Bài giảng Bảo quản thực phẩm vi sinh vật

phẩm của sinh vật sống để hạn chế, tiêu diệt sinh vật khác”Kiểm soát sinh học đối với sản phẩm sau thu hoạchCó từ lâu đờiThế kỷ 19: Có một số công bố của các nhà khoa họcKhoảng những năm 60: Dịch bệnh trên cây  Phát triển các sản phẩm trừ sâu sinh họcNhững năm 80: Phát triển ứng dụng vi sinh vật đối kháng đối với sản phẩm sau thu hoạchII.2. Tác nhân kiểm soát sinh họcVi sinh vật đối kháng Vi sinh vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật có hại (antagonistic microorganism)Trichoderma kháng mốc thối xám (Botrytis) ở dâu tâyPseudomonas syringae Van Hall có khả năng kháng Botrytis, Penicillium, Mucor và GeotricumCandida oleophila Montrocher kháng Botrytis, Penecillium spp.Yêu cầu của vsv đối khángBền về di truyềnHoạt động có hiệu quả ở nồng độ thấpCó khả năng kháng nhiều loại vsv gây hỏng, gây bệnhNhu cầu dinh dưỡng đơn giảnCó khả năng sống trong môi trường không thuận lợiYêu cầu của vsv đối kháng Có thể sinh trưởng trên cơ chất đơn giản trong thiết bị phản ứngKhông gây độc hại đối với vật chủ, không sinh độc tố gây hại cho ngườiBền dưới tác dụng của các chất bảo quản khác, chịu được các công đoạn xử lý hóa học và vật lýII.3. Cơ chế hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh họcVật chủ (thực phẩm)VSV gây hại, gây bệnhVSV đối khángVSV khácCơ chế hoạt độngKhả năng sinh kháng sinhCạnh tranh về dinh dưỡng và không gianKhả năng bám lên VSV có hại hoặc tác dụng trực tiếp lên chúng (ký sinh)Kích thích khả năng chống chịu VSV gây bệnh của vật chủ1. Khả năng sinh kháng sinhĐây là cơ chế hiệu quả nhấtBacillus subtilis sinh Iturin: một peptide có tính kháng nấmGramicidin S Cơ chế này thường phối hợp một số cơ chế khác theo “công nghệ rào cản” (hurdle technology)Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepaciaP.d: Penecillium digtatum gây mốc xanh lamP.i: Penecillium italicum gây mốc xanh lụcTheo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepaciaXử lý bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia với nồng độ khác nhauVSV gây bệnh Penecillium digitatumTheo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepaciaKiểm soát mốc xanh lục gây ra do Penecillium expansum bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)2. Cạnh tranh dinh dưỡng và không gianCơ chế này thường gặp ở nấm menNấm men thường cạnh tranh với VSV gây hại, ức chế sinh trưởng, nhưng không tiêu diệt chúngKhả năng ức chế hiệu quả hơn nếu nguồn dinh dưỡng khan hiếmCạnh tranh dinh dưỡng và không gianNấm men có khả năng tổng hợp màng polysaccharide  tăng khả năng bám dính lên bề mặt của rau quảVSV đối kháng sinh trưởng rất nhanh và xâm chiếm vị trí vết dập ở rau quảSự sinh trưởng và nhu cầu dinh dưỡng của vsv đối kháng làm cho một số nấm mốc không có đủ dinh dưỡng để phát triểnSự tạo thành Biofilm bởi Candida oleophilaWisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications3. Sự ký sinhPichia guilliermondii có khả năng bám dính trên sợi nấm Botrytis cinerea, tiêu diệt nấm bằng một số enzym phân hủy màng tế bàoAspergilus pullulans ở vết dập của táo có khả năng sinh tổng hợp enzym exochitinase và β-1,3-glucanaseMột số nấm men khác có khả năng giảm sự bám dính của bào tử và ngăn cản bào tử nảy mầmSự bám dính của Pichia guillemondii lên sợi nấm Botrytis cinereaWisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications4. Kích thích khả năng chống chịuMột số vsv có khả năng tương tác với vật chủ, thúc đẩy quá trình lành sẹoMột số nấm men biểu hiện tính đối kháng khi được đưa vào trước khi cấy vsv gây hại II.4. Các bước phát triển một sản phẩm kiểm soát sinh họcXác định sự nhiễm tạpThu thập các tác nhân KSSHXác định đặc tính và phân loạiĐánh giá trong PTNĐánh giá áp dụng thử nghiệmKhả năng tương thíchNhân giống hàng loạtPhối trộn định dạng sản phẩmLưu kho và phân phốiÁp dụng trên diện rộngĐánh giá sự chấp nhận sản phẩmSản phẩm cuối cùngCải thiện chủngTương tác với vùng rễNghiên cứuPhát triểnMở rộng Một số chế phẩm kiểm soát sinh học đã thương mại hóaTên chế phẩmTác nhân kiểm soát sinh họcTác nhân gây hư hỏngDạng chế phẩmỨng dụngNước sản xuấtBio-save 100Bio-save 1000Bio-save 110Pseudomonas syringae ESC-10Pseudomonas syringae ESC-11Botrytis cinerea, Penecillium spp., Mucor pyroformis, Geotrichum candidumTế bào viên nhỏ dạng lạnh đôngBảo quản quả sau thu hoạch bằng cách dội qua, nhúng, hoặc phunEcoScience Corp., USABlightBan A506Pseudomonas fluorescens A506Hỏng do đông đá, Erwinia amylovora, vi khuẩn gây nâu đỏBột pha nướcPhun vào hoa lúc mới nở hoặc trực tiếp lên quảPlan Health Technology, USAMột số bước tiếp cận nhằm ứng dụng sản phẩm KSSH trong bảo quản rau quảÁp dụng sau thu hoạchThông thường VSV đối kháng được phân lập ngay từ bề mặt rau quảSố lượng tự nhiên của VSV đối kháng thường không đủ để biểu hiện hoạt tính mạnhĐưa vào một lượng lớn VSV đối kháng đối với sản phẩm sau khi thu hoạchTăng sinh đối với VSV đối kháng đã có sẵn trên sản phẩmÁp dụng sau thu hoạchƯu điểmĐơn giản, dễ thực hiện ngay sau thu hoạch bằng cách phun, ngâm, tướiNếu đúng cách, đúng thời điểm (trước khi VSV gây bệnh xâm nhập) sẽ có hiệu quả caoÍt tốn kém hơn việc phun thuốc cả diện tích lớn, có thể dùng VSV nồng độ caoCandida oleophila, Cryptococcus albidus, Pichia membranefaciensÁp dụng sau thu hoạchGiới hạnCần đưa vào ngay lập tức sau thu hoạch trước khi VSV gây hại xâm nhậpMột số vết thương ở vỏ quả họ cam chanh có chứa tinh dầu, khó khăn hơn cho VSV đối kháng bám vàoÁp dụng sau thu hoạchGiới hạnHiệu quả của VSV đối kháng tương đối hẹpPhụ thuộc loại rau quảPhụ thuộc vào hoạt tính đặc hiệu đối với VSV gây bệnhKhả năng bám dính của VSV đối kháng lên bề mặt là khác nhau đối với những sản phẩm sau thu hoạch khác nhauÁp dụng trước khi thu hoạchPhun định kỳ vào cây trước khi thu hoạchGiới hạn Có thể ảnh hưởng môi trườngVSV đối kháng bị tiếp xúc và biểu hiện hoạt tính trong điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, VSV khác, các thuốc diệt sâu bọ,)Biện pháp:Lựa chọn VSV có khả năng thích nghi tốtCho VSV làm quen, thích nghi với một số stress trước khi ứng dụngDùng những chủng biến đổiCác loại hạt lạc, đậu đỗ: Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh độc tố aphlatoxin để cạnh tranh với những chủng hoang dã sinh độc tốThường ít ứng dụng đối với rau quả tươiII. Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩmII.1. Kiểm soát sinh học (biocontrol)II.2. Tác nhân kiểm soát sinh họcVi sinh vật đối khángII.3. Cơ chế hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh họcII.4. Các bước phát triển một sản phẩm kiểm soát sinh họcII.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo quản thực phẩmII.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo quản thực phẩmVi khuẩn lactic làm hư hỏng thực phẩm hay bảo quản thực phẩm?Giới thiệu chungVi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm chua sữa1873: J. Lister thu nhận Bacterium lactis (nay có thể là Lactococcus lactis)1919: Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa theo đặc điểmHình thái (cầu, que, )Kiểu lên men glucoza: đồng hình, dị hìnhNhiệt độ sinh trưởngKhả năng sử dụng các loại đườngII.5.1. Đặc điểm chung của VK lacticVi khuẩn G+Không sinh bào tử (còn tranh cãi, Sporolactobacillus)Catalase –Yếm khí tùy tiệnChịu được axitLên men đường tạo thành chủ yếu là axit lacticVi khuẩn lactic thường sống ở nơi có môi trường dinh dưỡng dồi dào (thực phẩm), có một số sống trong cơ thể động vậtCác đặc điểm phân loại của vi khuẩn lacticĐặc điểmHình queHình cầuCarnob.Lactob.Aeroc.Enteroc.LactocVagocLeuconOenoc.Pedioc.Streptoc.Tetragenoc.Weissella Tạo tứ cầu--+---+-+-Sinh CO2 từ glucoza-±---+---+Sinh trưởng ở 10oC+±++++±-++Sinh trưởng ở 45oC-±-+--±±--Chịu muối 6,5%ND±++-±±-+±Chịu muối 18%--------+-Sinh trưởng pH4,4ND±-+±±+--±Sinh trưởng pH9,6--++----+-Axit lacticLD, L, DLLLLDD, DLLLD,D LII.5.2. Cơ chế tác dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm Cạnh tranh không gian Cạnh tranh dinh dưỡng Sinh ra một số chất kháng vi sinh vật Cạnh tranh không gianNhiều loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh trên bề mặtBản chất chất này chưa được nghiên cứu nhiềuChất hoạt động bề mặt (surlactin), glycoprotein, glycolipidCác chất kháng VSV từ vi khuẩn lactic Axit hữu cơ H2O2 CO2 Diacetyl Các chất phân tử lượng thấp BacteriocinYếu tố ảnh hưởng đến tác dụng của axit hữu cơTrong thực tế thường ứng dụng trong thực phẩm_ hệ phức tạp các chất hữu cơCác chất trong thực phẩm ảnh hưởng đến khả năng kháng VSV của vi khuẩn lacticCao nấm men làm giảm khả năng kháng khuẩn của vk lactic và axeticSữa và máu tăng cường khả năng kháng khuẩn của axit axeticH2O2Vi khuẩn lactic khi có O2 chuyển thành H2O2 dưới tác dụng của oxidases, NADH oxidases có chứa flavoprotein và superoxide dismutaseMột lý do nào đó lactic không sinh catalase để phân hủy H2O2 hoặc hệ phân hủy yếu hơn hệ sinh raThực tế theo một số nhà nghiên cứu H2O2 không tích tụ lại nhiều in vivo, thường bị phân hủy nhanh chóngCơ chế tác dụng của H2O2Tính kháng khuẩn dựa vào khả năng oxy hóa các đại phân tử của H2O2 khi bị phân hủyProtein hoặc lipid ở phía vỏ tế bào bị ôxy hóaMột số phản ứng xảy ra đối với vi khuẩn lactic để tạo H2O2 lấy hết oxy, tạo môi trường yếm khí, không có lợi cho một số vsvVi khuẩn lactic sinh H2O2 có mặt ở đường tiết niệu, đóng vai trò quan trọng trong việc tránh viêm nhiễmTrong tự nhiên, tác dụng kháng khuẩn của H2O2 được tăng lên do lactoperoxidase và thiocyanate (SCN-).SCN- + H2O2 OSCN- + H2O lactoperoxidaseCấu trúc màng tế bào vsv bị thay đổi khi tiếp xúc với OSCN-Hiệu quả chủ yếu do chu trình glycolysis bị chặn do các enzym bị ảnh hưởngTác dụng nhanh đối với VK G-, lâu hơn đối với G+H2O2CO2Tạo môi trường yếm khí, ức chế một số vi khuẩnQuá trình decarboxyl hóa bị ức chếTích tụ CO2 ở màng lipid của tế bào làm vô hoạt sự thẩm thấu của các chât qua thành tế bàoVi khuẩn G- nhạy cảm hơn vi khuẩn G+ Tác dụng của DiacetylDiacetyl kháng vi sinh vật tốt hơn khi pH 100 mg/l2-Pyrrolidone-5-carboxylic AcidTìm thấy ở Lactobacillus casei ssp. casei, Lb. casei ssp.pseudoplantarum và Streptococcus bovisBền nhiệt (121oC, 20 phút), giảm hoạt tính khi pH tăng trên 2,5BacteriocinHợp chất sinh tổng hợp tại ribosomeBản chất Protein Ức chế các vi khuẩn khácCó mặt ở hầu hết các vi khuẩnPhổ ức chế tương đối hẹp: Nhược điểmƯu điểm: Tiêu diệt có chọn lọc vi sinh vật đặc hiệu mà không ảnh hưởng đến hệ sinh vật có íchBacteriocin và kháng sinhĐặc điểmBacteriocinKháng sinhỨng dụngThực phẩmY dượcSinh tổng hợpRibosomeSP trao đổi chất bậc haiHoạt độPhổ hẹpPhổ khác nhauMiễn dịch của sinh vật chủCóKhôngCơ chế thích nghi của vsv đích Sự thích nghi của màng tế bàoCó thể biến đổi về mặt di truyền ở vị trí tác dụngCơ chế tác dụngThường tạo lỗ ở màng tế bàoMàng tế bào hoặc nội bàoPhản ứng phụChưa có báo cáoCóTác dụng của Pediocin AcH lên Listeria monocytogenesEnnahar et al. (1996). Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92 isolated from cheese. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12) 4381-4387Sau 30 phút xử lý với PediocinSau 5 giờ xử lý với PediocinL. monocytogenes chưa xử lý