Bài giảng Sinh lý thực vật

nh sinh lý trong cơ thể thực vật rất phức tạp. Để có thể hiểu hết những của các hệ này phải cần một thời gian tương đối dài. Do sự bó gọn về thời gian của môn học, trong cuốn “Bài giảng Thực hành Sinh lý học thực vật” này, chúng tôi chỉ trình bày một số bài thực hành cơ bản nhất nhằm nêu lên được cấu tạo và một số chức năng sinh lý cơ bản nhất trong cơ thể thực vật. Mỗi bài thực hành đều được thiết kế gồm 5 phần: nguyên tắc, nguyên liệu - hoá chất – dụng cụ, phương pháp thực hiện, những điểm cần lưu ý và tường trình thí nghiệm. Trình tự các bước thực hiện được chỉ rõ để có thể thực hiện thí nghiệm nhanh chóng và chính xác. Sinh viên khi thực hiện cần tuân thủ trình tự các bước để đạt kết quả theo yêu cầu của từng bài. 3 4 BÀI 1 SINH LÝ TẾ BÀO THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC Hệ thống màng sinh học của tế bào như màng tế bào chất, màng không bào, màng ty thể, màng hệ lưới nội chất là những cấu trúc sống của tế bào (hình 1). Màng sinh học có đặc điểm cấu trúc dạng thể khảm lỏng linh động và có đặc tính thấm chọn lọc rất cao. Màng được cấu tạo bởi hai lớp phospholipid (lớp nền) với những phân tử protein nằm xen lẫn vào (phần tử khảm) (hình 2). Những thành phần màng liên kết lỏng lẻo tạo nên tính linh động cho màng. Màng là hàng rào đối với đa số các phân tử tan trong nước. Hệ thống màng sinh học có vai trò quan trọng trong các quá trình trao đổi chất giữa tế bào và môi trường ngoài. Quá trình trao đổi này liên quan tới lượng nước có thể vào hay ra khỏi tế bào do hiện tượng thấm thấu và đặc tính của các ion có thể hay không thể đi qua màng. Hình 1.1. Hệ thống màng sinh học ở tế bào thực vật 5 Hình 1.2. Cấu trúc màng sinh học Sự trao đổi nước giữa tế bào với môi trường ngoài xảy ra qua màng tế bào chất và màng không bào đều có tính thấm chọn lọc. Vì vậy: - Khi tiếp xúc với một dung dịch có áp suất thẩm thấu cao hơn áp suất thẩm thấu bên trong tế bào (dung dịch ưu trương), nước trong tế bào sẽ thẩm thấu ra ngoài. Tế bào rơi vào trạng thái co nguyên sinh chất. - Nếu dung dịch môi trường có áp suất thẩm thấu nhỏ hơn áp suất thẩm thu của tế bào (dung dịch nhược trương), nước từ ngoài môi trường sẽ thẩm thấu vào tế bào. Tế bào rơi vào trạng thái trương nước. Hình 1.3. Tế bào trong những môi trường có áp suất thẩm thấu khác nhau Các tế bào trong mô tươi thực vật luôn ở trạng thái trương nước. Tuy nhiên, do đặc tính cấu trúc tế bào thực vật có cấu trúc vách cellulose rắn chắc, trong tế bào hình thành một áp suất trương nước (ký hiệu T). Khả năng trao đổi nước giữa tế bào thực vật với môi trường được thể hiện bởi lực hút nước S. S =  - T Với: - S: lực hút nước - T: áp suất trương nước 6 - : áp suất thẩm thấu của tế bào Trong trường hợp dung dịch có  lớn hơn S của tế bào, mô tế bào bị mất nước, trọng lượng tươi của mô, tế bào giảm so với ban đầu. Ngược lại nếu dung dịch có  nhỏ hơn S của tế bào, nước từ ngoài thẩm thấu vào tế bào, trọng lượng tươi của mô, tế bào tăng. Nếu  tương đương với S, trọng lượng tươi của mô, tế bào không đổi 2 – NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1. Nguyên liệu - 1 củ hành tím - 1 lá lẻ bạn (Rhoeo discolor) - 1 củ khoai tây hoặc khoai lang 2.2 - Hoá chất - Dung dịch saccharose 1M (342g/l) - Dung dịch KNO3 0,8M - Dung dịch KNO3 1M 2.3 – Dụng cụ Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành: STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Kính hiển vi quang học cái 1 Loại có đèn 2 Cân phân tích cái 1 3 Dao inox nhỏ cái 1 4 Dao lam lưỡi 2 5 Lame tấm 5 6 Lamelle tấm 5 7 Ống nghiệm 18 ống 12 8 Becher 250ml cái 1 9 Pipette 10ml cái 1 10 Đũa khuấy cái 1 11 Đĩa petri 100mm cái 2 12 Kim mũi giáo cái 2 13 Giấy nhôm tấm 5 7 STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 14 Giấy thấm cuộn 1 15 Kẹp inox dài 25cm Cái 1 16 Bình tia Cái 1 3 - TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1. Chứng minh màng sinh học ở tế bào thực vật a. Màng tế bào chất - Chuẩn bị 2 tấm lame và lamelle sạch. Nhỏ một giọt KNO3 0,8M lên tấm 1 lame; một giọt nước cất lên một tấm lame khác. - Dùng dao lam lột nhẹ một mảnh biểu bì vảy hành; đặt vào giọt KNO3 0,8M và giọt nước trên tấm lame; đậy lamelle và quan sát ngay dưới kính hiển vi (ở vật kính 40X). - Trên kính hiển vi, ở tấm lam có giọt KNO3 0,8M xác định trong tế bào: đường viền đen gợn sóng nằm tách rời khỏi vách tế bào, đó chính là màng tế bào chất. Tế bào chất dạng hạt, tạo một dãy liên tục dày hoặc mỏng. Màng tế bào tạo giới hạn ngoài của dãy nguyên sinh chất này. Màng tế bào chất tách khỏi vách tạo những khoảng trống giữa vách và màng) thấy được dưới kính hiển vi. Không bào ngày càng giảm thể tích. - Quan sát tế bào vảy hành trên tấm lame có giọt nước, so sánh với trường hợp trên. - Vẽ hình hai trường hợp. b. Màng không bào - Chuẩn bị một đĩa petri có chứa dung dịch KNO3 1M. - Dùng dao lam tách mỏng những lớp biểu bì màu tím của vảy hành hoặc lá lẻ bạn theo chiều dọc của vảy hoặc lá. - Ngâm những lát mỏng này trong đĩa petri đã chuẩn bị trong thời gian 1h. - Sau 1h, chọn những lát mỏng nhất, đặt trên lame (không đậy lamelle); quan sát trên kính hiển vi (ở vật kính 10X). Xác định trục dọc tế bào của lát mỏng. - Dùng dao lam sắc cắt mảnh biểu bình thành những lát mỏng khoảng 0,1-0,2 mm theo hướng vuông góc với trục dọc của tế bào. - Nhỏ lên trên các lát mỏng một giọt KNO3 1M, đậy lamelle lại, quan sát trên kính hiển vi (ở vật kính 40X). - Quan sát dưới kinh hiển vi, các tế bào bị cắt, tế bào chất thoát ra khỏi khung tế bào. Không bào của các tế bào có màu hồng hoặc tím của sắc tố antocian; ban đầu có dạng hình cầu, sau đó đều co nguyên sinh. - Hiện tượng không bào có dạng hình cầu thoát ra có màu hồng đậm, ch?ng tỏ không bào được bao bọc bởi một màng sinh học sống (gọi là tonoplaste), có tính thấm 8 chọn lọc nên giữ được sắc tố antocian và các chất khác, tạo áp suất thẩm thấu cho tế bào. 9 3.2. Đo lực hút nước của một mô tế bào theo phương pháp gián tiếp Chuẩn bị dung dịch saccharose 1M: cân 342g saccharose pha trong 1000ml nước cất. Từ dung dịch saccharose 1M, chuẩn bị 10 ống nghiệm, lần lượt hút vào các ống nghiệm dung dịch đường theo nồng độ sau: STT ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Số ml dd đường 1M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Số ml H2O 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Nồng độ phân tử của dung dịch (M) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 - Chọn một củ khoai lang hoặc khoai tây còn tươi. Dùng dao gọt sạch vỏ. Cắt củ khoai tây thành 11 thanh mô củ, kích thước mỗi thanh 5x1x1 (đặt vừa vào miệng ống nghiệm). - Dùng giấy lọc thấm khô nhanh bề mặt các thanh mô củ. Cân các thanh mô củ theo thứ tự trên cân phân tích, ghi trọng lượng theo thứ tự của từng thanh. Lần lượt cho các thanh vào các ống nghiệm đã chuẩn bị ở trên. Giữ yên các ống nghiệm trong thời gian 90 phút. - Sau khi ngâm 90 phút, dùng kẹp gắp các thanh mô củ ra. Thấm khô bề mặt bằng giấy lọc. Cân và ghi lại trọng lượng lần lượt của từng thanh mô củ. 4 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Phải quan sát ngay tấm lam có giọt KNO3 0,8M khi cho vảy hành vào. - Trong trường hợp, các thành phần của tế bào không thoát ra khỏi khung tế bào (do bị cản trở bởi dãy tế bào chất gọi là sợi Hetch), có thể dùng kim mũi giáo ấn nhẹ lên lamelle để giúp các thành phần thoát ra ngoài. - Các thanh mô củ được cắt với kích thước tương đối đồng đều, tránh làm dập mô củ. 5 - TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM 5.1. Chứng minh màng sinh học ở tế bào thực vật - Vẽ hình và giải thích hiện tượng xảy ra đối với tế bào vảy hành trong nước và trong KNO3 0,8M. - Vẽ các dạng hình thái của vảy hành hoặc lá lẻ bạn quan sát được trong dung dịch KNO3 1M. Giải thích hiện tượng. 5.2. Chứng minh sự trao đổi nước bằng lực hút của mô - Xác định sự sai biệt về khối lượng của các thanh mô củ (P) sau khi ngâm và ghi vào bảng. Sai biệt là dương nếu trọng lượng sau (P2) lớn hơn trọng lượng đầu (P1). Ngược lại là sai biệt âm. 10 Nồng độ của dung dịch ngâm (M) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 P1 (g) P2 (g) P (g) - Vẽ đường biểu diễn mô tả sự thay đổi trọng lượng thanh mô củ theo nồng độ dung dịch ngâm. Đường biểu diễn cắt trục hoành tại điểm Cs ứng với nồng độ của dung dịch không làm thay đổi trọng lượng thanh mô củ. Xác định sức hút (S) của thanh mô củ thí nghiệm tính bằng atm hoặc bar (1 atm= 1,013 bar) theo bảng: Nồng độ (M) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Áp suất thẩm thấu (atm) 2,46 4,92 7,38 9,84 12,30 14,76 17,22 19,68 22,14 24,60 11 BÀI 2 SỰ TRAO ĐỔI NƯỚC Ở THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC Ở thực vật, sự thoát hơi nước của lá cây xảy ra chủ yếu qua các khí khẩu. Quá trình này phụ thuộc nhiều vào số lượng cũng như cách sắp xếp của các khí khẩu trên hai mặt lá. Khí khẩu gồm hai tế bào bảo vệ có vách cellulose dày không đều ở hai mặt, dày hơn ở mặt tiểu khẩu. Khi các tế bào này trương nước, vách trong và vách ngoài căng giãn không đều nhau khiến hai tế bào cong lại, tiểu khẩu mở rộng. Do đó, mọi yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái trương nước của hai tế bào bảo vệ đều làm ảnh hưởng trên độ mở của khí khẩu. Hình 2.1. Cử động của khí khẩu. (A) Tế bào bảo vệ hấp thu nước, (B) Khí khẩu mở, (C) Tế bào bảo vệ mất nước, khí khẩu đóng. 2 – NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1. Nguyên liệu - Lá cây dâm bụt tươi đang trên cành. Yêu câu đối với lá này là có kích thước vừa phải, lá đơn, không có lông, không dầy cứng. - Lá lẻ bạn (Rhoeo discolor) 2.2 - Hoá chất - CoCl2 5% - Collondion - Cồn 95o - Thuốc nhuộm đỏ congo - KH2PO4 0,2M - NaH2PO4 0,2M 12 - Dung dịch saccharose 1M - Dung dịch saccharose 0,2M - Glycerin. 2.3 – Dụng cụ Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành STT Tên dụng cụ, thiết bị Ðơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Kính hiển vi quang học cái 1 Loại có đèn 2 Băng keo trong bản lớn Cuộn 1 3 Ống nhỏ giọt cái 1 4 Dao lam Lưỡi 2 5 Lame Tấm 5 6 Lamelle Tấm 5 7 Pipette 2ml Cái 1 8 Becher 250ml cái 1 9 Kéo nhỏ cái 1 10 Bình hút ẩm cái 1 11 Ðĩa petri 100mm cái 2 12 Kim mũi giáo cái 2 13 Kẹp giấy Cái 10 14 Giấy thấm Tờ 3 15 Tủ sấy Cái 1 16 Kẹp inox Cái 1 17 Bình tia Cái 1 3 - TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1. Xác định tốc độ thoát hơi nước tương đối của lá - Cắt giấy lọc thành những mảnh nhỏ bằng nhau. Chiều ngang của tấm giấy phải nhỏ hơn chiều rộng của tấm băng keo trong. 13 - Nhúng các tấm giấy lọc vào dung dịch CoCl2 trong 1 phút, sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 80oC trong tủ sấy. Khi các tấm giấy có màu xanh đều, dùng kẹp inox gắp hai tấm giấy dán vào hai đầu của tấm băng keo có chiều dài 10cm. - Dán nhanh tấm băng keo có mang tờ giấy lọc vào hai mặt của một mảnh lá trên cây. Hai tờ giấy ở mặt trên và mặt dưới của lá đối xứng nhau. Đặt tấm băng keo có gián giấy lọc vào bình hút ẩm nếu dán vào lá cây bên ngoài phòng thí nghiệm. Cần ép kín tấm băng keo quanh mảnh giấy để tránh không khí ẩm lọt qua. Dùng đồng hồ để xác định thời gian đổi màu (từ xanh sang hồng) của tấm giấy. Nếu quá 30 phút, sự thoát hơi nước xem như không đáng kể. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ thoát hơi nước ở lá - Thí nghiệm được lặp lại ba lần ở những lá cùng tầng, cùng tuổi, cùng một cây trong cùng một thời gian. - Sau thí nghiệm trên, hái lá cây, thoa một lớp mỏng collodion lên một vùng nhỏ trên hai mặt lá. Khi collodion khô, nhẹ nhàng dùng kim mũi giáo lột nhẹ một mảnh, đặt giữa tấm lame và lamelle, quan sát trên kính hiển vi. Xác định số khí khẩu của mặt trên và dưới của lá quan sát thấy trong diện tích thị trường của vật kính X40 có đường kính 0,33mm. 3.2. Sự cử động của khí khẩu a. Xác định độ mở của khí khẩu - Chuẩn bị hai lá Lẻ bạn. Một lá để trong tối, một lá để ngoài sáng. Sau 2 giờ, dùng kim mũi giáo lột nhanh vài mảnh biểu bì mặt dưới ở cả hai lá, ngâm ngay vào một giọt phẩm nhuộm congo pha trong cồn 95o trên tấm lame. - Sau 30 giây, đậy lamelle lại, quan sát trên kính hiển vi một số tế bào khí khẩu ở cả hai mặt lá. Vẽ hình trạng thái của khí khẩu ở hai mặt lá. b. Sự ảnh hưởng của một số dung dịch đến trạng thái của khí khẩu - Nhỏ một giọt KH2PO4 0,2M lên một tấm lame. Dùng kim mũi giáo lột một mảnh biểu bì của lá Lẻ bạn đặt trong giọt dung dịch này. Đậy lamelle, để cố định 5 14 phút. Quan sát dưới kính hiển vi (ở vật kính X10 và X40) trạng thái của khí khẩu.. Ghi nhận trạng thái của khí khẩu trong dung dịch KH2PO4. - Thực hiện tương tự như thí nghiệm trên, với giọt KH2PO4 thay bằng các giọt dung dịch khác lần lượt là: saccharose 0,2M và 1M. Quan sát trạng thái của khí khẩu trên kính hiển vi, ghi nhận trạng thái của khí khẩu trong những dung dịch đó. - Nhỏ 1-2 giọt glycerin 5% lên lame. Lột nhẹ một mảnh biểu bì dưới của lá Lẻ bạn đã đặt trong tối một ngày. Đậy lamelle, quan sát ngay trên kính hiển vi trạng thái đóng của khí khẩu. Sau đó, để cố định từ 5-10 phút, glycerin sẽ xâm nhập vào màng tế bào và tế bào chất là nồng độ dịch nguyên sinh cao hơn so với môi trường. Hiện tượng phản co nguyên sinh xảy ra, khí khẩu mở trở lại. Thay dung dịch glycerin bằng nước (đặt giấy thấm ở một đầu tấm lamelle, nhỏ nước ở đầu đối diện, glycerin sẽ được đẩy ra và thấm sạch vào tấm giấy thấm), khí khẩu mở rộng hơn so với thí nghiệm lúc đầu. Ghi nhận kết quả. 4 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Sử dụng các tấm giấy tẩm CoCl2 có kích thước bằng nhau, dán ở hai mặt lá cân xứng, tránh làm tổn thương lá. - Xác định số khí khẩu trên bề mặt lá ở 3 thị trường sau đó lấy giá trị trung bình 5 - TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM 5.1. Xác định tốc độ thoát hơi nước tương đối của lá Xác định số khí khẩu trên hai bề mặt của lá ở các cây thí nghiệm. Diện tích lá được xác định bằng giấy kẻ milimet. Các số liệu thu được trình bày theo bảng sau: Tên cây Thời gian đổi màu giấy CoCl2 (phút) Diện tích lá (dm2) Số khí khẩu Mặt dưới Mặt trên Mặt dưới Mặt trên Thị trường Toàn lá Thị trường Toàn lá Nhận xét về các kết quả thu được. 5.2. Sự cử động của khí khẩu - Vẽ hình trạng thái của khí khẩu ở lá đặt trong tối và ngoài sáng khi cố định bằng alcol. So sánh độ mở khẩu của lá trong hai trường hợp? - Ghi nhận trạng thái của khí khẩu trong các dung dịch KH2PO4 0,2M, saccharose 0,2M và 1M, glycerin 5%, và trong nước. Giải thích kết quả? 15 BÀI 3 DINH DƯỠNG KHOÁNG Ở THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC Sự tích tụ ion khoáng ở tế bào thực vật là một quá trình chủ động kiểm soát bởi màng nguyên sinh và màng không bào. Một số nguyên tố khoáng như Cl- và K+ có thể được tích tụ bên trong không bào đến những nồng độ cao hơn môi trường. Quá trình này cần năng lượng do hô hấp cung cấp, do đó, mọi yếu tố ức chế sự hô hấp hiếu khí như nhiệt độ thấp, sự thiếu oxy, các chất ức chế đều ảnh hưởng đến sự hấp thu chủ động và tích tụ khoáng ở thực vật. Nguyên tố khoáng Cl- là một trong những ion thường được tích tụ, nhất là ở các loại thực vật thuỷ sinh. Hàm lượng Cl- trong cơ thể thực vật thường được định lượng dựa vào phản ứng tạo kết tủa AgCl với AgNO3 dùng K2CrO4 làm chỉ thị, do sự xuất hiện màu nâu đỏ của Ag2CrO4 khi tất cả AgCl đã kết tủa. So sánh nồng độ Cl- trong mô thực vật và trong môi trường sống của chúng cho thấy khả năng tích tụ Cl-, trong điều kiện sống bình thường hay trong điều kiện hô hấp bị ức chế. 2 – NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1. Nguyên liệu - Lô 1: Cây thuỷ sinh Hydrilla được nuôi trong hồ, được chiếu sáng - Lô 2: Cây thuỷ sinh Hydrilla được ngâm trong trong nước hồ đun sôi để nguội và đậy lại trong vòng 48 giờ. 2.2 - Hoá chất - Dung dịch NaCl chuẩn (0,2 mg Cl/ml) - AgNO3 0,02N - K2CrO4 5% 2.3 – Dụng cụ Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành: STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Buret 25ml Cái 1 2 Cối chày sứ Bộ 1 3 Bình tam giác 250ml cái 6 16 STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 4 Becher 100ml Cái 2 5 Máy ly tâm Cái 1 6 Vải lọc tấm 1 7 Bình định mức 50ml Cái 1 8 Cân kỹ thuật Cái 1 9 Ống đong 10ml Cái 1 10 Pipette 10ml Cái 1 11 Bình tia Cái 1 3 - TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Xác định hàm lượng Cl- trong thực vật - Hút 10ml dung dịch NaCl chuẩn vào bình định mức 50ml, pha loãng thành 50ml với nước. Thêm vào 3 giọt K2CrO4 5%. Định phân bằng dung dịch AgNO3 0,02N cho đến khi thấy xuất hiện màu nâu đỏ nhạt và bền. Xác định thể tích V ml AgNO3 đã dùng. - Vớt cây thuỷ sinh Hydrilla, để ráo nước. Cân 5g, giã nát trong cối xứ. Dùng vải lọc vắt lấy nước cốt (có thể xem là dịch tế bào) cho vào cốc thuỷ tinh 100ml. Hút 1ml dịch chiết này cho vào ống đong để pha loãng thành 10ml rồi phân đều vào 2 ống ly tâm. Thực hiện tương tự như vậy đối với 5g cây thuỷ sinh ngâm trong nước hồ đun sôi để nguội. - Ly tâm các ống chứa dịch chiết ở tốc độ 3000 vòng/phút, trong 10 phút. Lấy phần dịch trong bên trên ở hai ống ly tâm cho vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch. - Lắc đều dịch trong bình định mức, dùng pipette hút 25ml dịch cây thuỷ sinh ở lô 1, thêm 25ml nước cất và 3 giọt K2CrO4 5%, định phân bằng dung dịch AgNO3 0,02N. Xác định thể tích (V1) ml AgNO3 sử dụng. Lập lại thí nghiệm tương tự với dịch chiết cây thuỷ sinh ở lô 2. Xác định thể tích (V2) ml AgNO3 sử dụng. - Định lượng Cl- trong 50ml (không pha loãng) nước hồ của lô 1. Xác định thể tích (V’1) ml AgNO3 sử dụng. Tương tự, định lượng hàm lượng Cl- trong 50ml nước ngâm của lô 2, xác định thể tích (V’2) ml AgNO3 sử dụng. 4 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Khi ly tâm, các ng ly tâm phải đặt đối xứng, thể tích và khối lượng ở các ống bằng nhau 5 - TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM - Xác định số mg Cl- tương ứng với 1 ml dung dịch AgNO3 0,02N. 17 - Xác định số mg Cl- trong 1 ml dịch chiết tế bào ở lô 1 và lô 2. - Xác định số mg Cl- trong 1 ml nước ở lô 1 và lô 2. - Xác định tỷ lệ súc tích (ở 2 lô thí nghiệm): mg Cl- trong 1 ml dịch tế bào mg Cl- trong 1 ml nước môi trường - Nhận xét về kết quả thí nghiệm, ghi nhận các kết quả thu được theo bảng sau: Kết quả [Cl-] mg/ml Lô 1 Lô 2 Dịch tế bào Môi trường Dịch tế bào Môi trường Tỉ lệ súc tích 18 BÀI 4 SỰ HÔ HẤP Ở THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC 1.1. Cường độ hô hấp Hô hấp là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ tạo ra các sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O, giải phóng năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể. Phương trình tổng quát của hô hấp như sau: C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O + 674 Kcal Cường độ hô hấp của một mô thực vật có thể tính bằng lượng CO2 thải ra hay lượng oxy hấp thu bởi đơn vị trọng lượng thực vật trong đơn vị thời gian. Trong bài thực hành này, cường độ hô hấp được đo bằng lượng CO2 được thải ra theo nguyên tắc: Một luồng không khí không có CO2 đi qua một bình chứa mô thực vật (không quang hợp). Ra khỏi bình này, luồng không khí mang theo CO2 thải ra do sự hô hấp của mô. Khí chứa CO2 được dẫn vào một thể tích xác định dung dịch baryt. CO2 trong dung dịch được chuyển thành H2CO3, trung hoà một phần của dung dịch baryt này. Định phân lượng baryt còn thừa chưa bị trung hoà, bằng một acid thích hợp (thường dùng acid oxalic) ta có thể xác định được lượng baryt đã bị trung hoà bởi CO2, từ đó suy ra lượng CO2 đã được dẫn vào dung dịch. H2CO3 + Ba(OH)2  BaCO3 + 2H2O (COOH)2 + Ba(OH)2  Ba (COO)2 + 2H2O Ngậm 2 phân tử nước, acid oxalic có trọng lượng phân tử là 126, còn CO2 có trọng lượng phân tử là 44. Như vậy, 126 g acid oxalic tương ứng với 44g CO2 hay 126/44 = 2,86 g acid oxalic tương ứng với 1 g CO2. Nếu một dung dịch acid oxalic chứa 2,86 g/l thì 1 ml của dung dịch này tương ứng với 1 mg CO2. Nếu dùng V ml acid oxalic có nng độ trên để trung hoà một lượng xác định x ml dung dịch baryt chưa nhận CO2. Cũng x ml dung dịch baryt này, sau khi thu nhận CO2 hô hấp chỉ còn cần v ml acid oxalic để được trung hoà. Hiệu số (V-v) tương ứng với số mg CO2 hô hấp. 1.2. Hệ số hô hấp Trong quá trình hô hấp, bên cạnh lượng CO2 thải ra, có một lượng O2 được mô thực vật hấp thu. Tỉ số giữa lượng O2 hấp thu và CO2 thải là chính là hệ số hô hấp của mô thực vật đó. Hệ số hô hấp = Thể tích CO2 thải ra/ Thể tích O2 hấp thu Hệ số hô hấp được xem như một chỉ thị về bản chất của cơ chất đang được oxy hoá. Nếu cơ chất là glucid thì hệ số hô hấp tương đương 1, nếu cơ chất là một acid béo, hệ số hô hấp nhỏ hơn 1. 2 – NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 19 2.1. Nguyên liệu Hạt đậu hoặc lúa nảy mầm 2.2 - Hoá chất - Dung dịch acid oxalic (2,86g/l) - Dung dịch Ba(OH)2 (4g/l) - Dung dịch KOH 20% - Phenolphtalein 1% - NaOH 10N 2.3 – Dụng cụ Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành: STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Bộ dụng cụ đo hô hấp Bộ 1 2 Buret 25ml Cái 1 3 Pipette 20ml Cái 1 4 Bình tam giác 250ml Cái 3 5 Ống nhỏ giọt Cái 1 6 Bình tam giác nhánh 250ml Cái 1 7 Ống thuỷ tinh chia vạch hình chữ L Cái 1 8 Becher 100ml Cái 2 9 Kẹp Cái 1 10 Bình tia Cái 1 3 - TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1. Xác định cường độ hô hấp của mô thực vật - Bố trí bộ bình đo cường độ hô hấp như sau: + Bình 1: chứa KOH 20% (1/2 bình) + Bình 2: Chứa dung dịch baryt (1/2 bình) + Bình 3: Chứa mô thực vật thí nghiệm (hạt đậu nảy mầm) + Bình 4: Chứa 20ml dung dịch baryt + Bình 5: Chứa 20ml dung dịch baryt 20 Hình . Sơ đồ bố trí các bình thí nghiệm đo cường độ hô hấp - Cho KOH vào ½ bình 1; dung dịch baryt vào ½ bình 2; 20 hạt đậu nảy mầm vào bình 3. Nối các bình 1, 2, 3 lại với nhau. Nút đậy và các điểm nối phải thật chặt và kín. Cho dòng khí đi qua các bình bằng một máy sục khí nối ở đầu vào bình 1 trong 5 phút. Nếu là máy hút khí thì nối đầu hút của máy vào đầu bình 3. Điều chỉnh vận tốc dòng khí qua các bình với tốc độ 1 bọt khí/giây đều ở hai bình 1 và 2. - Dùng pipette hút 20ml dung dịch baryt cho vào bình 4 và 20ml cho vào bình 5, đậy chặt nút lại. Đầu ống thuỷ tinh dẫn khí vào phải ngập trong dung dịch 1-2 cm, nếu không có thể thêm vào bình mọt ít nước cất để đạt được điều này. Nối bình 4 và 5 lại với nhau. Dùng kẹp tạm chặc dòng khí, nối đầu bình 4 vào bình 3,kiểm tra lại các mối nối và nút đậy đã thật kín, mở kẹp cho dòng khí đi qua toàn bộ hệ thống. Xác định thời điểm to bắt đầu thí nghiệm. Nếu hệ thống kín, vận tốc sủi bọt ở các bình 1, 2, 3, 4, 5 là bằng nhau, với tốc độ 1 bọt khí/giây. Nếu bơm nối vào hệ thống là bơm hút khí thì đầu hút của bơm sẽ được nối vào đầu bình 5. - Để hệ thống hoạt động động trong 90 phút. Khi ngưng hoạt động, tháo ống nối với máy bơm, sau đó tắt máy bơm. Tháo rời các bình 3, 4, 5. Mở nút bình 4, dùng bình tia xịt nước rửa đầu ống thuỷ tinh dài, nước rửa dồn vào bình 4. Thêm 1-2 giọt phenolphtalein. Định phân bằng acid oxalic đến khi dung dịch mất màu. Ghi nhận thể tích V’ ml acid oxalic. - Thực hiện tương tự cho bình 5. Xác định thể tích V’’ acid oxalic cần để định phân. - Trong thời gian hệ thống hoạt động, định phân 20ml dung dịch baryt bằng acid oxalic với sự hiện diện của phenolphtalein cho đến khi dung dịch mất màu. Xác định thể tích V acid oxalic cần để trung hoà baryt. - Sau thí nghiệm, cân trọng lượng của 20 hạt đậu nảy mầm trong bình 3. Nếu hạt ướt, có thể thấm ráo nước trước khi cân. 3.2. Xác định hệ số hô hấp - Bố trí hệ thống thí nghiệm như hình sau: 21 Hình . Sơ đồ bố trí dụng cụ thí nghiệm xác định hệ số hô hấp - Cho vào bình A 15g hạt đậu nảy mầm, đậy kính miệng bình. Ống buret B chứa sẵn một lượng lớn hơn 10ml NaOH 10N. Đầu ống C nhúng vào nước màu chứa trong becher D. Giữ cố định hệ thống trong vòng 2 giờ. Thời gian này có thể lâu hay màu tuỳ theo vận tốc hô hấp của hạt, số lượng hạt. Sau thời gian này, ghi mực nước (a) dâng lên trong ống C bằng bút lông dầu và đo độ cao Da (mm) tính từ mặt nước trong becher D. Khoảng cách này có thể rất nhỏ. - Mở nhẹ nhàng buret B để cho một lượng chính xác 10ml NaOH 10N vào bình A, tránh làm nóng bình bởi nhiệt của bàn tay. NaOH 10N lập tức hút CO2 trong hệ thống, kéo mực nước trong ống C lên cao. Khi mực nước này đã ngừng, ghi mực nước (b) dâng lên trong ống C, đo độ cao Db (mm) tính từ mặt nước trong becher D. - Tháo ống C ra khỏi bình A. Đo thể tích nước trong ống C từ đầu dưới tới mực a (Va) và thể tích tới mực b (Vb). 4 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý - Đầu nối giữa các ống ở bộ dụng cụ đo cường độ hô hấp phải thật kín. - Nút cao su của các bình thí nghiệm phải được đậy thật chặt, có thể bôi vaselin để tăng độ kín. - Phải thấm khô hạt trong bình 3 trước khi cân xác định khối lượng. - Ống C trong phần đo hệ số hô hấp có thể dùng 1 pipette ml có chia độ. 22 - Khi cho NaOH 10N vào bình A, không được để cho không khí lọt vào. Vì vậy, lượng NaOH 10N ở buret B phải nhiều hơn 10ml. Phải làm liên tục cột NaOH 10N trong buret B trước khi cắm vào bình A. 5 - TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM 5.1. Xác định cường độ hô hấp Dựa vào V, V’, V’’ và thời gian thí nghiệm là 90 phút. Tính cường độ hô hấp của mô thực vật thí nghiệm (mg CO2/g trọng lượng tươi/giờ). 5.2. Xác định hệ số hô hấp Khi cơ quan thực vật trong bình A hô hấp, O2 được hấp thu và CO2 được thải ra. Nếu trong thời gian này, lượng O2 hấp thu nhiều hơn lượng CO2 thải ra, khí trong hệ thống giảm một thể tích bằng sai biệt thể tích O2 hấp thu vượt hơn thể tích CO2 thải ra. Sai biệt này được thể hiện bởi trị số Va của nước dâng lên trong ống. Nếu [O2]=[CO2], thể tích của hệ thống không đổi, mực nước lúc khởi đầu thí nghiệm trong ống C không đổi. Khi NaOH được cho vào bình A, tất cả CO2 mà hô hấp của hạt thải ra được hấp thu, tình trạng giống như là trong thời gian thí nghiệm, hạt chỉ hấp thu O2 (làm giảm áp suất khí trong hệ thống) mà không hề có CO2 thả ra. Vậy Vb là một số đo thể tích O2 đã được hấp thu. Như vậy, thể tích CO2 thải ra bằng Vb-Va. Trong thí nghiệm này, xem như hàm lượng CO2 tự nhiên trong khí quyển (0,03%) của hệ thống không đáng kể. Tuy nhiên, trước khi tính kết quả cần phải điều chỉnh Va và Vb đến giá trị mà chung phải có nếu khí bên trong hệ thóng được giữ ở áp suất khí quyển. Do thể tích tỷ lệ nghịch với áp suất, nếu thể tích khí tổng cộng trong bình là Vt thì: Vt * (áp suất trong bình/áp suất khí quyển) sẽ cho ta thể tích này ở áp suất khí quyển. Áp suất trong bình khi đọc Va chính lá áp suất khí quyển trừ đi áp suất cột nước Da, gọi là Pa (=Da mm/13mm Hg). Vậy áp suất trong bình lúc này là 760 – Pa. Thể tích tổng cộng trong bình khi đọc Va là Vt-Va. Thể tích này ở áp suất khí quyển sẽ là: V= 760 )760)(( PaVaVt  Vậy Va’ (thay đổi thể tích ròng của hệ thống) thể hiện [O2]-[CO2]: Va’= Vt-V Và Vb’ (thể tích thật của O2 hấp thu cũng được tính theo cách tương tự với Vb và Pb, trong đó Pb = (Db mm/13mm Hg) Thể tích CO2 = Vb’-Va Như vậy, hệ số hô háp có thể được tính: 23 Hệ số hô hấp = ' '' Vb VaVb  BÀI 5 SỰ QUANG HỢP Ở THỰC VẬT 1 – NGUYÊN TẮC Khi lá cây được chiếu sáng, sự quang giải nước đồng thời với chuỗi chuyển điện tử quang hợp xảy ra trên màng thylakoid của lục lạp tạo NADPH: H2O  2H+ + 2e- + ½ O2 NADP+ + 2e- + 2H+  NADPH + H+ Hay H2O + NADP+  NADPH + H+ + ½ O2 Trong cặp phản ứng oxy hoá khử này, nước là chất cho điện tử và NADP+ là chất nhận điện tử. Khi chiếu sáng một dung dịch lơ lửng chưa lục lạp cô lập, phản ứng quang giải nước và chuyền điện tử cũng có thể xảy ra với điều kiện có mặt một chất nhận điện tử nhân tạo. Sự kiện này được R. Hill ghi nhận đầu tiên, do đó thường gọi là phản ứng Hill. Chất nhận điện tử (ký hiệu A) gọi là chất oxy hoá Hill: H2O + A  AH2 + ½ O2 A thường dùng trong thí nghiệm là các dạng muối sắt, benzoquynon 2,6- dichlorophenol indolphenol (DCIP). Trong bài thực hành này, lục lạp cô lập từ lá cây tươi sẽ được dùng để thí nghiệm phản ứng Hill với DCIP là chất oxy hoá. DCIP là một phẩm màu xanh khi ở dạng oxy hoá và không màu khi ở dạng khử (DCIPH2). H2O + DCIP (màu xanh)  DCIPH2 (không màu) + ½ O2 2 – NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1- Nguyên liệu Lá cây tươi được giữ lạnh trong nước đá 2.2 - Hoá chất - Đệm phosphate 0,1M (pH 6,5) - DCIP 2,5.10-1M - Na2S2O3 khan - NaCl 0,35M - KCN 5.10-2M 24 2.3 – Dụng cụ Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành: 25 STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Ống nghiệm 18 Cái 10 2 Bộ cối chày sứ Bộ 1 3 Phễu thuỷ tinh Cái 1 4 Vải lọc Tấm 1 5 Ống đong 50ml Cái 1 6 Becher 100ml Cái 2 7 Pipette 2ml Cái 2 8 Pipette 10ml Cái 1 9 Ống nhỏ giọt Cái 2 10 Ống ly tâm Cái 4 11 Giấy nhô, Tấm 2 12 Máy quang phổ Cái 1 Tất cả dụng cụ và hoá chất cần được làm lạnh trước khi sử dụng cho thí nghiệm 3 - TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1. Ly trích lục lạp Để giữ hoạt tính của lục lạp, lục lạp cần được ly trích và bảo quản ở nhiệt độ thấp (gần 0oC) và các thí nghiệm cần được thực hiện liền ngay sau đó. - Rọc bỏ gân lá, lấy 5g phiến lá, cắt nhỏ, nghiền trong cối với 15ml NaCl 0,35M. Thêm dần dần vào cối 15 ml dung dịch này nữa. Vắt nhanh qua hai lớp vải lọc vào một becher. Chia đều chất lọc vào hai ống ly tâm. Ly tâm 3 phút ở vận tốc 200 vòng /phút (để lắng vụn tế bào và hạt tinh bột). - Gạn lấy dịch nổi vào hai ống ly tâm khác, ly tâm tiếp tục thêm 5 phút ở vận tốc 1000 vòng/ phút. - Gạn bỏ dịch nổi. Hoà cặn (có chứa lục lạp) vào 15ml dung dịch NaCl 0,35M lạnh chứa trong một ống nghiệm, đặt ống nghiệm vào một ly nước đá đập vụn, đậy kín miệng ống nghiệm bằng một tấm giấy nhôm. 3.2. Thí nghiệm phản ứng Hill Chuẩn bị lô thí nghiệm theo bảng sau: 26 Ống nghiệm 1 2 3(*) 4 5 6 Đệm phosphate (ml) 2 2 2 2 2 2 DCIP (ml) 2 2 2 2 2 2 KCN (ml) 0 2 0 0 0 0 Nước cất (ml) 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 Na2S2O4 khan (mg) 5 0 0 0 0 0 Dịch hoà lục lạp 0,2 0,2 0,2 0,2(**) 0,2(***) 0,2 Chú thích: (*)