ngay sau đông lạnh và sau 04 tháng bảo quản. Điều này bước đầu cho phép chúng tôi kết luận, môi trường bảo quản đang sử dụng là phù hợp cho việc đông lạnh và bảo quản tinh dịch chó Malinois trong nitơ lỏng ở -1960C. 4.3. KẾT QUẢ THỤ TINH NHÂN TẠO CHO CHÓ MALINOIS Chúng tôi tiến hành sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ của 4 chó Ken, Zon, Fido, Miki bảo tồn trong nitơ lỏng ở -1960C để thụ tinh nhân tạo cho 10 chó cái giống tại Cục Cảnh sát quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ (K204) - Bộ Công an. Tỉ lệ mang thai đạt 60%, số con sinh ra là 44 trong đó tỉ lệ đực/cái là 22/20. Số chó con trung bình là 7 con/lứa. Khối lượng sơ sinh của chó con đạt trung bình 352g/con, tương đương với khối lượng sơ sinh của chó con sinh ra do phối giống tự nhiên (350g/kg). Có 4 chó không mang thai, tuy nhiên, việc chó không mang thai có rất nhiều nguyên nhân gây ra. Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi không có đủ điều kiện và thời gian để đánh giá chính xác về nguyên nhân không mang thai ở 4 chó cái này. Các tinh cọng rạ sử dụng cho thụ tinh có chất lượng đồng đều, hoạt lực tinh trùng sau giải đông đạt 38 - 40%. Sử dụng các cọng rạ có thể tích 0,25 ml, phối 2 cọng rạ/một lần (tương đương 50 x106 tinh trùng) và phối 2 lần. Khoảng cách thời gian giữa 2 lần phối là 48 giờ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hầu hết là các tinh cọng rạ có thời gian bảo tồn từ 20 ngày đến 70 ngày. Kết quả cho thấy tinh trùng chó Malinois được bảo quản dạng đông lạnh trong nitơ lỏng vẫn có chất lượng cao và ổn định theo thời gian. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa lớn, thành công trong nghiên cứu công nghệ đông lạnh tinh chó Malinois sẽ giúp cho việc bảo tồn nguồn gen quí của những con chó có chất lượng tốt. 51 Bảng 4.15. Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Malinois đông lạnh Số con Tên Hoạt lực tinh Liều phối Khối lượng sơ Chó cái Ngày phối Ngày phối đực trùng sau giải (Cọng rạ Ngày đẻ sinh trung bình giống giống lần 1 giống lần 2 Đực Cái giống đông 0,25 ml) (g) (22) (20) Ken 40 02 Igor 05.01. 2016 07.01. 2016 09.03.2016 3 4 320 Ken 40 02 Daisy 08.01. 2016 10.01. 2016 11.03.2016 4 2 375 Zon 40 02 Monika 15.01. 2016 17.01. 2016 Không chửa Zon 40 02 Lady 27.01.2016 29.01.2016 28.03.2016 5 2 336 Fido 38 02 Melisa 28.01.2016 30.01.2016 Không chửa Ken 38 02 Elsa 08.02.2016 10.02.2016 10.04.2016 3 4 381 Miki 39 02 Benzi 11.02. 2016 13.02. 2016 15.04.2016 4 4 306 Miki 40 02 Mony 12.02. 2016 14.02. 2016 Không chửa Fido 40 02 Lusa 16.02.2016 18.02.2016 17.04.2016 3 4 394 Fido 40 02 Sera 25.02.2016 27.02.2016 Không chửa Tổng số: 42 con 22 20 352 52 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN - Đánh giá được một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý - hóa học của tinh dịch chó Malinois. Lượng tinh dịch chó 1,94 ml, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng 72,86%, nồng độ tinh trùng 245,53 triệu/ml, tỷ lệ tinh trùng sống 82,70%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 18,85%, pH 6,71, Áp lực thẩm thấu 344,12 miliosmol/kg, năng lực đệm 1314,19, tỷ trọng 1,03, độ nhớt 3,12. - Xây dựng thành công môi trường đông lạnh tinh dịch chó Malinois. Đồng thời nghiên cứu được ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến phẩm chất tinh dịch chó Malinois sau đông lạnh – giải đông: bổ sung chất bảo vệ lạnh glyceron 6,5 - 7% vào môi trường đông lạnh, thời gian ủ tinh dịch trong khoảng 6 - 8 giờ. - Đã sản xuất và bảo tồn được 219 liều tinh chó Malinois đông lạnh cọng rạ (hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 38 - 40%). Tinh chó đông lạnh có chất lượng ổn định trong thời gian bảo tồn ở nitơ lỏng -1960C. - Thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois sử dụng tinh đông lạnh bảo tồn ở - 1960C. Tỷ lệ thụ thai đạt 60%, số chó con sinh ra là 42 con , số con trung bình là 7 con/ổ, tỷ lệ đực cái 22/20, khối lượng sơ sinh của chó con 352g/con. 5.2. KIẾN NGHỊ Cho áp dụng công nghệ đông lạnh tinh dịch và TTNT chó Malinois vào thực tiễn sản xuất. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Đỗ Văn Thu (2010). Ứng dụng công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó để nhân giống và bảo tồn một số giống chó nghiệp vụ của ngành Công an. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. Đỗ Văn Thu và Nguyễn Anh (2008). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó nghiệp vụ phục vụ cho công tác bảo tồn và thụ tinh nhân tạo. Tạp chí sinh học. 03(30). tr. 169-175. 3. Đỗ Văn Thu, Nguyễn Anh và Nguyễn Tuấn Anh (2008). Nghiên cứu môi trường pha loãng tinh dịch chó bảo tồn ở 5oC. Tạp chí sinh học. 01(30). tr. 87-93. 4. Đỗ Văn Thu, Đoàn Việt Bình, Lê Thành Đô, Lê Thị Huệ, Trần Xuân Khôi và Võ Thị Ninh (2013). Nghiên cứu ảnh hưởng của Glycerol và ethylene glycol lên chất lượng tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196oC. Báo cáo hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, tr. 917-921. 5. Trần Xuân Khôi (2013). Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Berger. Luận văn Thạc sỹ, Đại học Thái Nguyên. Tài liệu nước ngoài 6. Andersen (1975). Insermination with frozen dog semen based on a new insermination technique. Zuchthygien. Vol 10. pp. 1-4 7. Cardoso Rde. C., A. R. Silva, D. C. Uchoa and L. D. da Silva (2003). Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology. Vol 59(3-4). pp. 743- 751. 8. Chemineau and Y. Caynie (1991). Training manual on artificial insemination in sheepand goats. FAO. Animal production and Health. 83 – Rome, Italia. 9. Farstad W. and K. A. Berg (1989). Factors influencing the success rate of artificial insemination with frozen semen in the dog. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 39. pp. 289-292. 10. Farstad W. (2000). Assisted reproductive technology in canid species. Theriogenology. Vol 53 (1). pp. 175-186. 11. Hermansson U. and C. Linde-Forsberg (2006). Freezing of stored, chilled dog spermatozoa. Theriogenology. Vol 65. pp. 584-593. 54 12. Linde-Forsberg C. and M. Forsberg (1993). Results of 527 controlled artificial inseminations in dogs. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 47. pp. 313-323. 13. Linde-Forsberg C., B. Strom Holst and G. Govette (1999). Comparison of fertility data from vaginal vs intrauterine insemination of frozen-thawed dog semen: a retrospective study. Theriogenology. Vol 52(1). pp. 11-23. 14. Linde-Forsberg C. (1991). Achieving canine pregnancy by using frozen or chilled extended semen. Vet Clin North Am Small Anim Pract. Vol 21(3). pp 467-485. 15. Nizanski W., A. Dubiel, W. Bielas and G. J. Dejneka (2001). Effects of three cryopreservation methods and two semen extenders on the quality of dog semen after thawing. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 365-369. 16. Pena A. and C. B. Linde-Forsberg (2000). Effects of spermatozoal concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology Vol 54(5). pp. 703-718. 17. Pinto C. R., D. L. Paccamonti and B. E. Eilts (1999). Fertility in bitches artificially inseminated with extended, chilled semen. Theriogenology. Vol 52(4). pp. 609-616. 18. Platz C. C. and S. W. Seager (1977). Successful pregnancies with concentrated frozen canine semen. Lab Anim Sci. Vol 27(6). pp. 1013-1016. 19. Rijsselaere T., A. Van Soom, D. Maes, A. de Kruif (2002). Effect of centrifugation on in vivo survival of fresh diluted canine spermatozoa. Theriogenology. Vol 57. pp. 1669-1681. 20. Rohloff D., C. Laiblin and S. Heidrich (1978). Cryoprotective ability of glycerin and DMSO in the deep freezing of dog sperm. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. Vol 91(2). pp. 31-33. 21. Rota A., A. Frishling, I. Vannozzi, F. Camillo and S. Romagnoli (2001). Effect of the inclusion of skimmed milk in freezing extenders on the viability of canine spermatozoa after thawing. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 377-381. 22. Rota A., B. Strurm and C. Linde-Forsberg (1995). Effects of seminal plasma and three extenders on canine semen stored at 40C. Theriogenology. Vol 44. pp. 855-900. 23. Salisbury G. W. W. (1978). Physiology of reprodution and artificial insemination of cattle, Second Edition, Fracisco. WW. H. Framan and Company Samsuddin M, Y. Amiri and M.M.U Bhuiyan. 24. Seager S. W. and C. C. Platz (1977). Artificial insemination and frozen semen in the dog. Vet Clin North Am. Vol 7(4). pp. 757-764. 55 25. Silva A. R., R. C. Cardoso, D. C. Uchoa and L. D. Silva (2003). Quality of canine semen submitted to single or fractionated glycerol addition during the freezing process. Theriogenology. Vol 59(3-4). pp. 821-829. 26. Silva L. D., K. Onclin, B. Lejeune and J. P. Verstegen (1996). Comparisons of intravaginal and intrauterine insemination of bitches with fresh or frozen semen. Vet Rec. Vol 138(7). pp. 154-157. 27. Sirivaidyapong S., P. Ursem, M. M. Bevers and B. Colenbrander (2001). Effect of prostatic fluid on motility, viability and acrosome integrity of chilled and frozen- thawed dog spermatozoa. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 383-386. 28. Thomassen R., W. Farstad, A. Krogenaes, J. A. Fougner and K. A. Berg (2001). Artificial insemination with frozen semen in dogs: a retrospective study. Journal of reproduction and fertility. Supplement. Vol 57. pp. 341-346. 29. Tsutsui T., T. Tezuka, Y. Mikasa, H. Sugisawa, N. Kirihara, T. Hori and E. Kawakami (2003). Artificial insemination with canine semen stored at a low temperature. The Journal of Veterinary Medical Science. Vol 65(3). pp. 307-312. 30. Yildiz C., A. Kaya, M. Aksoy and T. Tekeli (2000). Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing. Theriogenology. Vol 54(4). pp. 579-585. 56 PHỤ LỤC Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu 1. Chó Malinois tham gia nghiên cứu 2. Chuẩn bị môi trường 3. Khai thác tinh dịch 57 4. Kiểm tra chất lượng tinh dịch 5. Đông lạnh tinh dịch 6. Giải đông kiểm tra chất lượng tinh dịch 58 7. Thụ tinh nhân tạo cho chó Malinois 8. Chó cái mang thai nhờ TTNT 9. Chó con sinh ra nhờ TTNT 59